Summary
Generering av justert hjerteinfarkt vev er en viktig forutsetning for å tilpasse de siste fremskritt i stamcelleforskningen biologi til klinisk nyttige formål. Heri vi beskrive en microcontact trykkteknikker tilnærming for presis kontroll av cellen form og funksjon. Ved hjelp av høyt rensede bestander av embryonale stamceller hentet kardiale stamceller, vi deretter generere anisotrop funksjonell hjerteinfarkt vev.
Abstract
Avansert hjertesvikt representerer et viktig udekket klinisk utfordring, som oppstår fra tap av levedyktige og / eller fullt funksjonell hjertemuskelceller. Til tross for optimal medikamentell behandling, representerer hjertesvikt en ledende årsak til dødelighet og sykelighet i den industrialiserte verden. En stor utfordring i legemiddelutvikling er identifisering av cellulære analyser som nøyaktig rekapitulere normalt og sykt menneske hjerteinfarkt fysiologi in vitro. Likeledes, de store utfordringene i regenerativ hjertestans biologi dreie seg om identifisering og isolering av pasient-spesifikke kardiale stamceller i klinisk relevante mengder. Disse cellene må da settes sammen til funksjonelle vev som ligner den opprinnelige hjertet vev arkitektur. Microcontact utskrift gir mulighet for etablering av presise micropatterned protein former som minner strukturelle organiseringen av hjertet, og dermed gi geometriske signaler for å styre celleadhesjon romlig. Herivi beskriver vår tilnærming for isolering av høyt renset myokard celler fra pluripotente stamceller differensierende in vitro, generering av cellevekst overflater micropatterned med ekstracellulære matriksproteiner, og montering av stammen celle-avledede hjertemuskelceller inn anisotrope myokardial vev.
Introduction
Til tross for nylige fremskritt innen medisinsk behandling, gjenstår avansert hjertesvikt en ledende årsak til dødelighet og sykelighet i den industrialiserte verden. Den kliniske syndromet oppstår fra et tap på funksjonell hjerteinfarkt vev og deretter en manglende evne til sviktende hjerte til å møte de metabolske kravene berørte personer. Siden hjertet har en begrenset evne til reproduksjon, er autolog hjertetransplantasjon den eneste nåværende klinisk akseptert behandling direkte rettet mot å fylle tapt funksjonelle hjerte vev. Betydelige ulemper av hjertetransplantasjon, inkludert begrenset antall donor hjerter og behovet for langsiktig immunsuppressiv behandling, utelukke store spredningen bruk av denne terapien. Som et resultat, har medisinsk behandling vært bærebjelke i behandling for pasienter med hjertesykdom. En stor utfordring i legemiddelutvikling er identifisering av cellulære analyser som nøyaktig rekapitulere normalt og sykt hjerteinfarkt fysiologi in vitro.
Den nylige konvergens av stamcelleforskningen biologi og tissue engineering teknologi reiser nye lovende muligheter for hjerte gjenfødelse. Generere funksjonell hjerteinfarkt vev fra en fornybar pasient-spesifikke kilde ville være et stort fremskritt i feltet. Dette vil tillate for utvikling av sykdom spesifikke cellulære analyser for legemiddelutvikling og oppdagelse ville legge grunnlaget for hjerte regenerativ medisin. Humane embryonale stamceller (ES-celler), og mer betydelig, menneskeskapt påvirkning pluripotent stilk (IPS) celler representerer en potensielt fornybar pasient-spesifikke kilde ventrikulære stamceller og modne ventrikulære myocytes. Kombinasjonen av stilk cellebiologi og tissue engineering strategier løser dette problemet ved å generere funksjonelle hjerte vev in vitro som kan brukes i utviklingen av cellulære analyser for medisiner eller kardiale regenerative tilnærminger for behandling av avansert hjertesvikt.
_content "> En sentral utfordring i kardial regenerering har vært identifiseringen av en optimal celletype. Et bredt utvalg av celler har blitt studert 1 imidlertid til dags dato, selv om ulike multipotent kardiogent forløpere fra ulike kilder har blitt oppdaget, identifisering av en celle kilde som oppfyller kritiske krav som forpliktelse til myogenic cellen skjebnen at vedlikeholdet av kapasiteten til å ekspandere i vivo eller in vitro, og blandingen til en funksjonell myokardisk vev vist seg å være et sentralt problem 2. Vi har tidligere beskrevet en dobbel transgene murin system som muliggjør isolering av sterkt rensede populasjoner av engasjerte ventrikulære progenitors (CVP) fra ES-celler differensierer in vitro. Vi genererte en roman dobbel transgene mus som uttrykker den røde fluorescerende protein dsRed under kontroll av en Isl1-avhengige enhancer av MEF2c genet og den forbedrede grønt fluorescerende protein under kontroll avhjertets-spesifikke Nkx2.5 enhancer. Basert på denne to-farget fluorescerende reporter system, første og andre hjerte felt progenitorer fra utviklingsland ES celler kan isoleres ved hjelp av fluorescens Aktivert Cell Sortering (FACS) i henhold til deres ekspresjon av MEF2c og Nkx2.5 gener. CVP ligner hjerte myocytes basert på uttrykket mønstre av hjerteinfarkt markører og strukturelle og funksjonelle kvaliteter 3, hva tilbyr store løftet for hjertevev regenerative formål.Selv om det har vært mange fremskritt innen tissue engineering, hermet innfødt mobilnettet arkitektur fortsatt en sentral utfordring. Konvensjonelle metoder for å løse denne utfordringen er seeding biologiske eller syntetiske stillasene med celler in vitro. Grunnet en rekke ulemper av stillas, inkludert rask nedbrytning, begrenset fysisk og mekanisk stabilitet og lav celletetthet 1,4,5, har vi forsøkt å konstruere stillas mindre vev. AltHough hjerteceller kan modifisere deres lokale mikromiljø av sekresjon av ekstracellulære matriksproteiner, de har en mer begrenset kapasitet til å organisere seg stavformede kardiale myocytes i fravær av ekstracellulære signaler. Dermed er en mal som gir celler hensiktsmessige romlige og biologiske signaler å komponere funksjonell hjerteinfarkt vev nødvendig. Microcontact utskrift løser denne utfordringen ved å tilby en enkel og rimelig metode for å nøyaktig kontroll cellen form, organisasjon og funksjon 6-8, som alle er avgjørende for generering av justert funksjonelle hjerteinfarkt vev. Det omfatter anvendelse av microtextured Polydimethylsiloxane (PDMS) frimerker med funksjonen størrelser spenner ned til 2 um 9 som aktiverer avsetting av ekstracellulære matriksproteiner bort PDMS substrater i presise mønstre og dermed å påvirke celleadhesjon romlig.
Heri, foreslår vi å kombinere vev bioteknologi teknologi med stilk cell biologi for å generere anisotrope funksjonell hjerteinfarkt vev. Følgelig, vi her vise vår nylig publiserte tilnærming for følgende: (1) generering av micropatterned protein flater på PDMS substrater etter microcontact trykkteknikker for generering av en mal for justert myokardial vev, (2) isolering av høyt renset kardiale stamfedre fra ES celler differensierende in vitro, og (3) kombinasjonen av begge teknikker for å generere funksjonelle justert myokardial vev.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen for å generere funksjonelle justert myokardial vev kan deles inn i tre hoveddeler. Fabrikasjon av micropatterned masteren bruker myke litografi teknikker er ikke en del av den følgende protokoll, men kan gjøres basert på etablert metode 6.
1. Microcontact Trykking av Fibronectin på PDMS Underlag
- Bland Sylgard 184 (Dow Corning) PDMS elastomer på en 10:01 base til herdemiddel ratio og Degas sammenstillingen ved hjelp en eksikator for å eliminere luftbobler.
- Kurere PDMS mot en tidligere fabrikkert master med 20 mikrometer bred og 2 mikrometer høye rygger, atskilt med 20 mikrometer avstand for enten 2 dager ved romtemperatur eller 4 timer ved 65 ° C for å oppnå microtextured PDMS frimerker.
* Herding i en eksikkator er sterkt anbefalt å fjerne eventuelle luftbobler.
- Spin pels PDMS på glass dekkglass (f.eks22x22 mm) ved 5000 rpm i 2 min ved hjelp av en Headway Spin Coater å produsere tynn og selv PDMS underlag av 15 mikrometer tykkelse.
- Rengjør frimerker med 70% etanol for å fjerne støv og smuss partikler. La dem lufttørke.
* Frimerker kan brukes flere ganger, men fornyer PDMS frimerker på en jevnlig basis anbefales på grunn av en overflate slitasje over tid.
- Sted frimerker i en SPI Plasma-Prep II Plasma Cleaner og prosess for 1 min ved 275 mTorr å gjengi PDMS overflater hydrofile.
* Oksygen plasma behandling bør sees. Lengre behandlingstid kan resultere i sprekkdannelser i elastomeren.
- Sterilisere frimerker med 70% etanol i 1 min. Tørker raskt med trykkluft.
* Ytterligere tiltak bør utføres i et biologisk sikkerhetskabinett for å opprettholde sterilitet.
- Dekk stemple overflater med Fibronectin oppløsning (50 mg / ml i DDH 2 O). La det adsorberes minst 10 min.
- Rist av Fibronectin løsning fra frimerker og tørke raskt med trykkluft.
- Etablere konforme kontakt mellom stempler og PDMS underlag for 2 min og press godt.
- Skyll micropatterned underlag med DDH 2 O. Oppbevar dem i DDH 2 O for maksimalt 2 uker ved 4 ° C, med mindre opprinnelig brukt. Butikken PDMS frimerker i DDH 2 O.
2. Vedlikehold av Double Transgene embryonale stamcellelinjer
Først forberede følgende medier for dyrking mus ES celler:
Mus Embryonic fibroblast (MEF)-Medium: Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), 10% fetalt bovint serum (FBS) ES celle-eller differensiering-klasse, en% Penicillin-Streptomycin (P / S)
Embryonic Stem Cell (ESC)-Medium: DMEM, 15% FBS ES cell-klasse,1% ikke-essensielle aminosyrer (NEAA), 0,5% P / S, 0,2% leukemi Inhibitorisk Factor (LIF), 0,0007% 2-Mercaptoethanol (2-ME)
- Coat 6-brønns plater med steril 0,1% gelatin i DDH 2 O og la det adsorberer 15 min ved 37 ° C.
- Legg MEFs fra en tint alikvot til 50 ml PBS i en konisk rør og sentrifuger dem på 1000 rpm i 5 min. Gjensuspender MEFs i MEF-medium.
- Etter adsorpsjon, aspirat overflødig Gelatin og legge MEFs i brønnene. Tillat MEFs 1 dag til å feste.
* En alikvot av 10 millioner MEFs suffices for 3 6-brønners plater.
- Når MEFs har festet, legge ES celler fra en tint alikvot til 50 ml PBS i en konisk rør og sentrifuger dem på 1000 rpm i 5 min. Resuspender ES celler i ESC-medium og legge dem til brønnene som inneholder MEFs. Kultur ES celler i ESC-medium til samløpet er nådd.
* Når ES celler har nådd samløpet, er passaging requIRED å unngå overvekst og å opprettholde ES celle kolonier.
- Forbered ES celler for passaging. Aspirat ESC-medium og vask en gang med sterilt PBS.
- Aspirer PBS og tilsett 500 ul Trypsin. Prosess 3,5 min ved 37 ° C.
- Pipetter Trypsin løsningen opp og ned flere ganger for å bryte ned ES cell kolonier og nøytralisere den med 500 ul ESC-medium.
- Passasje ES celler i henhold til ønsket ratio, f.eks overføring 33 ul til en annen godt med tidligere utarbeidet MEFs til passasje 1/30. Opprettholde ES celler i ESC-Medium.
* En passasje forholdet 1/30 tillater ES celler å nå konfluens innen 3 dager. Passasje ES celler i henhold til in vitro differensiering planen.
3. In vitro Differensiering av Double Transgene embryonale stamcellelinjer og isolasjon og Seeding av Cardiac stamfedre
Først forberede følgende områderng medier som kreves for in vitro differensiering av ES-celler:
Bearbeidelse-Medium: Iscoves Modifisert Dulbeccos medium (IMDM), 15% FBS ES celle-klasse, en% NEAA, 0,5% P / S, 0,2% LiF, 0,0007% 2-ME
Differensiering-Medium: IMDM, 15% FBS Differensiering-klasse. 1% NEAA, 0,5% P / S, 0,35% av 0,1 M askorbinsyre, 0,0007% 2-ME
- Start i vitro differensiering når ES celler har nådd samløpet. Coat 10 cm kultur retter med steril 0,1% gelatin i DDH 2 O og la det adsorberer 15 min ved 37 ° C.
* Vær oppmerksom på varigheten av den in vitro differensiering prosessen. Det tar 8 dager før kardiale progenitorer kan isoleres. Planlegg eksperimenter tilsvarende.
- Harvest ES celler som tidligere. Etter adsorpsjon, aspirat overflødig Gelatin og fyll omtrent 01.03 til 01.02 på ES cellesuspensjon til forberedt kulturretter som inneholder Tilpasning-medium. Kultur celler for 2 dager.
* Velg mengden ES celler for tilpasning i henhold til dine eksperimenter.
- Innhøsting tilpasset ES celler til en 50 ml konisk rør inneholdende PBS ved anvendelse av 1. 5 ml trypsin. Sentrifuger dissosierte ES celler ved 1000 opm i 5 min og resuspender dem Differensiering-medium.
- Gjør embryoid organer (EBS) på ca 1000 celler per 10 ul fall i 15 cm kultur retter med en flerkanals pipette. Invertere plater og kultur EBS som hengende dråper i 2,5 dager ved 37 ° C.
- Etter 2,5 dager, basseng EBS av 6-8 15 cm kultur retter til en bruker Differensiering-medium og kultur dem i ytterligere 3,5 dager ved 37 ° C.
- Etter 3,5 dager, samle EBS i en konisk 50 ml rør og la dem synke ned til bunnen for omkring 5 min. Suge opp supernatanten og vask EBS med sterilt PBS. La EBS synke igjen til bunnen for caoximately 5 min.
- Distansere EBS ved å behandle dem med to. 5 ml Trypsin i 2 min i et vannbad ved 37 ° C risting røret sakte. Deretter kan du legge to. 5 ml sterilt PBS til Trypsin løsning og pipetteres opp og ned med en 10 ml serologisk pipette 8-10 ganger for å bryte ned celle klynger. Nøytraliser Trypsin med 10 ml FACS buffer inneholdende 7.5% FBS ES celle-eller differensiering-klasse og 0,01% DAPI i PBS.
- Sentrifuger dissosiert EBS ved 1000 opm i 5 min og resuspender dem i ca 1 ml FACS-buffer. Pipetter opp og ned med en 1 ml pipette 8-10 ganger for å bryte ned celle klynger.
* Legg FACS buffer i henhold til det estimerte beløpet av dissosiert EBS. For høyt konsentrert celler kan tette under FACS og for lavt konsentrerte celler kan forlenge FACS tid unødvendig.
- Overføre celler til et sterilt rundbunnet rør med en 35 mikrometer celle sil for å skaffeen enkel cellesuspensjon.
- Sorter differensierte ES celler ved hjelp av en FACSAria flowcytometeret og få renset bestander av CVP.
* Vi utviklet en multi-trinn gating strategi for å isolere høyt renset fargede celler. I korte trekk, må vi først gate på Forward Scatter Amplitude (FSC-A) og sidespredning Amplitude (SSC-A) (figur 1A). Dette gir oss muligheten til å skille hele celler fra mobilnettet rusk. Vi gate på FSC-A og Forward Scatter-Bredde (FSC-W) (figur 1B). Dette gir oss muligheten til å isolere celle singlets fra dubletter og andre cellulære aggregater. Vi gate på SSC-A og sidespredning-Bredde (SSC-W) (figur 1C). Dette øker renhet celle singlets. Vi deretter gate på DAPI flekker å isolere levedyktige celler (DAPI-negativ) fra ikke-levedyktige celler (figur 1D). Vi gate på Phycoeryhthrin Amplitude (PE-A) og PE-Cyanine fargestoff 7 Amplitude (PE-Cy7-A) for å få ekte rød-positive (R + -) celler og for å utelukke autofluorescent rød-negative celler (figur 1E). R + og R - cellene er da gated separat på Fluorescein isothiocyanate Amplitude (FITC-A) og PE-A for å sortere ekte grønn-positive (G +) og ekte grønn-negative (G -) celler i disse populasjonene (figur 1F + 1G). Dette resulterer i fire populasjoner av celler som følger: R + G +, R + G -, R - G + og R - G - (figur 1H).
- Passivere micropatterned underlag med 1% Pluronic F-127 i DDH 2 O i 10 min. Deretter vaske dem 3x med sterilt PBS.
* Pluronic F-127 er et overflateaktivt middel som blokkerer celle adhesjon. Den støtter innesperring av celleadhesjon til micropatterned området.
- Fest PDMS pakninger rundt mønstrede regionenog press godt. Deretter frø CVP på fibronectin micropatterned underlag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FACS-rensing av in vitro differensierte ES celler avslørte fire distinkte populasjoner av stamfedre (figur 1). Tilstedeværelsen av micropatterned Fibronektin ble bekreftet ved immunfluorescens mikroskopi som viste en fullstendig overføring av kontinuerlige fibronektin linjer (figur 2). Plettering av FACS-isolerte progenitorer bort på fibronektin micropatterns resulterte i justeringen av R + G + og en del av R - G + populasjoner. Selv Pluronic F-127 som et støttende blocker av celleadhesjon ble brukt, R + G - og R - G - gjorde populasjoner ikke respekterer anisotropt arkitekturen av Fibronectin og vokste inn i rommet mellom tilstøtende protein linjer (fig. 3).
Figur 1. Represe ntative flowcytometri diagram av dag 6 in vitro differensierte ES celler. (A) Gating på Forward Scatter Amplitude (FSC-A) og sidespredning Amplitude (SSC-A). (B) Gating på FSC-A og Forward Scatter-Width ( FSC-W). (C) Gating på SSC-A og sidespredning-Bredde (SSC-W). (D) Gating på DAPI farging. (E) Gating for Phycoeryhthrin (PE) og PE-Cyanine fargestoff 7 (PE- Cy7) (F og G) Gating for fluorescein isothiocyanat Amplitude (FITC-A) og PE-A (H) Flowcytometri tomten avslørende fire distinkte populasjoner av stamfedre:.. R + G +, R + G -, R - G + og R - G -. Klikk her for å se større figur .
fig2.jpg "alt =" Figur 2 "/>
Figur 2. Representative immunfluorescens mikroskopi av micropatterned fibronektin underlag. Skalalinje, 80 mikrometer.
Figur 3. Representative immunfluorescens mikroskopi av embryonale-(A) og ES cell-derived (B) FACS-isolerte stamceller etter ytterligere 5 dager av kultur på fibronektin micropatterns atomkjerner, blå,. SmMHC, rød, sarcomeric α-actinin, grønn. Skala bar, 40 mikrometer. Gjengitt fra Domian et al. (2009).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen, presenterte vi en metode for å isolere rensede bestander av kardiogent forfedre og til frø dem på micropatterned fibronektin underlag hva tillater dem justere og ta en hjertestans myocyte-lignende stang form. Normal cellulær organisasjon er avgjørende for normal vev funksjon 8,10, særlig for myokardial vev. Hjertemuskelceller har vist seg å utvikle forbedret mekanisk 11,12 og elektrofysiologiske egenskapene 11,13 når danne anisotrop celle matriser. Siden kardiale stamceller dyrket på micropatterned fibronektin underlag differensieres til stavformede myokardielle celler in vitro, representerer dette apivotal skritt i hjertevev bioteknologi.
Microcontact utskrift er en enkel og rimelig verktøy som kan brukes til å generere 2-dimensjonale maler likner myokardial vev in vitro. Men, effektiv og vellykket fordelingen av extracellular matriksproteiner avhengig kritisk på protein av valget. Mens et stort utvalg av forskjellige proteiner har blitt stemplet bort PDMS substrater, visse proteiner, slik som kollagen type I, krever overflatemodifisering av PDMS substrater før microcontact trykkteknikker 14. I tillegg kan mengden av trykk som påføres på stempelet samt varigheten av stempling også stor innvirkning på effektiviteten og fidelity av microcontact trykkteknikker.
En annen viktig skritt i denne protokollen er bruken av en plasma renere å gjengi overflater PDMS frimerker hydrofile. Det er velkjent at microcontact utskrift ikke oppstå når begge PDMS frimerker og substrater ikke gjennomgår oksygen plasma behandling 15, og flere grupper funnet at tuning fuktbarhet av PDMS substrater er påkrevet for å foreta en overføring av protein mulige 3,6 , 15. Men vi fant at økende hydrofilitet avPDMS stempel istedenfor PDMS underlaget gir mer ensartet proteinkvalitet micropatterns med høyere kvalitet, slik som mindre nedbrytende eller ufullstendig protein linjer.
For den framlagte protokollen, ble micropattern bredden 20 um valgt, i henhold til de rapporterte cellebredden av murine neonatale kardiale myocytes 16. Imidlertid bør fabrikasjonen av micropatterns utføres i en art-og hjerte utviklingsstadiet-avhengig 16-20 måte for å hindre motsatt virkning på cellenes levedyktighet grunnet begrenset plass.
Oppdagelsen og rensing av ES cell-derived CVP, spesielt R + G + befolkning, aktiverer pålitelige studier innen hjertevev bioteknologi. Spesielt har vi observert våre ES celle-avledede kardiale progenitorer å kunne danne kontrahering myocardial vev med opprettholde deres cellulære innretting. Gitt at bygging tredimensjonal funksjonellevev er et viktig mål innen vev bioteknologi, kunne vår genererte todimensjonal anisotrop myokardial vev være effektivt brukes til lag flere celle ark, som andre grupper tidligere beskrevet for andre celletyper 21,22. Imidlertid, til dags dato, er en begrensning av den transgene reporteren systemet utfallet av in vitro differensiering av ES-celler. FACS tilgjengelig CVP, særlig sterkt kardiogent R + G + populasjonen, utgjør i en omtrentlig gjennomsnitt på 0,5% av alle differensierte celler. Således forbedrer in vitro differensiering av ES-celler i CVP vil være et stort skritt mot generere tilstrekkelige mengder av CVP å bygge større anisotrope hjertevev bestående av lengderetningen innrettede myokard fibre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble utført i en del ved Senter for nanoskala Systems (CNS), medlem av National Nanoteknologi Infrastructure Network (NNIN), som er støttet av National Science Foundation i henhold NSF award no. ECS-0335765. CNS er en del av Harvard University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Prepare 0.1M solution in ddH2O |
| Desiccator, Vacuum 10 inch | Nova-Tech International, Inc. | 55206 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| FACSAria II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum ES cell-grade | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Fetal Bovine Serum Differentiation-grade | Gemini Bio-Products | 100-500 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F4759 | Solubilize to 1 mg/ml in ddH2O |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 22x22mm | Fisher Scientific | 12-548-B | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | Prepare 0.1% solution in ddH2O |
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc. | PWM32-PS-CB15 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | Thermo Scientific | SH30228.01 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | Self-prepared from LIF-secreting cell lines | Prepare 500x stock solution | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Harvested from day 12-15 mouse embryos | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Prepare 1% solution in ddH2O |
| Round-Bottom Tube with 35 μm cell strainer | BD Biosciences | 352235 | |
| SPI Plasma-Prep II Plasma Cleaner | SPI Supplies | 11005-AB | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Vacuum Gauge | SPI Supplies | 11019-AB |
References
- Alcon, A., Cagavi Bozkulak, E., Qyang, Y. Regenerating functional heart tissue for myocardial repair. Cell Mol. Life Sci. , (2012).
- Chien, K. R., Domian, I. J., Parker, K. K. Cardiogenesis and the complex biology of regenerative cardiovascular medicine. Science. 322, 1494-1497 (2008).
- Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326, 426-429 (2009).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur. Spine J. 17, Suppl . 4. 467-479 (2008).
- Eschenhagen, T., Eder, A., Vollert, I., Hansen, A. Physiological aspects of cardiac tissue engineering. Am. J. Physiol Heart Circ Physiol. 303, H133-H143 (2012).
- Feinberg, A. W., et al. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317, 1366-1370 (2007).
- Li, F., Li, B., Wang, Q. M., Wang, J. H. Cell shape regulates collagen type I expression in human tendon fibroblasts. Cell Motil. Cytoskeleton. 65, 332-341 (2008).
- Sarkar, S., Dadhania, M., Rourke, P., Desai, T. A., Wong, J. Y. Vascular tissue engineering: microtextured scaffold templates to control organization of vascular smooth muscle cells and extracellular matrix. Acta Biomater. 1, 93-100 (2005).
- Isenberg, B. C., Wong, J. Y. Building structure into engineered tissues. Materials Today. 9, 54-60 (2006).
- Athanasiou, K. A., Zhu, C., Lanctot, D. R., Agrawal, C. M., Wang, X. Fundamentals of biomechanics in tissue engineering of bone. Tissue Eng. 6, 361-381 (2000).
- Feinberg, A. W., et al. Controlling the contractile strength of engineered cardiac muscle by hierarchal tissue architecture. Biomaterials. 33, 5732-5741 (2012).
- Black, L. D. 3rd, Meyers, J. D., Weinbaum, J. S., Shvelidze, Y. A., Tranquillo, R. T. Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via gap junction modification. Tissue Eng. Part A. 15, 3099-3108 (2009).
- Kim, D. H., et al. Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 565-570 (2010).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur. Cell Mater. 18, 1-14 (2009).
- Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. Simple approach to micropattern cells on common culture substrates by tuning substrate wettability. Tissue Eng. 10, 865-872 (2004).
- Leu, M., Ehler, E., Perriard, J. C. Characterisation of postnatal growth of the murine heart. Anat. Embryol. (Berl). 204, 217-224 (2001).
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J. Mol. Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
- Porrello, E. R., et al. Heritable pathologic cardiac hypertrophy in adulthood is preceded by neonatal cardiac growth restriction. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 296, 672-680 (2009).
- Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285, H2355-H2363 (2003).
- Ohler, A., et al. Two-photon laser scanning microscopy of the transverse-axial tubule system in ventricular cardiomyocytes from failing and non-failing human hearts. Cardiol. Res. Pract. 2009, 802373 (2009).
- Takahashi, H., Nakayama, M., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. Anisotropic cell sheets for constructing three-dimensional tissue with well-organized cell orientation. Biomaterials. 32, 8830-8838 (2011).
- Williams, C., Xie, A. W., Yamato, M., Okano, T., Wong, J. Y. Stacking of aligned cell sheets for layer-by-layer control of complex tissue structure. Biomaterials. 32, 5625-5632 (2011).
