Summary
De generatie van uitgelijnde myocardiale weefsel is een belangrijke voorwaarde voor het aanpassen van de recente ontwikkelingen in de stamcel biologie om klinisch bruikbare doeleinden. Hierin beschrijven we een microcontact afdrukken benadering voor de nauwkeurige controle van cellulaire vorm en functie. Met behulp van zeer zuivere populaties van embryonale stamcellen afgeleid cardiale voorlopercellen, we dan het genereren van anisotrope functionele myocardium.
Abstract
Geavanceerde hartfalen is een belangrijke onvervulde klinische uitdaging, die voortvloeien uit het verlies van levensvatbare en / of volledig functionele hartspiercellen. Ondanks optimale medicamenteuze therapie, hartfalen is een belangrijke oorzaak van mortaliteit en morbiditeit in de ontwikkelde wereld. Een belangrijke uitdaging in de ontwikkeling van geneesmiddelen is de identificatie van cellulaire assays die nauwkeurig recapituleren normale en zieke menselijke hartspier fysiologie in vitro. Ook de grote uitdagingen in de regeneratieve cardiale biologie draaien rond de identificatie en isolatie van patiënt-specifieke cardiale voorlopercellen in klinisch relevante hoeveelheden. Deze cellen moeten vervolgens worden samengevoegd tot functioneel weefsel dat lijkt op het oorspronkelijke hartweefsel architectuur. Microcontact afdrukken het mogelijk maakt van nauwkeurige micropatterned eiwit vormen die lijken structurele organisatie van het hart, waardoor geometrische signalen om celhechting ruimtelijk controleren. Hierinbeschrijven we onze aanpak voor de isolatie van sterk gezuiverde myocardiale cellen van pluripotente stamcellen differentiëren in vitro, het genereren van celgroei oppervlakken micropatterned met extracellulaire matrix eiwitten en de montage van de stamcel-afgeleide hartspiercellen in anisotrope myocardium.
Introduction
Ondanks de recente vooruitgang in de medische therapie, geavanceerde hartfalen blijft een belangrijke oorzaak van mortaliteit en morbiditeit in de ontwikkelde wereld. De klinische komt voort uit het verlies van functionele myocardiaal weefsel en vervolgens een onvermogen van het hart om niet de metabolische behoeften van getroffen individuen voldoen. Aangezien het hart heeft een beperkte regeneratievermogen, autologe harttransplantatie is de enige huidige klinisch geaccepteerde therapie direct gericht op het aanvullen van verloren functioneel hartweefsel. Belangrijke nadelen van harttransplantatie, waaronder een beperkt aantal donorharten en de noodzaak van langdurige immunosuppressieve therapie, het wijdverbreide gebruik van deze therapie voorkomen. Dientengevolge heeft de medische therapie de steunpilaar van behandeling voor patiënten met hartziekte. Een belangrijke uitdaging in de ontwikkeling van geneesmiddelen is de identificatie van cellulaire assays die nauwkeurig normale en zieke myocard fysiologie vatten in vitro.
De recente convergentie van stamcel biologie en tissue engineering technologie roept nieuwe veelbelovende perspectieven voor cardiale regeneratie. Het genereren van functionele myocardweefsel uit een hernieuwbare patiënt-specifieke bron zou een belangrijke stap vooruit in het veld. Dit zou het mogelijk maken de ontwikkeling van de ziekte-specifieke cellulaire assays voor de ontwikkeling van geneesmiddelen en ontdekking en zou de basis voor cardiale regeneratieve geneeskunde te leggen. Menselijke embryonale stamcellen (ES)-cellen en, nog belangrijker, de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen vormen een potentieel hernieuwbare patiënt-specifieke bron van ventriculaire progenitor cellen en volwassen ventriculaire myocyten. De combinatie van stamcelbiologie en tissue engineering strategieën lost dit probleem door het genereren van functionele hartweefsel in vitro kan worden gebruikt bij de ontwikkeling van cellulaire assays voor drug discovery of cardiale regeneratieve benaderingen voor de behandeling van hartfalen.
_content "> Een centrale uitdaging van de cardiale regeneratie is de identificatie van een optimale celtype. Een breed scala aan cellen zijn een bestudeerd, echter tot op heden, hoewel er verschillende multipotente cardiogene voorlopers uit verschillende bronnen zijn ontdekt, de identificatie van een cel bron die kritische eisen zoals betrokkenheid bij de myogene lot van de cel komt, is handhaving van het vermogen om in vivo of in vitro en samenstelling expanderen tot een functionele myocardweefsel bewezen een centraal probleem 2. We hebben eerder een dubbel transgene muizen beschreven waarmee de isolatie van sterk gezuiverde populaties betrokken ventriculaire voorlopers (CVP) uit ES-cellen differentiëren in vitro. We genereerden a novel dubbel transgene muis die de rode DsRed fluorescent eiwit tot expressie brengt onder de controle van een Isl1-afhankelijke enhancer van het gen en MEF2c het versterkt groen fluorescent eiwit onder de controle vande hart-specifieke enhancer Nkx2.5. Op basis van deze twee kleuren fluorescerende reporter systeem, eerste en tweede hart gebied voorlopercellen uit ontwikkelingslanden ES cellen kunnen worden geïsoleerd door middel van fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) volgens hun expressie van Nkx2.5 MEF2c en genen. CVP lijken hartmyocyten gebaseerd op de expressiepatronen van myocardiale markers en structurele en functionele eigenschappen 3, wat biedt veelbelovend voor hartweefsel regeneratieve doeleinden.Hoewel er veel vooruitgang op het gebied van tissue engineering, het nabootsen van inheemse cellulaire architectuur blijft een belangrijke uitdaging. Conventionele methoden om deze uitdaging zijn zaaien biologische of synthetische scaffolds met cellen in vitro. Door een aantal nadelen van steigers, waaronder een snelle afbraak beperkte fysische en mechanische stabiliteit en lage celdichtheid 1,4,5, hebben we geprobeerd scaffold-less weefselingenieur. Although hartcellen hun lokale micro wijzigen door de uitscheiding van extracellulaire matrix eiwitten, hebben een beperkte capaciteit om zich te organiseren om staafvormige hartmyocyten in afwezigheid van extracellulaire signalen. Aldus wordt een sjabloon dat cellen geschikte ruimtelijke en biologische aanwijzingen functioneel hartspierweefsel samenstellen biedt vereist. Microcontact afdrukken lost dit probleem op een eenvoudige en goedkope techniek om nauwkeurig celvorm, organisatie en functie 6-8, die allemaal essentieel voor het genereren van functionele lijn myocardium. Het omvat het gebruik van microtextured polydimethylsiloxaan (PDMS) stempels feature variërend tot 2 urn 9 dat de afzetting van extracellulaire matrix eiwitten toestaat op PDMS substraten in nauwkeurige patronen en aldus celadhesie ruimtelijk beïnvloeden.
Hierin stellen we voor om weefsel bio-ingenieur technologie te combineren met steel cell biologie tot anisotrope functionele myocardweefsel te genereren. Daarom tonen we hier onze onlangs benadering voor: (1) het genereren van micropatterned eiwitoppervlakken on PDMS substraten microcontact afdrukken voor het genereren van een sjabloon voor uitgelijnd myocardweefsel, (2) de isolatie van sterk gezuiverde cardiale voorlopercellen uit ES cellen differentiëren in vitro, en (3) de combinatie van beide technieken te genereren uitgelijnd functionele myocardium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Het protocol bij uitgelijnde functionele myocardweefsel genereren kan worden onderverdeeld in drie grote delen. De fabricage van de micropatterned meester met behulp van zachte lithografie technieken wordt niet beschouwd als een deel van het volgende protocol, maar kan worden gemaakt op basis van vaste methode 6.
1. Microcontact afdrukken van fibronectine op PDMS Substraten
- Meng Sylgard 184 (Dow Corning) PDMS elastomeer op een 10:1 basis om verharder verhouding en ontgas de montage met behulp van een exsiccator om eventuele luchtbellen te verwijderen.
- Cure PDMS opzichte van een vooraf vervaardigd master met 20 urn breed en 2 urn lang ribbels, gescheiden door 20 micrometer afstand voor op 2 dagen bij kamertemperatuur of 4 uur bij 65 ° C microtextured PDMS stempels worden.
* Uitharding in een exsiccator is ten zeerste aanbevolen om eventuele luchtbellen te verwijderen.
- Spin jas PDMS op glas dekglaasjes (bijv.22x22 mm) bij 5.000 rpm gedurende 2 min met een Headway spin coater om dunne gelijkmatige PDMS substraten van 15 urn dikte heeft.
- Reinig postzegels met 70% ethanol om stof en vuil te verwijderen. Laat ze drogen.
* Stamps meerdere malen kan worden gebruikt, maar vernieuwt PDMS stempels regelmatig aanbevolen vanwege een oppervlak slijtage tijd.
- Plaats stempels in een SPI Plasma-II Prep Plasma Cleaner en werkwijze voor 1 min bij 275 mTorr te maken PDMS oppervlakken hydrofiel.
* Zuurstof plasma behandeling moet worden bekeken. Langere behandelingstijd kan leiden tot scheuren van het elastomeer.
- Steriliseer postzegels met 70% ethanol gedurende 1 minuut. Droog snel met perslucht.
* Verdere stappen moeten worden uitgevoerd in een biologische veiligheidskast om de steriliteit te behouden.
- Bedek stempel oppervlakken met Fibronectin oplossing (50 ug / ml in ddH 2 O). Laten adsorberen ten minste 10 minuten.
- Schud Fibronectine oplossing van stempels en droog snel met perslucht.
- Tot stand conform contact tussen stempels en PDMS substraten voor 2 min en stevig aandrukken.
- Spoel micropatterned substraten met ddH 2 O. Opslaan in ddH 2 O maximaal 2 weken bij 4 ° C tenzij oorspronkelijk gebruikt. Bewaar PDMS stempels in ddH 2 O.
2. Onderhoud van dubbel transgene embryonale stamcellijnen
Ten eerste, de voorbereiding van de volgende media voor het kweken van muis ES cellen:
Muis embryonale Fibroblast (MEF)-Medium: Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 10% foetaal runderserum (FBS) ES cel-differentiatie of-grade, 1% penicilline-streptomycine (P / S)
Embryonale stamcel (ESC)-Medium: DMEM, 15% FBS ES cel-grade,1% niet-essentiële aminozuren (NEAA), 0,5% P / S, 0,2% leukemieremmende factor (LIF), 0,0007% 2-Mercaptoethanol (2-ME)
- Coat 6-well platen met steriele 0,1% gelatine in ddH 2 O en laat adsorberen 15 min bij 37 ° C.
- Voeg MEFs van een ontdooide aliquot van 50 ml PBS in een conische buis en centrifugeer ze op 1000 rpm gedurende 5 min. Resuspendeer MEF's in MEF-medium.
- Na adsorptie, aspiraat overtollige gelatine en voeg MEFs in de putjes. Laat MEF 1 dag tot hechten.
* Een aliquot van 10 miljoen MEFs voldoende voor 3 6-well platen.
- Wanneer MEFs hebben gehecht, voeg ES cellen uit een monster ontdooid tot 50 ml PBS in een conische buis en centrifugeer ze op 1000 rpm gedurende 5 min. Resuspendeer ES-cellen in ESC-medium en voeg ze toe aan de putjes die MEFs. Cultuur ES-cellen in ESC-medium tot samenvloeiing wordt bereikt.
* Eenmaal ES-cellen hebben bereikt samenvloeiing, is passage requvoor hot om overgroei te voorkomen en ES celkolonies handhaven.
- Bereid ES cellen voor passage. Zuig ESC-medium en een keer met steriele PBS te wassen.
- Aspireren PBS en voeg 500 ul trypsine. Process 3,5 min bij 37 ° C.
- Pipetteer de trypsine-oplossing op en neer een paar keer af te breken ES-cel kolonies en het neutraliseren met 500 pi van ESC-medium.
- Passage ES-cellen op basis van uw gewenste verhouding, bijvoorbeeld overdracht 33 ul naar een ander goed met eerder bereid MEF om de doorgang 1/30. Behoud ES-cellen in ESC-Medium.
* Een passage verhouding van 1/30 kan ES cellen confluentie bereiken binnen 3 dagen. Passage ES cellen volgens een in vitro differentiatie schema.
3. In vitro differentiatie van dubbel transgene embryonale stamcellijnen en Isolatie en zaaien van Cardiac voorouders
Ten eerste, de voorbereiding van de following media voor de in vitro differentiatie van ES cellen:
Aanpassing-Medium: Iscove's gemodificeerd Dulbecco's medium (IMDM), 15% FBS ES cel-grade, 1% NEAA, 0,5% P / S, 0,2% LIF, 0,0007% 2-ME
Differentiatie-Medium: IMDM, 15% FBS Differentiatie-grade. 1% NEAA, 0,5% P / S, 0,35% 0,1 M ascorbinezuur, 0,0007% 2-ME
- Start in vitro differentiatie als ES-cellen hebben bereikt samenvloeiing. Coat 10 cm kweekschalen met steriele 0,1% gelatine in ddH 2 O en laat adsorberen 15 min bij 37 ° C.
* Let op de duur van de in vitro differentiatie proces. Het duurt 8 dagen tot cardiale voorlopercellen geïsoleerd kunnen worden. Plan uw experimenten.
- Harvest ES cellen voor. Na adsorptie, aspiraat overtollige gelatine en voeg ongeveer 1/3-1/2 van de ES-cel suspensie bereide voedingsbodemsschotels op basis van aanpassing-medium. Kweekcellen gedurende 2 dagen.
* Kies de hoeveelheid van ES-cellen voor aanpassing op basis van uw experimenten.
- Harvest aangepast ES cellen in een 50 ml conische buis met PBS met 1. 5 ml trypsine. Centrifuge gescheiden ES cellen bij 1000 rpm gedurende 5 min en resuspendeer in deze differentiatie-medium.
- Maak embryo organen (EBS) van ongeveer 1.000 cellen per 10 ul daling van 15 cm de cultuur gerechten met een multi-channel pipet. De platen om en cultuur EB als opknoping druppels gedurende 2,5 dagen bij 37 ° C.
- Na 2,5 dagen, EB pool 6-8 15 cm kweekschalen in een met differentiatie-medium en kweken ervan nog eens 3,5 dagen bij 37 ° C.
- Na 3,5 dagen verzamelen EBS een conische 50 ml buis en laten zakken naar de bodem gedurende ongeveer 5 minuten. Zuigen het supernatant en was EVSA's met steriel PBS. Laat EVSA weer zinken naar de bodem voor ca.oximately 5 min.
- Distantiëren EVSA's door ze te verwerken met 2. 5 ml trypsine gedurende 2 minuten in een waterbad bij 37 ° C de buis zacht schudden. Voeg vervolgens 2. 5 ml steriel PBS om trypsine oplossing en het op en neer pipetteren met een pipet 10 ml serologische ongeveer 8-10 maal te breken cel clusters. Neutraliseer Trypsine met 10 ml FACS buffer die 7,5% FBS ES cel-differentiatie of-grade en 0,01% DAPI in PBS.
- Centrifugeer gedissocieerd EVSA bij 1000 rpm gedurende 5 min en resuspendeer ze in ongeveer 1 ml FACS buffer. Pipet op en neer met een 1 ml pipet ongeveer 8-10 maal te breken cel clusters.
* Voeg FACS buffer volgens het geraamde bedrag van gedissocieerde EVSA's. Te sterk geconcentreerd cellen kunnen verstoppen tijdens FACS en te laag geconcentreerde cellen kunnen FACS tijd onnodig te verlengen.
- Breng cellen naar een steriele rondbodem buis met een 35 urn celzeef te verkrijgeneen enkele celsuspensie.
- Soort gedifferentieerde ES cellen door een FACSAria Flow Cytometer en verkrijgen gezuiverd populaties CVP.
* Wij ontwikkelden een meerstaps gating strategie sterk gezuiverd gekleurde cellen te isoleren. In het kort, we eerste poort op Forward Scatter Amplitude (FSC-A) en Side Scatter Amplitude (SSC-A) (Figuur 1A). Hierdoor kunnen wij hele cellen scheiden van celresten. Vervolgens hebben we gate op FSC-A en Forward Scatter-Breedte (FSC-W) (Figuur 1B). Dit laat ons toe cel singlets te isoleren van wambuizen en andere cellulaire aggregaten. Vervolgens gate on SSC-A en Side Scatter-Breedte (SSC-W) (Figuur 1C). Dit verhoogt de helderheid van cel singlets. Vervolgens poort op DAPI kleuring om levensvatbare cellen (DAPI-negatieve) isoleren van niet-levensvatbare cellen (figuur 1D). Vervolgens poort op Phycoeryhthrin Amplitude (PE-A) en PE-cyaninekleurstof 7 Amplitude (PE-Cy7-A) om echte rode positieve (+ R verkrijgen -) cellen en aan autofluorescente rode-negatieve cellen (figuur 1E) uit te sluiten. R + en R - cellen worden vervolgens gated afzonderlijk op Fluoresceïne isothiocyanaat Amplitude (FITC-A) en PE-A om echte groene-positieve (G +) en echte groene-negatieve (G -) sorteren cellen binnen deze populaties (Figuur 1F + 1G). Dit resulteert in 4 populaties van cellen als volgt: R + G +, R + G -, R - G + en R - G - (Figuur 1H).
- Passiveren micropatterned substraten met 1% Pluronic F-127 in ddH 2 O 10 minuten. Daarna was ze 3x met steriel PBS.
* Pluronic F-127 is een surfactant die blokken celadhesie. Het ondersteunt opsluiting van celhechting aan micropatterned gebied.
- Bevestig PDMS pakkingen rond de patroon regioen druk deze stevig. Dan, zaad CVP op fibronectine micropatterned substraten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FACS-zuivering van in vitro gedifferentieerde ES cellen toonde vier verschillende populaties van voorlopers (figuur 1). De aanwezigheid van fibronectine micropatterned werd bevestigd door immunofluorescentie microscopie dat een volledige overdracht van continue fibronectine (Figuur 2) weergegeven. Uitplaten van FACS-voorlopercellen geïsoleerd op fibronectine micropatterns resulteerde in uitlijning van de R + G + en onderdeel van de R - G + populaties. Hoewel Pluronic F-127 als ondersteunende blocker van celhechting werd gebruikt, de R + G - en R - G - heeft populaties niet aan de anisotrope structuur van fibronectine en groeide in de ruimte tussen aangrenzende eiwit (Figuur 3).
Figuur 1. Represe ntative flowcytometrie grafiek van dag 6 in vitro gedifferentieerde ES-cellen. (A) Gating op Forward Scatter Amplitude (FSC-A) en Side Scatter Amplitude (SSC-A). (B) Gating op FSC-A en Forward Scatter-Breedte ( FSC-W). (C) Gating op SSC-A en Side Scatter-Breedte (SSC-W). (D) Gating op DAPI kleuring. (E) Gating voor Phycoeryhthrin (PE) en PE-cyaninekleurstof 7 (PE- Cy7) (F en G) Gating voor fluoresceïne isothiocyanaat Amplitude (FITC-A) en PE-A (H) Flow cytometry plot waaruit vier verschillende populaties voorlopercellen:.. R + G +, R + G -, R - G + en R - G -. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
fig2.jpg "alt =" Figuur 2 "/>
Figuur 2. Vertegenwoordiger immunofluorescentie microscopie van micropatterned fibronectine substraten. Schalingsbalk 80 pm.
Figuur 3. Representatieve immunofluorescentie microscopie van embryonale-(A) en ES cel afgeleide (B) FACS-voorlopercellen geïsoleerd na nog eens 5 dagen kweek op fibronectine micropatterns Nuclei, blauw;. SmMHC, rood, sarcomere α-actinine, groen. Schaal bar, 40 pm. Vertaling van Domian et al.. (2009).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol stelden we een methode om gezuiverde populaties van cardiogene progenitors isoleren en om zaad ze op micropatterned Fibronectine substraten wat hen toelaat uitlijnen en neem een cardiale myocyten-achtige staafvorm. Normale cellulaire organisatie is essentieel voor normale weefselfunctie 8,10, in het bijzonder voor myocardium. Hartmyocyten is aangetoond dat verbeterde mechanische eigenschappen en elektrofysiologische 11,12 11,13 ontwikkelen bij het vormen anisotrope cel arrays. Aangezien cardiale voorlopercellen gekweekt op substraten micropatterned Fibronectine differentiëren tot staafvormige myocardiale cellen in vitro, betekent dit apivotal stap in hartweefsel biotechnologie.
Microcontact afdrukken is een eenvoudig en goedkoop instrument dat kan worden gebruikt om 2-dimensionale templates lijkt myocardweefsel in vitro genereren. Echter, efficiënt en succesvol patroonvorming van extractieellular matrixeiwitten berust op het eiwit kritisch keuze. Dat een groot aantal verschillende eiwitten met succes gestempeld op PDMS substraten, bepaalde eiwitten, zoals collageen type I, vereisen oppervlaktemodificatie van PDMS substraten vóór microcontact afdrukken 14. Bovendien kan de hoeveelheid druk uitgeoefend op de stempel en de duur van stempelen ook grote invloed op de efficiëntie en betrouwbaarheid van het microcontact afdrukken.
Een andere belangrijke stap in dit protocol is het gebruik van een plasma reiniger om de oppervlakken van PDMS postzegels hydrofiel maken. Het is bekend dat microcontact afdrukken niet optreden onder PDMS zegels en substraten ondergaan geen zuurstofplasma behandeling 15 en diverse groepen gevonden dat het afstemmen van de bevochtiging van PDMS substraten nodig om een overdracht van eiwit mogelijk maken 3,6 , 15. We vonden echter dat het verhogen van de hydrofiliciteit van hetPDMS stempel plaats van de PDMS substraat resulteert in meer uniforme eiwit micropatterns met een hogere kwaliteit, zoals minder storend of onvolledig eiwit lijnen.
Voor de gepresenteerde protocol werd micropattern breedte van 20 urn gekozen volgens de gerapporteerde celbreedte van murine neonatale hartmyocyten 16. Evenwel de fabricage van de micropatterns worden uitgevoerd in een soort-en hart ontwikkelingsstadium afhankelijke 16-20 wijze om het tegenovergestelde effect op de cellevensvatbaarheid vanwege de beperkte ruimte te voorkomen.
De ontdekking en zuivering van ES cel afgeleide CVP, met name de R + G + bevolking, in staat stellen betrouwbare studies in hartweefsel bio-ingenieur. Met name hebben we waargenomen onze ES cel afgeleide cardiale voorlopercellen te kunnen vormen verdragsluitende myocardweefsel met behoud van hun cellulaire uitlijning. Aangezien construeren driedimensionale functioneleweefsel is een belangrijk doel op het gebied van biotechnologie weefsel kan onze gegenereerde tweedimensionale anisotrope myocardweefsel effectief worden gebruikt om meerdere lagen cel vellen, andere groepen eerder beschreven voor andere celtypen 21,22. Echter, tot op heden een beperking van de transgene reportersysteem is het resultaat van de in vitro differentiatie van embryonale stamcellen. FACS beschikbaar CVP, in het bijzonder de sterk cardiogene R + G + bevolking, momenteel goed voor een geschatte gemiddelde van 0,5% van alle gedifferentieerde cellen. Aldus verbeteren de in vitro differentiatie van ES cellen in CVP een belangrijke stap genereren van voldoende hoeveelheden CVP grotere anisotrope hartweefsel bestaande uit longitudinaal uitgelijnd myocardiale vezels versterkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd uitgevoerd in het kader van het Centrum voor Nanoscale Systems (CNS), een lid van het National Nanotechnology Infrastructure Network (NNIN), die door de National Science Foundation ondersteund onder NSF award niet. ECS-0335765. CNS is een onderdeel van de Universiteit van Harvard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Prepare 0.1M solution in ddH2O |
| Desiccator, Vacuum 10 inch | Nova-Tech International, Inc. | 55206 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| FACSAria II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum ES cell-grade | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Fetal Bovine Serum Differentiation-grade | Gemini Bio-Products | 100-500 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F4759 | Solubilize to 1 mg/ml in ddH2O |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 22x22mm | Fisher Scientific | 12-548-B | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | Prepare 0.1% solution in ddH2O |
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc. | PWM32-PS-CB15 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | Thermo Scientific | SH30228.01 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | Self-prepared from LIF-secreting cell lines | Prepare 500x stock solution | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Harvested from day 12-15 mouse embryos | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Prepare 1% solution in ddH2O |
| Round-Bottom Tube with 35 μm cell strainer | BD Biosciences | 352235 | |
| SPI Plasma-Prep II Plasma Cleaner | SPI Supplies | 11005-AB | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Vacuum Gauge | SPI Supplies | 11019-AB |
References
- Alcon, A., Cagavi Bozkulak, E., Qyang, Y. Regenerating functional heart tissue for myocardial repair. Cell Mol. Life Sci. , (2012).
- Chien, K. R., Domian, I. J., Parker, K. K. Cardiogenesis and the complex biology of regenerative cardiovascular medicine. Science. 322, 1494-1497 (2008).
- Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326, 426-429 (2009).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur. Spine J. 17, Suppl . 4. 467-479 (2008).
- Eschenhagen, T., Eder, A., Vollert, I., Hansen, A. Physiological aspects of cardiac tissue engineering. Am. J. Physiol Heart Circ Physiol. 303, H133-H143 (2012).
- Feinberg, A. W., et al. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317, 1366-1370 (2007).
- Li, F., Li, B., Wang, Q. M., Wang, J. H. Cell shape regulates collagen type I expression in human tendon fibroblasts. Cell Motil. Cytoskeleton. 65, 332-341 (2008).
- Sarkar, S., Dadhania, M., Rourke, P., Desai, T. A., Wong, J. Y. Vascular tissue engineering: microtextured scaffold templates to control organization of vascular smooth muscle cells and extracellular matrix. Acta Biomater. 1, 93-100 (2005).
- Isenberg, B. C., Wong, J. Y. Building structure into engineered tissues. Materials Today. 9, 54-60 (2006).
- Athanasiou, K. A., Zhu, C., Lanctot, D. R., Agrawal, C. M., Wang, X. Fundamentals of biomechanics in tissue engineering of bone. Tissue Eng. 6, 361-381 (2000).
- Feinberg, A. W., et al. Controlling the contractile strength of engineered cardiac muscle by hierarchal tissue architecture. Biomaterials. 33, 5732-5741 (2012).
- Black, L. D. 3rd, Meyers, J. D., Weinbaum, J. S., Shvelidze, Y. A., Tranquillo, R. T. Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via gap junction modification. Tissue Eng. Part A. 15, 3099-3108 (2009).
- Kim, D. H., et al. Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 565-570 (2010).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur. Cell Mater. 18, 1-14 (2009).
- Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. Simple approach to micropattern cells on common culture substrates by tuning substrate wettability. Tissue Eng. 10, 865-872 (2004).
- Leu, M., Ehler, E., Perriard, J. C. Characterisation of postnatal growth of the murine heart. Anat. Embryol. (Berl). 204, 217-224 (2001).
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J. Mol. Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
- Porrello, E. R., et al. Heritable pathologic cardiac hypertrophy in adulthood is preceded by neonatal cardiac growth restriction. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 296, 672-680 (2009).
- Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285, H2355-H2363 (2003).
- Ohler, A., et al. Two-photon laser scanning microscopy of the transverse-axial tubule system in ventricular cardiomyocytes from failing and non-failing human hearts. Cardiol. Res. Pract. 2009, 802373 (2009).
- Takahashi, H., Nakayama, M., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. Anisotropic cell sheets for constructing three-dimensional tissue with well-organized cell orientation. Biomaterials. 32, 8830-8838 (2011).
- Williams, C., Xie, A. W., Yamato, M., Okano, T., Wong, J. Y. Stacking of aligned cell sheets for layer-by-layer control of complex tissue structure. Biomaterials. 32, 5625-5632 (2011).
