Summary
Dannelsen af linie myocardievæv er en central forudsætning for at tilpasse de seneste fremskridt inden for stamcelle biologi til klinisk nyttige formål. Heri beskrives en microcontact printing fremgangsmåde til præcis regulering af celle-form og funktion. Brug højtoprensede populationer af embryonale stamceller afledt hjerte progenitorer, så genererer vi anisotropisk funktionel myokardievæv.
Abstract
Fremskreden hjertesvigt udgør en stor udækket behandlingsbehov udfordring, som følge af tab af levedygtige og / eller fuldt funktionel hjertemuskelceller. Trods optimal medicinsk behandling, udgør hjertesvigt en førende årsag til sygelighed og dødelighed i den udviklede verden. En stor udfordring i lægemiddeludvikling er identifikationen af cellulære assays, der nøjagtigt rekapitulere normal og syge menneskers myocardial fysiologi in vitro. Ligeledes er de store udfordringer i regenerativ hjerte biologi centreret omkring identifikation og isolering af patient-specifikke kardiale progenitorer i klinisk relevante mængder. Disse celler skal derefter blive samlet til funktionelt væv, der ligner det native hjertevæv arkitektur. Microcontact printing muliggør etablering af præcise micropatterned protein figurer, der ligner den strukturelle organisering af hjertet, hvilket giver geometriske signaler til kontrol af celleadhæsion rumligt. Heribeskriver vi vores fremgangsmåde til isolering af højtoprensede myocardiale celler fra pluripotente stamceller differentiering in vitro, produktionen af cellevækst overflader micropatterned med ekstracellulære matrix-proteiner, og samlingen af stamceller celleafledte hjertemuskelceller til anisotrop myokardievæv.
Introduction
Trods de seneste fremskridt inden for medicinsk behandling, er fremskreden hjertesvigt en førende årsag til sygelighed og dødelighed i den udviklede verden. Det kliniske syndrom skyldes et tab af funktionel myocardievæv og efterfølgende en manglende evne af det svigtende hjerte til at opfylde metaboliske krav ramte individer. Da hjertet har en begrænset regenerationsevne, autolog hjerte transplantation er den eneste nuværende klinisk accepterede behandling direkte rettet mod genopfyldning tabt funktionel hjerte væv. Væsentlige ulemper ved hjertetransplantation, herunder et begrænset antal donorhjerter og behovet for langvarig immunosuppressiv behandling, den udbredte anvendelse af denne terapi hinder. Som følge heraf har medicinsk terapi været grundpillen i behandlingen af patienter med hjertesygdomme. En stor udfordring i lægemiddeludvikling er identifikationen af cellulære assays, der nøjagtigt rekapitulere normal og sygt myocardial fysiologi in vitro.
Den nylige konvergens stamcellebiologiske og tissue engineering teknologi rejser nye lovende muligheder for hjerte-regeneration. Generering funktionel myocardievæv fra en vedvarende patientspecifik kilde ville være et stort fremskridt på området. Dette vil give mulighed for udvikling af sygdomsspecifikke cellulære assays for lægemiddeludvikling og opdagelse og vil danne grundlag for hjerte-regenerativ medicin. Humane embryonale stamceller (ES) celler og, mere væsentligt, menneskeskabte pluripotente stamceller (iPS) celler udgør en potentielt vedvarende patient-specifikke kilde ventrikulære progenitorceller og modne ventrikulære myocytter. Kombinationen af stamcellebiologiske og vævsmanipulering strategier behandler dette problem ved at generere funktionelle hjerte væv in vitro, som kan anvendes ved udviklingen af cellulære assays til opdagelse af lægemidler eller ved hjerte regenerative fremgangsmåder til behandling af fremskreden hjertesvigt.
_content "> En central udfordring i hjertets regenerering har været identifikation af en optimal celletype. En bred vifte af celler er blevet undersøgt 1, men til dato, selvom forskellige multipotente cardiogene forstadier fra forskellige kilder er blevet opdaget, at identificere en celle kilde, der opfylder kritiske krav såsom engagement den myogene celler skæbne, er opretholdelse af evnen til at ekspandere in vivo eller in vitro og sammensætning til en funktionel myocardievæv vist sig at være et centralt problem 2. Vi har tidligere beskrevet et dobbelt transgen murine system der muliggør isolering af højrenset populationer af engagerede ventrikulære progenitorer (CVP) fra ES-celler differentiering in vitro. er genereret for en hidtil ukendt dobbelt transgen mus, der udtrykker den røde fluorescerende dsRed protein under kontrol af en Isl1-afhængig enhancer af MEF2c genet og Den forbedrede grønt fluorescerende protein under kontrol afDen hjerte-specifikke Nkx2.5 enhancer. Baseret på denne tofarvet fluorescerende reportersystem, første og andet hjerteområdet progenitorer fra udviklingslande ES-celler kan isoleres ved hjælp af fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) i overensstemmelse med deres ekspression af MEF2c og Nkx2.5 gener. CVP ligne hjertemyocytter baseret på ekspressionsmønstre af myocardial markører og strukturelle og funktionelle kvaliteter 3, hvad giver store løfter for hjertevæv regenerative formål.Selv om der har været mange fremskridt inden for tissue engineering, efterligne native cellulær arkitektur fortsat en vigtig udfordring. Konventionelle metoder til at håndtere denne udfordring omfatte podning biologiske eller syntetiske stilladser med celler in vitro. På grund af et antal ulemper af stilladser, herunder hurtig nedbrydning, begrænset fysiske og mekaniske stabilitet og lav celledensitet 1,4,5, har vi forsøgt at konstruere scaffold-less væv. AltHough hjerteceller kan ændre deres lokale mikromiljø ved sekretion af ekstracellulære matrixproteiner, de har en mere begrænset kapacitet til at organisere sig til stavformede hjertemyocytter i fravær af ekstracellulære signaler. Således er en skabelon, der giver celler at passende geografiske og biologiske signaler at komponere funktionel myocardievæv påkrævet. Microcontact udskrivning tager denne udfordring op ved at give en enkel og billig teknik til præcist at kontrollere celleform, organisation og funktion 6-8, som alle er afgørende for dannelsen af linie funktionel myocardievæv. Den omfatter anvendelsen af microtextured polydimethylsiloxan (PDMS) stempler med funktionen størrelser ned til 2 um 9, der muliggør aflejring af ekstracellulære matrixproteiner på PDMS substrater i præcise mønstre og dermed at påvirke celleadhæsion rumligt.
Heri foreslår vi at kombinere væv bioteknik teknologi med stamceller cell biologi til at generere anisotrope funktionel myokardievæv. Derfor har vi her vise vores nyligt offentliggjorte fremgangsmåde til følgende: (1) dannelse af micropatterned proteinoverflader på PDMS substrater ved microcontact trykning til frembringelse af en skabelon til aligned myocardievæv, (2) isolering af højrenset hjerte-progenitorer fra ES-celler differentiere in vitro, og (3) en kombination af begge teknikker til at danne linie funktionelle myokardievæv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollen til at generere linie funktionelle myocardievæv kan opdeles i tre store dele. Fremstillingen af den micropatterned mester med bløde litografiteknikker ikke betragtes som en del af den følgende protokol, men kan gøres baseret på etablerede metode 6.
1. Microcontact Trykning af Fibronectin på PDMS Substrater
- Bland Sylgard 184 (Dow Corning) PDMS elastomer med en 10:01 base til hærder-forholdet og afgasses konstruktionen under anvendelse af en ekssikkator for at fjerne eventuelle luftbobler.
- Cure PDMS mod en tidligere fremstillet master med 20 pm bred og 2 um høje kamme adskilt af 20 um afstand i enten 2 dage ved stuetemperatur eller 4 timer ved 65 ° C til opnåelse microtextured PDMS stempler.
* Hærdning i en ekssikkator anbefales stærkt at fjerne eventuelle luftbobler.
- Spin frakke PDMS på dækglas (f.eks22x22 mm) ved 5000 rpm i 2 min ved anvendelse af en Headway spin coater at producere tynde og endog PDMS substrater på 15 um tykkelse.
- Rengør frimærker med 70% Ethanol at fjerne støv og snavs. Lad dem lufttørre.
* Frimærker kan anvendes flere gange, er imidlertid forlængelse PDMS stempler regelmæssigt anbefales på grund af en overflade slid over tid.
- Placer frimærker i en SPI Plasma-Prep II Plasma Cleaner og proces i 1 min ved 275 mTorr at gøre PDMS overflader hydrofile.
* Ilt plasma behandling bør overvåges. Længere behandlingstider kan resultere i revnedannelse af elastomeren.
- Sterilisere stempler med 70% ethanol i 1 minut. Tør hurtigt med trykluft.
* Yderligere trin bør udføres i et biologisk sikkerhedsskab at opretholde sterilitet.
- Omfatte stempel overflader med Fibronectin opløsning (50 ug / ml i ddH 2 O). Lad det adsorberes mindst 10 min.
- Ryst Fibronectin løsning fra frimærker og tørre hurtigt med trykluft.
- Etablere konform kontakt mellem stempler og PDMS substrater i 2 minutter og tryk fast.
- Skyl micropatterned substrater med Hedeselskabet 2 O. Opbevar dem i ddH 2 O i højst 2 uger ved 4 ° C, medmindre oprindeligt brugt. Store PDMS frimærker i ddH 2 O.
2. Vedligeholdelse af Double Transgene embryonale stamcellelinjer
Først forberede følgende medier til dyrkning af muse ES-celler:
Mouse Embryonic Fibroblast (MEF)-Medium: Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM), 10% føtalt bovint serum (FBS) ES-celle-eller Differentiation-grade, 1% penicillin-streptomycin (P / S)
Embryonale stamceller (ESC)-Medium: DMEM, 15% FBS ES celle-grade,1% ikke-essentielle aminosyrer (NEAA), 0,5% P / S, 0,2% leukæmiinhiberende faktor (LIF), 0,0007% 2-mercaptoethanol (2-ME)
- Overtrække plader med 6 brønde med steril 0,1% gelatine i ddH 2 O og lad det adsorbere 15 minutter ved 37 ° C.
- Tilføj MEF'er fra en optøet alikvot på 50 ml PBS i et konisk rør og centrifugeres dem ved 1.000 rpm i 5 min. Resuspender MEF'er i MEF-medium.
- Efter adsorption aspirat overskydende Gelatine og tilføje MEF'er i brøndene. Tillad MEF'er 1 dag til vedhæfte.
* En alikvot på 10 millioner MEF'er er tilstrækkelig til 3 6-brønds plader.
- Når MEF'er er bundet, tilsættes ES-celler fra en optøet alikvot på 50 ml PBS i et konisk rør og centrifugeres dem ved 1.000 rpm i 5 min. Resuspender ES-celler i ESC-medium og tilføje dem til brøndene indeholdende MEF. Kultur ES-celler i ESC-medium, indtil konfluens opnås.
* Når ES-celler har nået konfluens, bliver passage requIRED at undgå overvækst og opretholde ES-cellekolonier.
- Forbered ES-celler til passage. Aspirer ESC-medium og vask en gang med sterilt PBS.
- Aspirere PBS, og der tilsættes 500 pi af trypsin. Processen 3,5 min ved 37 ° C.
- Afpipetter den trypsinopløsning op og ned flere gange for at nedbryde ES-cellekolonier og neutraliseres den med 500 pi ESC-medium.
- Passage ES-celler i henhold til dine ønskede forhold, f.eks transfer 33 gl til et andet godt med tidligere fremstillet MEF'er til passage 1/30. Opretholde ES-celler i ESC-Medium.
* En passage forhold på 1/30 tillader ES-celler nå konfluens inden for 3 dage. Passage ES-celler i henhold til dine in vitro differentiering tidsplan.
3. In vitro Differentiering af Double Transgene embryonale stamcellelinjer og isolering og Seeding af Hjerte progenitorer
Først forberede following medier kræves til in vitro differentiering af ES-celler:
Tilpasning-Medium: Iscoves modificerede Dulbeccos medium (IMDM), 15% FBS ES-celle-grade, 1% NEAA, 0.5% P / S, 0,2% LIF, 0,0007% 2-ME
Differentiering-Medium: IMDM, 15% FBS Differentiering-grade. 1% NEAA, 0.5% P / S, 0,35% af 0,1 M ascorbinsyre, 0,0007% 2-ME
- Start in vitro differentiering, når ES-celler har nået konfluens. Coat 10 cm dyrkningsskåle med steril 0,1% gelatine i ddH 2 O og lad det adsorbere 15 minutter ved 37 ° C.
* Vær opmærksom på varigheden af den in vitro differentiering proces. Det tager 8 dage, indtil hjerte progenitorer kan isoleres. Planlæg dine eksperimenter i overensstemmelse hermed.
- Harvest ES-celler som tidligere. Efter adsorption, aspirat overskud Gelatine og tilsæt ca 1/3-1/2 af ES cellesuspension til tilberedt kulturretter, der indeholder Tilpasning-medium. Dyrke celler i 2 dage.
* Vælg mængden af ES-celler for tilpasning i henhold til dine eksperimenter.
- Høst tilpasset ES-celler i en 50 ml konisk rør indeholdende PBS under anvendelse af 1. 5 ml trypsin. Centrifuger dissocierede ES-celler ved 1000 rpm i 5 min og resuspendere dem i Differentiering-medium.
- Gør embryoid organer (EBS) af cirka 1.000 celler pr 10 gl fald i 15 cm dyrkningsskåle ved hjælp af en multi-kanal pipette. Inverter pladerne og kultur EBS som hængende dråber i 2,5 dage ved 37 ° C.
- Efter 2,5 dage pool EB'er på 6-8 15 cm dyrkningsskåle i én anvendelse Differentiering-medium, og kulturen dem i yderligere 3,5 dage ved 37 ° C.
- Efter 3,5 dage, indsamle EB'er i et konisk 50 ml rør og lade dem synker til bunds i ca 5 min. Suge supernatanten og vask EB'er med sterilt PBS. Lad EB'er synker igen til bunden for caoximately 5 min.
- Dissocierer EB'er ved at behandle dem med to. 5 ml trypsin i 2 minutter i et vandbad ved 37 ° C omrystning af røret sagte. Derefter tilsættes 2. 5 ml sterilt PBS til trypsin opløsning og pipetteres op og ned med en 10 ml serologisk pipette ca 8-10 gange for at nedbryde celleklynger. Neutraliser Trypsin med 10 ml FACS puffer indeholdende 7,5% FBS ES-celle-eller Differentiering-grade og 0,01% DAPI i PBS.
- Centrifuger dissocieret EB'er ved 1000 rpm i 5 min og resuspendere dem i cirka 1 ml FACS buffer. Pipetteres op og ned med en 1 ml pipette ca 8-10 gange for at nedbryde celleklynger.
* Læg FACS puffer ifølge det anslåede beløb for dissocieret EB'er. Too højkoncentrerede celler kan tilstoppe under FACS og for lavt koncentrerede celler kan forlænge FACS tid unødigt.
- Overføre cellerne til en steril rundbundet rør med en 35 um si celle til opnåelseen enkelt cellesuspension.
- Sortere differentierede ES-celler ved anvendelse af en FACSAria Flow Cytometer og opnå oprensede populationer af CVP.
* Vi udviklede en multi-trins gating strategi for at isolere højt oprensede farvede celler. Kort sagt,. Vi første port på Forward Scatter Amplitude (FSC-A) og Side Scatter Amplitude (SSC-A) (figur 1A) Dette giver os mulighed for at adskille hele celler fra celleaffald. Vi derefter gate på FSC-A og Forward Scatter-Bredde (FSC-W) (figur 1B). Dette giver os mulighed for at isolere celler slåbrokker fra dubletter og andre cellulære aggregater. Vi derefter gate på SSC-A og Side Scatter-Bredde (SSC-W) (figur 1C). Dette øger renheden af celle singlets. Vi derefter gate på DAPI farvning for at isolere levedygtige celler (DAPI-negativ) fra ikke-levedygtige celler (figur 1D). Vi derefter gate på Phycoeryhthrin Amplitude (PE-A) og PE-cyaninfarvestof 7 Amplitude (PE-Cy7-A) for at opnå ægte rød-positive (R + -) celler og at udelukke autofluorescerende rød-negative celler (figur 1E). R + og R - celler er derefter gated separat på fluoresceinisothiocyanat Amplitude (FITC-A) og PE-A at sortere ægte grøn-positive (G +) og ægte grøn-negative (G -) celler i disse populationer (figur 1F + 1G). Dette resulterer i fire populationer af celler som følger: R + G +, R + G -, R - G + og R - G - (fig. 1 H).
- Passivere micropatterned substrater med 1% Pluronic F-127 i ddH 2 O i 10 minutter. Derefter vaske dem 3x med steril PBS.
* Pluronic F-127 er et overfladeaktivt middel, der blokerer celleadhæsion. Det understøtter indespærring af celleadhæsion til micropatterned område.
- Vedhæfte PDMS pakninger rundt om den mønstrede områdeog tryk fast. Derefter frø CVP på fibronectin micropatterned substrater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FACS-oprensning af in vitro differentierede ES-celler afslørede fire forskellige populationer af progenitorer (figur 1). Tilstedeværelsen af micropatterned Fibronectin blev bekræftet ved immunfluorescensmikroskopi som viste en fuldstændig overførsel af kontinuerlige fibronectin linier (figur 2). Plating af FACS-isolerede progenitorer over på fibronektin micropatterns resulterede i opretning af R + G + og en del af R - G +-populationer. Selv Pluronic F-127 som en støttende blokker af celleadhæsion blev anvendt, R + G - og R - G - har populationer ikke overholder den anisotrope struktur af fibronectin og voksede ind i rummet mellem hosliggende protein linier (figur 3).
Figur 1. Represe ntative flowcytometri diagram af dag 6 in vitro differentierede ES-celler. (A) gating på Forward Scatter Amplitude (FSC-A) og Side Scatter Amplitude (SSC-A). (B) gating på FSC-A og Forward Scatter-Bredde ( FSC-H). (C) gating på SSC-A og sidespredning-bredde (SSC-W). (D) gating på DAPI-farvning. (E) Gating for Phycoeryhthrin (PE) og PE-cyaninfarvestof 7 (PE- Cy7) (F og G) Gating til fluoresceinisothiocyanat Amplitude (FITC-A) og PE-A (H) Flowcytometri plot afslørede fire forskellige populationer af stamceller:.. R + G +, R + G -, R - G + og R - G -. Klik her for at se større figur .
fig2.jpg "alt =" Figur 2 "/>
Figur 2. Repræsentant immunfluorescensmikroskopi af micropatterned fibronectin substrater. Scale bar, 80 um.
Figur 3. Repræsentative immunfluorescensmikroskopi af embryonisk-(A) og ES-celleafledt (B) FACS-isolerede stamceller efter yderligere 5 dages dyrkning på fibronectin micropatterns kerner, blå. SmMHC, rød, sarcomerisk α-actinin, grøn. Scale bar, 40 pm. Gengivet fra Domian et al. (2009).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol, præsenterede vi en metode til at isolere oprensede populationer af cardiogene progenitorer og frø dem på micropatterned fibronectin substrater hvad gør dem med at tilpasse og tage en hjerte myocyt-lignende stang form. Normal cellulær organisation er kritisk for normal vævsfunktion 8,10, især til myocardialt væv. Hjertemyocytter er blevet vist at udvikle forbedrede mekaniske 11,12 og elektrofysiologiske egenskaber 11,13 ved dannelse anisotrope cellearrays. Idet hjerte progenitorer dyrket på micropatterned fibronectin substrater differentierer til stavformede myocardiale celler in vitro, er der tale apivotal trin inden hjertevæv bioteknologi.
Microcontact trykning er et enkelt og billigt værktøj, som kan anvendes til at danne to-dimensionale skabeloner ligner myocardievæv in vitro. Imidlertid effektivt og vellykket mønsterdannelse af ekstraktionellular matrixproteiner afhænger kritisk af det valgte protein. Henviser til en lang række forskellige proteiner med succes er blevet stemplet på PDMS substrater, visse proteiner, såsom collagen type I, kræver overflademodifikation af PDMS substrater forud for microcontact printing 14. Desuden kan den mængde tryk påført på frimærket samt varigheden af stempling også i høj grad påvirke effektiviteten og nøjagtigheden af den microcontact printing.
Et andet afgørende skridt i denne protokol er brugen af et plasma renere at gøre overfladerne på PDMS frimærker hydrofile. Det er velkendt, at microcontact printing ikke forekommer, når både PDMS frimærker og substrater ikke undergår oxygenplasmabehandling 15 og flere grupper fundet at tuning befugteligheden af PDMS substrater er nødvendig for at foretage en overførsel af protein muligt 3,6 , 15. Vi fandt imidlertid, at forøgelse af hydrofilicitetPDMS stempel i stedet for de PDMS substratet resulterer i mere ensartede protein micropatterns med højere kvalitet, såsom mindre forstyrrende eller ufuldstændige protein linjer.
For det præsenterede protokol blev micropattern bredde på 20 um valgt ifølge den rapporterede cellebredden af murine neonatale hjertemyocytter 16. Imidlertid bør fremstillingen af micropatterns udføres i en arts-og hjerte udviklingsstadium-afhængig 16-20 måde for at forhindre modsatte virkninger på cellelevedygtighed på grund af begrænset plads.
Opdagelsen og oprensning af ES celleafledt CVP, især R + G + befolkning, muliggøre pålidelige undersøgelser inden for hjertevæv bioteknik. Især har vi observeret vores ES celleafledte hjerte progenitorer at være i stand til at danne kontraherende myocardievæv med at opretholde deres cellulære tilpasning. Eftersom konstruere tredimensionelle funktionellevæv er et vigtigt mål på vævet bioteknologi, kan vores genereret todimensional anisotropisk myocardievæv anvendes effektivt til lag flere cellelag, som andre grupper beskrevet tidligere for andre celletyper 21,22. Men til dato, en begrænsning af den transgene reportersystem er resultatet af in vitro-differentiering af ES-celler. FACS tilgængelig CVP, navnlig stærkt cardiogent R + G + befolkning, der i øjeblikket tegner sig for et gennemsnit på ca 0,5% af alle differentierede celler. Således forbedre in vitro differentiering af ES-celler i CVP vil være et stort skridt i retning generere tilstrækkelige mængder CVP til at bygge større anisotropisk hjertevæv bestående af langsgående linie myokardie fibre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev udført i en del ved Center for Nanoscale Systems (CNS), et medlem af National Nanotechnology Infrastructure Network (NNIN), som er støttet af National Science Foundation under NSF tildeling no. ECS-0.335.765. CNS er en del af Harvard University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Prepare 0.1M solution in ddH2O |
| Desiccator, Vacuum 10 inch | Nova-Tech International, Inc. | 55206 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| FACSAria II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum ES cell-grade | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Fetal Bovine Serum Differentiation-grade | Gemini Bio-Products | 100-500 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F4759 | Solubilize to 1 mg/ml in ddH2O |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 22x22mm | Fisher Scientific | 12-548-B | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | Prepare 0.1% solution in ddH2O |
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc. | PWM32-PS-CB15 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | Thermo Scientific | SH30228.01 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | Self-prepared from LIF-secreting cell lines | Prepare 500x stock solution | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Harvested from day 12-15 mouse embryos | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Prepare 1% solution in ddH2O |
| Round-Bottom Tube with 35 μm cell strainer | BD Biosciences | 352235 | |
| SPI Plasma-Prep II Plasma Cleaner | SPI Supplies | 11005-AB | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Vacuum Gauge | SPI Supplies | 11019-AB |
References
- Alcon, A., Cagavi Bozkulak, E., Qyang, Y. Regenerating functional heart tissue for myocardial repair. Cell Mol. Life Sci. , (2012).
- Chien, K. R., Domian, I. J., Parker, K. K. Cardiogenesis and the complex biology of regenerative cardiovascular medicine. Science. 322, 1494-1497 (2008).
- Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326, 426-429 (2009).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur. Spine J. 17, Suppl . 4. 467-479 (2008).
- Eschenhagen, T., Eder, A., Vollert, I., Hansen, A. Physiological aspects of cardiac tissue engineering. Am. J. Physiol Heart Circ Physiol. 303, H133-H143 (2012).
- Feinberg, A. W., et al. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317, 1366-1370 (2007).
- Li, F., Li, B., Wang, Q. M., Wang, J. H. Cell shape regulates collagen type I expression in human tendon fibroblasts. Cell Motil. Cytoskeleton. 65, 332-341 (2008).
- Sarkar, S., Dadhania, M., Rourke, P., Desai, T. A., Wong, J. Y. Vascular tissue engineering: microtextured scaffold templates to control organization of vascular smooth muscle cells and extracellular matrix. Acta Biomater. 1, 93-100 (2005).
- Isenberg, B. C., Wong, J. Y. Building structure into engineered tissues. Materials Today. 9, 54-60 (2006).
- Athanasiou, K. A., Zhu, C., Lanctot, D. R., Agrawal, C. M., Wang, X. Fundamentals of biomechanics in tissue engineering of bone. Tissue Eng. 6, 361-381 (2000).
- Feinberg, A. W., et al. Controlling the contractile strength of engineered cardiac muscle by hierarchal tissue architecture. Biomaterials. 33, 5732-5741 (2012).
- Black, L. D. 3rd, Meyers, J. D., Weinbaum, J. S., Shvelidze, Y. A., Tranquillo, R. T. Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via gap junction modification. Tissue Eng. Part A. 15, 3099-3108 (2009).
- Kim, D. H., et al. Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 565-570 (2010).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur. Cell Mater. 18, 1-14 (2009).
- Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. Simple approach to micropattern cells on common culture substrates by tuning substrate wettability. Tissue Eng. 10, 865-872 (2004).
- Leu, M., Ehler, E., Perriard, J. C. Characterisation of postnatal growth of the murine heart. Anat. Embryol. (Berl). 204, 217-224 (2001).
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J. Mol. Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
- Porrello, E. R., et al. Heritable pathologic cardiac hypertrophy in adulthood is preceded by neonatal cardiac growth restriction. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 296, 672-680 (2009).
- Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285, H2355-H2363 (2003).
- Ohler, A., et al. Two-photon laser scanning microscopy of the transverse-axial tubule system in ventricular cardiomyocytes from failing and non-failing human hearts. Cardiol. Res. Pract. 2009, 802373 (2009).
- Takahashi, H., Nakayama, M., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. Anisotropic cell sheets for constructing three-dimensional tissue with well-organized cell orientation. Biomaterials. 32, 8830-8838 (2011).
- Williams, C., Xie, A. W., Yamato, M., Okano, T., Wong, J. Y. Stacking of aligned cell sheets for layer-by-layer control of complex tissue structure. Biomaterials. 32, 5625-5632 (2011).
