Summary
Micro-stromingsvisualisatie (μPIV) wordt gebruikt om gepaarde beelden microdeeltjes uitgezet in bloedstromen die kruis-gecorreleerde een accurate snelheidsprofiel geven visualiseren. Afschuifsnelheid, maximale snelheid, snelheid profielvorm en debiet, die elk klinische toepassingen kan worden afgeleid uit deze metingen.
Abstract
Micro-particle image velocimetry (μPIV) wordt gebruikt om gepaarde beelden van microdeeltjes uitgezaaid in bloed stroomt visualiseren. De beelden zijn cross-gecorreleerde om een nauwkeurige snelheidsprofiel geven. Een protocol wordt gepresenteerd voor μPIV metingen van het bloed stroomt in microkanalen. Aan de omvang van de microcirculatie, kan het bloed niet als een homogene vloeistof, zoals een suspensie van flexibele deeltjes in plasma, een Newtonse vloeistof. Afschuifsnelheid, maximale snelheid, snelheid profielvorm en debiet kan worden afgeleid uit deze metingen. Een aantal belangrijke parameters zoals scherptediepte, deeltje concentratie, en compliance-systeem, worden gepresenteerd in om ervoor te zorgen accurate, bruikbare gegevens samen met voorbeelden en representatieve resultaten voor de verschillende hematocrietwaarden en stromingscondities.
Introduction
Het menselijk lichaam bevat talrijke vaten met een diameter kleiner dan 50 urn, die de hoofdcentrale plaats tussen bloed en weefsels. De studie van de bloedstroom in deze vaten een aanzienlijke uitdaging vanwege zowel de omvang van de metingen en de vloeistof eigenschappen van bloed. Deze metingen, waaronder de drukgradiënt, de afschuiving op de muur, en de snelheidsprofielen in arteriolen en venulen, zijn belangrijke factoren in verband met fysiologische reacties. Er zijn nu ongekende mogelijkheden om deze meting uitdagingen op te lossen, dankzij nieuwe experimentele technieken op micro schaal om de microcirculatie te bestuderen en dit multiscale probleem op te lossen.
Micro-particle image velocimetry (μPIV) is een deeltje-gebaseerde stroom visualisatie techniek die wordt gebruikt om de snelheidsprofielen van de bloedstroom in microkanalen via kruis correlatie evalueren. μPIV, eerst ontwikkeld door Santiago et al.., is gebruikt met hemorheologystudies sinds Sugii et al.. In 2001 gebruikte de techniek om de bloedstroom te meten bij 100 micrometer ronde glazen buizen 1,2. Verschillende benaderingen van μPIV bestaan. High speed camera's kunnen worden gebruikt om de beweging van rode bloedcellen (RBC) correleren en gepulste beelden kunnen worden gebruikt om de beweging van tracer deeltjes correleren. Elk van deze opties kan worden gekoppeld met een rechtopstaande of omgekeerde microscoop, afhankelijk van de toepassing. In beide gevallen is het resultaat een 2D snelheidsprofiel. Een andere benadering is een confocale microscoop 2D en 3D profielen bereiken. Deze werkwijze is toegepast om bloed 3,4,5.
Microschaal PIV heeft verschillende complicaties in vergelijking met macro PIV. In macro PIV de gegevens kunnen worden beperkt tot een vlak door vellen van licht, maar op microschaal volume verlichting noodzakelijk is. Volume verlichting is een groter probleem voor de beeldvorming van micro bloed stroomt, zoals de RBCs zelf groot in vergelijking met de channels en met RBC als tracer deeltjes tot een diepte van correlatie (DOC) die de nauwkeurigheid van de kruiscorrelatie resultaten 6,7,8 aanzienlijk kan verminderen. Na Wereley et al.. (1998) de DOC voor een 40 micrometer lang kanaal met RBC als tracers is 8,8 micrometer, terwijl met een 1 micrometer tracer deeltje het DOC is 6,7 micrometer. Dit verschil wordt meer uitgesproken bij het wisselen van kanaal hoogte en vergroting. Daarnaast RBC ondoorzichtig en verhogen van de dichtheid van RBC in de stroom veroorzaakt imaging moeilijkheden. Fluorescerende tracer deeltjes, voor het eerst gebruikt door Santiago et al.. (1998), werden bepleit als een instrument om de invloed van de out-of-focus deeltjes, afnemen bij het gebruik van de kleinste deeltjes mogelijk. Gebruik 1 urn diameter fluorescerende microdeeltjes combinatie met een laser is een benadering die de scherptediepte probleem kan afnemen micro bloedstroom beeldvorming 10. Er zijn verschillende lopende beoordelingen van de staat van μPIV technology, die elk benadrukt het belang van μPIV om de bloedstroom studies 11,12. Aantal belangrijke overwegingen moet rekening worden gehouden bij het gebruik μPIV voor bloed. Op microniveau, de omvang van de microcirculatie, bloed niet als een homogene vloeistof, zoals een suspensie van flexibele rode bloedcellen (RBC), grote witte bloedcellen, bloedplaatjes en andere proteïnen gesuspendeerd in een Newtonse vloeistof (plasma) .
De snelheidsprofielen hier gemeten kunnen worden gebruikt om bepaalde kenmerken van het micro bloed stroomt te meten. De belangrijke factoren in microhemorheology de stroomsnelheid van het bloed, de vorm van het snelheidsprofiel en de schuifspanning in de wand van het vat. Deze informatie heeft klinische implicaties, zoals de microcirculatie is de site voor nutriënten uitwisseling in het lichaam en deze uitwisseling afschuifafhankelijke. Er zijn verschillende lopende evaluatie studies over de stand van het onderzoek in de microcirculatie en 13,14,15.
Hier gepresenteerde is een protocol voor μPIV metingen van bloed stroomt in polydimethylsiloxaan (PDMS) microkanalen. PDMS kanalen werden gefabriceerd in-house na de bronnen in deel 1 van het protocol. Varkens bloedmonsters werden verkregen van een erkend slachthuis en schoongemaakt na deel 2 van het protocol. Alle gegevens werden verkregen met behulp van de LaVision MITAS μPIV systeem, zoals beschreven in paragraaf 3 van het protocol. De opzet bestaat uit een Nd: YAG laser (New Wave Research, USA) en CCD camera (Image Intense, Lavision) bestuurd door een programmeerbare triggering eenheid, een fluorescentiemicroscoop combinatie met een bewegende fase in 3 assen, en een computer, naast een hoge snelheid camera (Dalsa 1M150, Nederland) werd toegevoegd voor visualisatie van RBC zelf. Beide camera's zijn aangesloten op een 2-poort optische doos (Custom door Zeiss, Duitsland). In typische in vivo metingen van de bloedstroom, wordt een rechtopstaande microscoop gebruikt om RBC volgen demselves, terwijl typische in vitro toepassingen een omgekeerde microscoop wordt gebruikt om de tracer deeltjes volgen. In dit unieke dual set-up, de doos optiek maakt beide tracers worden afgebeeld met behulp van de omgekeerde microscoop. Bloed werd in de microchips via een precisie spuitpomp (Nexus3000, Chemyx Inc, USA). Een diagram van het systeem wordt getoond in figuur 1, waarbij het bovenste gedeelte van de figuur is de 140 urn met 40 urn rechthoekige kanalen gemaakt van PDMS, en het onderste deel betreft het gehele systeem, inclusief beide camera, de laser, de spuitpomp en de microscoop.
Huidige μPIV set-ups beschikbaar, meestal met eigen software, onder andere TSI, Dantec Dynamics, en LaVision. Standaard kruiscorrelatie algoritmen kan door talrijke softwareprogramma's zoals MATLAB. De software is niet de sleutel, te begrijpen wat de dialoog vakjes komen overeen met zal mathematisch het gebruik dienenr veel beter. In dit protocol Davis, zijn eigen software LaVision's of MATLAB gebruikt. Het protocol is geen software-specifieke, maar de menu-opties zijn mogelijk op verschillende plaatsen in verschillende softwarepakketten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Microchip Fabrication
De eerste stap is het maken of kopen van uw microchannel. Er zijn vele mogelijkheden voor microchip materiaal.
Een van de meest voorkomende materialen gekozen poly (dimethylsiloxaan) (PDMS). Er zijn vele publicaties over aanwijzingen voor PDMS fabricage door zachte lithografie 16,17,18.
Zodra de PDMS kanaal wordt vervaardigd, zijn er verschillende oppervlaktebehandelingen beschikbaar zijn natuurlijke hydrofobiciteit keren. Zuurstofrijk plasma behandeling is een veel voorkomende optie.
Zhou, Ellis, en Voelcker (2009) geven een overzicht van oppervlaktebehandelingen en hoe ze PDMS beïnvloeden. Deze resultaten zijn voor water echter, en bloed heeft verschillende eigenschappen. Een studie over wat dat betekent voor oppervlaktebehandeling bloed is gedaan door Pitts et al.. (2012a).
Voor de hier gepresenteerde resultaten, microchip oppervlakken en de glaasjes warengebonden aan beide werden blootgesteld aan zuurstof plasma gedurende 45 seconden en vervolgens samengeperst stevig resulteert in een permanente hechting.
2. Blood Bereiding
- Verzamelen bloedmonsters van een geaccrediteerde faciliteit. Bijvoorbeeld varkensbloed kan met ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) als antistollingsmiddel. Voeg 1 g EDTA met 4 ml water en voeg vervolgens de oplossing tot 1 liter volbloed, voorzichtig mengen 10x.
Bij het opzuigen van bloedmonsters, laat ze langzaam afkoelen tot kamertemperatuur. Bloedmonsters moet vers zijn, en idealiter gebruikt de dag dat zij worden verzameld om de reologische eigenschappen van het bloed te behouden.
Monsters kan eenmaal worden gekoeld op kamertemperatuur, maar bloed zonder antistollingsmiddel onbruikbaar na koeling zal zijn. Afhankelijk van het antistollingsmiddel, kan RBCs gekoeld bewaard tot 42 dagen, en volbloed koelkast nog 35 dagen bewaard, maar contaminatie in een niet-m mogelijkedische faciliteit 21.
Bovendien, wees voorzichtig van de methode voor het verzamelen van runderen of varkens monsters, en vervuiling door het beenmerg te voorkomen.
- Centrifugeer de bloedmonsters 3x bij 3000 rpm gedurende 10 minuten per keer. Na de eerste centrifugeren, verwijder het plasma en buffy coat, weggooien. Het is doorgaans handiger om het plasma eerst te verwijderen, en vervolgens weggooien of bewaren voor toekomstig gebruik, dan is het buffycoat alleen te verwijderen.
Steek de pipet langzaam, om niet de bufferlaag terug te mengen in het bloed. Nadat de bufferlaag wordt ongeveer 20 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en meng voorzichtig recentrifuge. Herhaal laatste stap. Na de derde centrifugeren, verwijder de PBS-en overige buffycoat, weggooien.
Het is ook mogelijk om het natieve plasma in plaats van PBS als u wenst te aggregeren eigenschappen van het bloed behouden. Zorg ervoor dat u alle buffycoat of wit door elkaarbloedcellen in het plasma.
- Neem schoongemaakt rode bloedcellen (RBC's) en schorten in PBS of plasma bij gewenste concentraties (hematocriet). Controleer hematocrietwaarden met een microcentrifuge (CritSpin FisherSci, USA).
Bloed bij 10 tot 20% hematocriet moeten gemakkelijker te visualiseren dan 40 of 50% (fysiologische hematocriet) zijn. In de microcirculatie, het bloed in het algemeen de helft van de hematocriet macro circulatie, zodat H = 20 voldoende 15.
- Voeg fluorescerende tracer deeltjes bij de gewenste concentratie bloedmonsters. Een algemene regel is tot en met 10 deeltjes in een correlatie venster, dat van tevoren kan worden berekend hebben.
Zo worden 30 pl deeltjes toegevoegd aan 1 ml bloed oplossing voor de set-up afgebeeld in de video. Als alternatief kan de RBC zelf fluorescent gelabeld worden.
- Daarnaast maakt een kalibratie-oplossing met water en grieporescing deeltjes. Het zal nodig zijn om het systeem te kalibreren met een Newtoniaanse oplossing.
Bijvoorbeeld, bij gebruik van een 10x objectief met een kanaal op de schaal van 100 urn, een geschikte concentratie is 300 gl deeltjes gemengd met 15 ml gedestilleerd water. Een andere optie is om glycerol verdund met gedestilleerd water tot een viscositeit van 3cP, die dichter bij bloed macro viscositeit te gebruiken.
3. μPIV Metingen
- Laserveiligheid: Controleer de temperatuur en vochtigheid. Draag geschikte laser veiligheidsbril. Sluit de laser gordijn of schakel de laser bordje op de deur lab op om mensen niet beschermd tegen blootstelling te voorkomen.
- Procedure met Davis software wordt in beeld. Voor meer details, zie de handleiding van een specifiek systeem.
- Alvorens de gegevens, moet de schaal camera te worden gekalibreerd met behulp van een micrometer.
- Om de naleving van het systeem te verminderen, gebruikt u de kortste buis eend de kleinste stijve spuit mogelijk is, zoals een 15 of 50 ul Hamilton Gasdichte spuit. Om lekkage van bloed of lucht in het systeem te verminderen, sluit de slang aan de injectiespuit en de chip. Dit kan gedaan worden met lijm, PDMS of vaseline (en let niet om het bloed te besmetten).
Om de micro-injectiespuit te vullen met water geregen met tracer deeltjes gebruikt terugstroming methode omdat het volume van de micro-injectiespuit is meestal veel kleiner dan het volume te vullen.
De terugstroom methode bestaat de micro-injectiespuit en kanalen tezamen vullen via de uitgang van het kanaal een secundaire plastic spuit. Voor dat, eerst de micro-zuiger te verwijderen, druk de vloeistof met behulp van de klassieke plastic spuit bevestigd aan de uitlaat van het kanaal, laat de vloeistofstroom uit de micro-injectiespuit totdat alle microbellen zijn uit de micro-injectiespuit, slang of chip, eindelijk de zuiger terug en haal de plastic spuit. De aanwezigheid or afwezigheid van microbellen kan worden gecontroleerd met een microscoop.
- Niveau van de injectiepomp op horizontale leidingen te bereiken. Programmeer de spuit pomp naar de gewenste debiet.
Wees bewust van de mogelijke tijdelijke effecten, zoals de "bottleneck effect", te rigide systeem of de conformiteit van het systeem dat de werkelijke debiet te wijzigen. Karakteristiek tijden van een systeem kan worden geschat als een functie van de materialen en afmetingen van het systeem. (Hoofdstuk 2, pp 77-81, Tabeling, 2005)
- Plaats microchip op microscoop podium en start de pomp. Gebruik het water met deeltjes om het systeem te kalibreren naar het midden snelheidsprofiel en kalibreren de dT (de tijd tussen gepulste afbeeldingen).
De deeltjes moeten bewegen tussen 5 en 10 pixels tussen de frames voor een goede correlatie 11. Bij het kalibreren, wees voorzichtig om te meten in het midden van het kanaal. De focus vliegtuig in het midden heeft de hoogstesnelheid 8.
Bij gebruik van een rond kanaal, wees voorzichtig van schaduweffecten.
Een afbeelding monster wordt getoond in figuur 2, met een gepulseerde camera, terwijl de bovenkant van de eerste puls en de onderste afbeelding is de tweede puls. Het kan worden gezien in de figuur dat de helderste punten (fluorescerende deeltjes) zijn de in-focus.
- OPTIONEEL: Door het nemen van de gegevens op verschillende hoogtes een 3D snelheidsprofiel kan worden gereconstrueerd door het toevoegen van de verschillende vectoren in een enkel beeld. De video toont een routine die is ontwikkeld voor het automatiseren van het proces.
- Bij het nemen van gegevens van het bloed, vul spuit met de gewenste hoeveelheid bloed in dezelfde werkwijze als het water. Programmeer de spuit pomp naar de gewenste debiet, en neem de gewenste gegevens. Een voorbeeld van rauwe beelden verkregen wordt gepresenteerd Figuur 2. Wees voorzichtig van RBC sedimentatie ook. Bijvullen van de spuit elke run of elkeandere termijn zal de afwikkeling van de RBC verminderen.
- Na het ophalen van afbeeldingen, wordt kruis correlatie uitgevoerd op de afbeelding paren om snelheidsvector velden te verkrijgen tussen de beelden. Het is belangrijk om goede beelden hebben een goede correlatie hebben. Voordat correleren, kan pre-processing worden gedaan om achtergrondruis te verwijderen.
Kruiscorrelatie wordt uitgevoerd tussen vensters in de aangrenzende beelden, die kunnen worden gevarieerd in grootte en vorm aan de correlatie beïnvloeden. Na het kruis correlatie, kan afbeelding nabewerking gedaan worden om foutieve vectoren of uitschieters te verwijderen.
Een gedetailleerde beschrijving van de verschillende beschikbare opties en hun nauwkeurigheden zijn te vinden in Pitts et al.. (2012b), waar de beste behandeling voor het bloed werd gevonden op de methode van de "image overlappende" met ramen uitgebreid in lengte zijn en in lijn met de stroom . Deze handelingen kunnen handmatig worden gedaan in een programma zoals MATLAB, of binnen het softwarepakket met uw systeem. De software is niet belangrijk, de wiskunde achter de verrichtingen belangrijker en elke activiteit kan de nauwkeurigheid van de uiteindelijke snelheidsprofiel beïnvloeden.
De resulterende vectoren kan worden gemiddeld in de ruimte over het kanaal naar instantane snelheid profielen te verkrijgen, en vervolgens gemiddeld weer in de tijd naar een gemiddelde, representatieve snelheid profiel te verkrijgen. Kloosterman et al.. (2011) geven een toelichting op de fout in μPIV metingen waarbij de scherptediepte is groot. Discussies over de fout van de gegevensverwerking hier gepresenteerde is te vinden in Pitts et al.. (2012b) voor de gepulste metingen en Chayer et al.. (2012) voor de hoge snelheid metingen.
Voorbeelden van snelheidsprofielen zijn weergegeven in figuren 3 en 4. Figuur 3 toont een enkel profiel velocity de middellijn van 10 ul / uur stroom van RBC bij H = 10 in een 140 urn breed kanaal.
tent "> Deze ene profiel is gerealiseerd door het gemiddelde van de gecorreleerde vectoren over het kanaal naar een snelheidsprofiel te krijgen, en dan gemiddeld in de tijd om een representatieve meting te krijgen. In dit geval werden 100 paren gemiddeld in de tijd over het gezichtsveld.Een voorbeeld van de 3D gereconstrueerde profiel genomen voor een water kalibratiestroomplaat in een 100 urn vierkante kanalen met een geprogrammeerde stroomsnelheid van 30 ul / uur wordt gevonden in figuur 4. In figuur 4 zijn de profielen gemeten bij 1 um intervallen.
- OPTIE: In de afgebeelde set-up high speed beelden op dezelfde voorwaarden kan worden genomen door over te schakelen camera's (en data-acquisitie systemen). Dit kan nuttig zijn voor het visualiseren van de celvrije laag in het kanaal en voor het kwantificeren van aggregatie. De gegevensanalyse iets anders (Chayer et al.., 2012).
Voorbeelden van wit licht beelden met en zonder RBC aggregatie zijn presented in figuur 5 bij H = 20. De bovenste beelden toont H = 20 in PBS, die het vermogen van de RBC te aggregeren verwijdert op 1 ul / uur. De onderste afbeelding is H = 20 in de moedertaal van het plasma bij 0,5 pl / uur. Afbeelding van de bodem in, aggregatie zichtbaar.
- Schakel het systeem op een veilige manier bij de metingen zijn voltooid. Gebruik de juiste laserveiligheidsprocedures totdat laserkrachtbron volledig is stilgelegd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In alle figuren, wordt doorstroming van links naar rechts in rauwe beelden, en omhoog in berekende snelheidsprofielen. Een voorbeeld van de ruwe data verkregen met bloed in hematocriet H = 10 stroomsnelheid van 10 ul / uur wordt getoond in figuur 2. Ruwe data kan worden kruislings gecorreleerd zonder enige verwerking van gegevens om snelheidsprofielen bereiken. De impact van de pre-processing en data verwerkingsmethoden wordt besproken door Pitts, et al.., (2012b). Een voorbeeld van een resulterende snelheidsprofiel van gegevens overeenkomstig figuur 2 op hematorcrit H = 10 en een stroomsnelheid van 10 pl / uur is weergegeven in figuur 3, een 3D-profiel in water KALIBREREN Figuur 4. Figuur 3 en 4 opgenomen norm gegevensverwerking. Deze snelheidsprofielen kunnen worden gebruikt om metingen zoals de maximum snelheid in het midden van het kanaal, het debiet in het kanaal, en afschuifsnelheid aan de wand voor verschillende stroomomstandigheden channel co makennfigurations en fysiologie. Figuur 5 geeft een voorbeeld afbeelding van een hoge snelheid van met en zonder aggregatie van de RBC. Hoge snelheid beelden zoals in figuur 5 kan ook worden gebruikt om snelheidsprofielen middels kruiscorrelatie berekend.
Figuur 1. Diagram van de μPIV opstelling waarbij (a) is de 140 urn met 40 urn rechthoekige kanalen gemaakt van PDMS met stroom bewegen van links naar rechts en (b) vertegenwoordigt het hele systeem.
Figuur 2. Resulterende ruwe gepulste beeldgegevens uit het μPIV systeem met H = 10 in PBS bij een geprogrammeerde debiet van 10ul / uur (stromend links naar rechts). Bovenste afbeelding is eerste puls.
Figuur 3. Resulterende snelheidsprofiel van het μPIV systeem H = 10 in PBS met een geprogrammeerde stroomsnelheid van 10 ul / uur. Profiel wordt gedraaid om stroom opwaarts te tonen.
Figuur 4. Voorbeeld van een gereconstrueerde 3D snelheidsprofiel van water calibratie in een 100 micrometer vierkant kanaal met meerdere profielen genomen 1 micrometer uit elkaar. Profiel wordt gedraaid om stroom opwaarts te tonen. Klikhier om een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 5. Voorbeeld van snelle beelden waar Top) H = 20 in PBS bij 1 ul / uur (geen aggregatie) en Bottom) H = 20 in natieve plasma van 0,5 ul / uur (aggregatie). In beide afbeeldingen stroming van links naar rechts .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met behulp μPIV voor bloedstroom metingen op de schaal van de microcirculatie kan inzicht geven in een groot aantal relevante biomedische, mechanische en chemische techniek processen. Enkele van de belangrijkste factoren om rekening te houden met de dichtheid van de RBC zelf, de aggregatie en vervormbaarheid van de RBC, samenvoeging of verplaatsing van de fluorescerende micro-deeltjes, en de regeling van de RBC in de kanalen. Al deze kan worden verklaard indien de hierboven vastgestelde algemene richtlijnen worden gevolgd. Er is een eenvoudige checklist om in gedachten te houden voor een goede meting met behulp van dit systeem. Allereerst bepalen hoeveel naleving in het systeem of voorgestelde systeem. Aan het minimaliseren van de naleving Gebruik de kortst mogelijke slang en de kleinste spuit mogelijk is. Rigide systemen hebben minder naleving, maar kan leiden tot knelpunten. Ondanks de kleine omvang van de metingen, zal de zwaartekracht van invloed op de RBC. Het houden van de spuit, buizen en kanalen op dezelfde hoogte is ideaal. Ten tweede, wordt de concentratie van de suspensies. Zorgen er zijn genoeg fluorescerende tracer deeltjes in de oplossing en niet van een te hoge concentratie van RBC. Verhogen van de dichtheid van de tracer deeltjes van een steekproef zullen niet overwinnen van de inherente ondoorzichtigheid van RBC. De hoeveelheid tracer deeltjes van invloed op de correlatie, maar het hebben van te veel rode bloedcellen zal de vloeistof ondoorzichtig en de tracer deeltjes moeilijk om beeld te maken. De totale hematocriet van het monster moet zo laag zijn dat het middenvlak van het kanaal goed kan worden afgebeeld gehouden. Dit is een trade off tussen hematocriet en kanaal grootte. Bij een grotere diepte, het bedrag van RBC tussen de lens en het meetvlak groeit, zelfs bij lage hematorcrit. Om het hogere hematorcrit monsters of grotere kanalen, kan de 'ghost cellen "-methode worden toegepast terwijl de ondoorzichtige interieur van RBC wordt vervangen door heldere vloeistof voor een deel van de RBC (Goldsmith en Skalak, 1975). Ten derde, ervoor zorgen dat de microscope is gericht op het middenvlak van het kanaal. Het kennen van de exacte hoogte van het kanaal is essentieel voor het vinden van het middenvlak. Houd rekening met de grootte van de deeltjes en de grootte van het kanaal, en het berekenen van de diepte van de correlatie (DOC) in uw systeem (Wereley et al.., 1998). De DOC kan grote invloed hebben op de nauwkeurigheid die nodig is om in het vinden van het midden vlak. Een verschil van een micron kan negatieve invloed hebben op de nauwkeurigheid. Zodra de hoeveelheid deeltjes met de omvang van het kanaal en de DOC vond het verschil in tijd tussen gepulste afbeeldingen (dT) bepaald te worden. Controleer de 5-10 pixels verkeer van de deeltjes tussen vensters. De beweging van de deeltjes moet passen in de correlatie vensters beschreven in paragraaf 3.9. Tot slot, beslissen over de wijze van pre-processing, verwerking of naverwerking van vector data. Veel methoden zijn beschikbaar in de literatuur, maar sommige zijn meer succesvol dan anderen wanneer toegepast op bloed. De methode van de "image overlappende" is advseerd voor bloed stroomt (Pitts et al.., 2012b).
Een andere factor in gedachten te houden is het "cell-free"-laag, die goed is gedocumenteerd in microhemodynamics. Dit is het gebrek aan RBC in de wand van het kanaal of vat. Bij het uitvoeren van fluorescerende tracer deeltjes, wordt de gebruiker daadwerkelijk na beweging van het plasma. In het midden van het kanaal of vat, de snelheid maximaal is en beide zullen bewegen met dezelfde snelheid. Aan de muur, zal het plasma nog steeds beweging hebben terwijl er zullen weinig of geen RBC's aanwezig. Op de schaal hier gepresenteerd met 10x vergroting, de cel-vrij laag is niet meetbaar, maar bij hogere vergrotingen moet worden verantwoord. High speed video zou voor een meting van de dikte van het celvrije laag.
Conclusies
μPIV is gebruikt voor hemorheology en biomedisch onderzoek sinds kort na de ontwikkeling. Wanneer toegepast op bloed stroomt op de schaalvan de microcirculatie, moet het complexe gedrag van het bloed worden verantwoord. Een protocol voor μPIV metingen van bloed stroomt in microkanalen werd hier gepresenteerd samen met tips voor het omgaan met de complexe aard van het bloed. Verschillende grafische opties werden geschetst, waaronder gepulste beelden, hoge snelheid foto's en een 3D-optie evenals gegevensverwerking informatie. In gebruik μPIV voor bloed microflow onderzoek kan het effect van geneesmiddelen, ziekten en therapeutische behandelingen op de vorm van het snelheidsprofiel geanalyseerd. Deze metingen nuttig de moderne geneeskunde en techniek sinds de opname van voedingsstoffen en medicijnen is afschuiving afhankelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag NSERC (Natural Sciences and Engineering Council of Canada) bedanken voor financiering, Catherine Pagiatikis voor haar hulp in de eerste runs, Sura Abu-Mallouh en Frederick Fahim voor het testen van het protocol, Richard Prevost van LaVision, Inc voor technische ondersteuning, en Guy Cloutier van de Universiteit van Montreal voor de lening van de Dalsa high-speed camera.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| poly(dimethylsiloxane) (PDMS), i.e. Sylgard-184 | Dow-Corning | 3097358-1004 | |
| ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma Aldrich | E9884-100G | |
| poshpate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| fluorescing micro particles | Microgenics/FisherSci | R900 | |
| glycerol (OPTIONAL) | Sigma Aldrich | G6279-500 ml | |
| microcentrifuge, i.e. CritSpin | FisherSci | 22-269-291 | |
| syringe, i.e. 50 μl Gastight | Hamilton | 80965 | |
| camera, i.e. Imager Intense, high speed | LaVision, Dalsa | Imager Intense | |
| microscope, i.e. MITAS | LaVision | MITAS | |
| Nd:YAG laser | New Wave Research | Solo-II | |
| syringe pump, i.e. Nexus3000 | Chemyx, Inc. | Nexus-3000 | |
| flexible tubing, i.e. Tygon | FisherSci | 14-169-1A | |
| data processing software, i.e. DaVis | LaVision | DaVis | |
| centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2 | Thermo Scientific | 004260F |
References
- Santiago, J. G., Wereley, S. T., Meinhart, C. D. A particle image velocimetry system for microfluidics. Experiments in Fluids. 25, 316-319 (1998).
- Evaluation of Velocity Measurement in Micro Tube by Highly Accurate PIV Technique. Sugii, Y., Okamoto, K., Nishio, S., Nakano, A. 4th International Symposium on Particle Image Velocimetry (PIV '01), 17-19 Sept. 2001, , 1-5 (2001).
- Park, J. S., Choi, C. K., Kihm, K. D. Optically sliced micro-PIV using confocal laser scanning microscopy (CLSM). Exp. Fluids. 37 (1), 105-119 (2004).
- King, M. R., Bansal, D., Kim, M. B., Sarelius, I. H. The effect of hematocrit and leukocyte adherence on flow direction in the microcirculation. Ann. of Biomed. Eng. 32 (6), 803-814 (2004).
- Lima, R., Wada, S., Tsubota, K., Yamaguchi, T. Confocal micro-PIV measurements of three-dimensional profiles of cell suspension flow in a square microchannel. Meas. Sci. Tech. 17 (4), 797-808 (2006).
- Wereley, S. T., Santiago, J. G., Chiu, R., Meinhart, C. D., Adrian, R. J.
- Meinhart, C. D., Wereley, S. T., Gray, M. Volume illumination for two-dimensional particle image velocimetry. Measurement Science and Technology. 11, 809-814 (2000).
- Chayer, B., Pitts, K. L., Cloutier, G. Velocity measurement accuracy in optical microhemodynamics: experiment and simulation. Physiological Measurement. , In Press (2012).
- Tabeling, P. Introduction to Microfluidics. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2005).
- Olson, M. G., Adrian, R. J. Out-of-focus effects on particle image visibility and correlation in microscopic particle image velocimetry. Experiments in Fluids. 29, S166-S174 (2000).
- Wereley, S. T., Meinhart, C. D. Recent advances in micro-particle image velocimetry techniques. Ann. Rev. Fluid Mech. 42, 557-576 (2010).
- Williams, S. J., Park, C., Wereley, S. T. Advances and applications on microfluidic velocimetry. Microfluid. Nanofluid. 8 (6), 709-726 (2010).
- Chiu, J. J., Chen, S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: Pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiol. Rev. 91 (1), 327-387 (2011).
- Secomb, T. W., Pries, A. R. The microcirculation: Physiology at the mesoscale. J. Physiol. 589 (5), 1047-1052 (2011).
- Popel, A. S., Johnson, P. C.
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M.
- Whitesides, G. M., Stroock, A. D.
- Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated of poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophoresis. 24, 3563-3576 (2003).
- Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. Recent developments in PDMS surface modifications for microfluidic devices. Electrophoresis. 31, 2-16 (2009).
- Pitts, K. L., Abu-Mallouh, S., Fenech, M. F. Contact angle study of blood dilutions on common microchip materials. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. , (2012).
- Hovav, T., Yedgar, S., Manny, N., Barshtein, G. Alteration of red blood cell aggregability and shape during blood storage. Transfusion. 39, 277-281 (1999).
- Pitts, K. L., Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. F. Micro-particle image velocimetry measurement of blood flow: validation and analysis of data pre-processing and processing methods. Measurement Science and Technology. 23, 105302 (2012).
- Kloosterman, A., Poelma, C., Westerweel, J. Flow rate estimation in large depth-of-field micro-PIV. Exp. Fluids. 50 (6), 1587-1599 (2011).
- Goldsmith, H. L., Skalak, R.
