Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Velocimetry תמונת מיקרו חלקיקים למדידות בפרופיל מהירות של מיקרו זורם דם

Published: April 25, 2013 doi: 10.3791/50314
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Chemical and Biological Engineering, University of Ottawa, 2Department of Mechanical Engineering, University of Ottawa

Summary

velocimetry תמונת מיקרו חלקיקים (μPIV) משמש כדי לחזות תמונות לזווג של חלקיקי מיקרו נזרעו בזורם דם אשר חוצה קורלציה לתת פרופיל מהירות מדויקת. שיעור גזירה, מהירות המרבית, צורת פרופיל מהירות, וקצב זרימה, כל אחד מהם יש יישומים קליניים, ניתן לגזור ממדידות אלה.

Abstract

velocimetry תמונת מיקרו חלקיקים (μPIV) משמש כדי לחזות תמונות לזווג של חלקיקי מיקרו נזרעו בדם זורם. התמונות הן בין קורלציה לתת פרופיל מהירות מדויקת. פרוטוקול מוצג למדידות μPIV של דם זורם בmicrochannels. בקנה המידה של זרימת הדם, אינו יכול להיחשב דם נוזל הומוגני, כפי שהוא השעיה של חלקיקים המרחפים גמישים בפלזמה, נוזל הניוטונית. שיעור גזירה, מהירות המרבית, צורת פרופיל מהירות, וקצב זרימה יכולים לנבוע ממידות אלו. כמה פרמטרים מרכזיים כגון עומק מוקד, ריכוז חלקיקים, ותאימות מערכת, מוצגים כדי להבטיח נתונים מדויקים ושימושיים יחד עם דוגמאות ותוצאות עבור נציג hematocrits השונים ותנאי זרימה.

Introduction

גוף האדם מכיל כלי רבים עם הקוטר פחות מ 50 מיקרומטר, שהם אתר הבורסה הראשי בין דם וברקמות. המחקר של זרימת דם בכלים האלה מייצג אתגר משמעותי הן בשל קנה המידה של מדידות ואת המאפיינים של נוזל דם. מדידות אלה, כוללים שיפוע הלחץ, הגזירה בקיר, ופרופילי מהירות בעורקים קטנים וvenules, הם גורמים מרכזיים הקשורים בתגובות פיסיולוגיות. כיום יש הזדמנויות חסרות תקדים לפתרון אתגרי מדידה אלה, הודות לניסיוני בטכניקות חדשות בקנה מידת מיקרו כדי ללמוד את זרימת הדם ולפתור את הבעיה multiscale זה.

velocimetry תמונת מיקרו חלקיקים (μPIV) הוא טכניקת הדמיה המבוססת על זרימת חלקיקים המשמש להערכת פרופילי מהירות זרימת דם בmicrochannels באמצעות מתאם צלב. μPIV, פותח לראשונה על ידי סנטיאגו et al., כבר בשימוש עם hemorheologyמחקרים מאז Sugii et al. בשנת 2001 השתמשו בטכניקה כדי למדוד את זרימת דם ב100 מיקרומטר צינורות זכוכית עגול 1,2. קיימות גישות שונות לμPIV. מצלמות מהיר יכולות לשמש כדי לתאם את תנועתם של תאי דם אדומים (RBCs), ותמונות פעמו יכולות לשמש כדי לתאם את תנועתם של חלקיקים נותבים. אחת מהאפשרויות אלה יכולים להיות בשילוב עם מיקרוסקופ זקוף או הפוך, בהתאם ליישום. בשני המקרים, התוצאה היא פרופיל מהירות 2D. גישה אחרת היא להשתמש במיקרוסקופ confocal להשיג פרופילי 2D and 3D. שיטה זו יושמה לדם 3,4,5.

יש מיקרו בקנה מידה PIV כמה סיבוכים בהשוואה למאקרו PIV. במאקרו PIV יכולים להיות מוגבלים את הנתונים למטוס בודד באמצעות גיליונות של אור, אבל בקנה מידת מיקרו נפח התאורה הוא הכרחי. תאורת נפח היא בעיה גדולה יותר להדמיה של זרימת דם מיקרו, כמו את RBCs עצמם הם גדולים בהשוואה לגhannels, והשימוש בRBCs כמו החלקיקים נותב מוביל עד לעומק של מתאם (DOC) אשר יכול להפחית באופן משמעותי את הדיוק של התוצאות חוצות קשר 6,7,8. בעקבות Wereley et al. (1998) DOC לערוץ 40 מיקרומטר גבוה עם RBC כקליעים נותבים הוא 8.8 מיקרומטר, ואילו עם חלקיקים נותב 1 מיקרומטר DOC הוא 6.7 מיקרומטר. הבדל זה הופך להיות בולט יותר בעת שינוי גובה ערוץ וגדלה. בנוסף, RBCs הם אטומים, והגדלת הצפיפות של RBCs בזרימה גורמת לקשיי הדמיה. חלקיקים נותב fluorescing, שימוש לראשונה על ידי סנטיאגו et al. (1998), כבר דגלו ככלי כדי להקטין את ההשפעה של חלקיקים מחוץ למיקוד, בעת שימוש בחלקיקים הקטנים ביותר האפשריים. שימוש fluorescing קוטר 1 מיקרומטר microparticles יחד עם לייזר הוא גישה אחת שעשוי להקטין את עומק הבעיה במיקוד מיקרו זרימת דם הדמיה 10. ישנן מספר ביקורות שוטפות של מדינת μPIV טקhnology, כל אחד מהם מדגיש את החשיבות של μPIV למחקרי זרימת דם 11,12. כמה שיקולים חשובים חייבים להילקח בחשבון בעת ​​שימוש μPIV לדם. ברמת המיקרו, בקנה המידה של זרימת הדם, אינו יכול להיחשב דם נוזל הומוגני, כפי שהיא השעיה של תאים גמישים דם אדום (RBCs), תאי דם לבנים גדולים, טסיות דם וחלבונים אחרים המצויים בנוזל הניוטונית (פלזמה) .

את פרופילי המהירות שנמדדו כאן ניתן להשתמש כדי למדוד את מאפיינים מסוימים של את הדם זורם מיקרו. הגורמים החשובים בmicrohemorheology הם קצב הזרימה של הדם, את הצורה של פרופיל המהירות, ומאמץ הגזירה בקיר של כלי השיט. מידע זה יש השלכות קליניות, כמו זרימת הדם הוא האתר להמרת חומרי מזון בגוף, וחילופי הדברים הוא גזירה תלויה. ישנם מספר מחקרי סקירה שוטפים על מצב מחקר בזרימת הדם, כמו גם 13,14,15.

מוצג כאן הוא פרוטוקול למדידות μPIV של דם זורם בpolydimethylsiloxane (PDMS) microchannels. ערוצי PDMS היו מפוברקים בתוך הבית בעקבות המקורות בסעיף 1 לפרוטוקול. דגימות דם נלקחו מחזיריים מטבחיים מוכר וניקו סעיף 2 לפרוטוקול הבא. כל הנתונים הושגו באמצעות LaVision Mitas μPIV המערכת, כפי שתוארה בסעיף 3 לפרוטוקול. ההגדרה מורכבת מNd: YAG לייזר (גל חדש מחקר, ארה"ב) ומצלמת CCD (תמונה אינטנסיבית, Lavision) הנשלט על ידי יחידה לתכנות מפעילה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי יחד עם שלב 3 שנע בצירים, ומחשב, בנוסף למצלמה במהירות גבוהה (DALSA 1M150, הולנד) נוספה להדמיה של RBCs עצמם. שתי המצלמות מחוברות לתיבה אופטית יציאת 2 (מותאם אישית על ידי Zeiss, גרמניה). בטיפוסי במדידות vivo של זרימת דם, משמש מיקרוסקופ זקוף כדי לעקוב אחר RBCsmselves, ואילו ביישומים טיפוסיים במבחנה משמשת מיקרוסקופ הפוכה כדי לעקוב אחר החלקיקים נותבים. בייחודי כפולה זו ההגדרה, תיבת אופטיקה מאפשרת לשני קליעים נותבים להיות צילמו באמצעות מיקרוסקופ ההפוך. דם הוכנס לשבבים באמצעות משאבת מזרק דיוק גבוהה (Nexus3000, Chemyx Inc, ארה"ב). תרשים של המערכת מוצג באיור 1, שבו החלק העליון של הדמות מייצג את 140 מיקרומטר ידי 40 ערוצים מלבניים מיקרומטר מפוברק של PDMS, ואת החלק התחתון מייצג את המערכת כולה כולל שתי המצלמות, לייזר, משאבת המזרק ו מיקרוסקופ.

μPIV הנוכחי להגדיר קופצים זמין, בדרך כלל עם תוכנת קניינית, כולל TSI, Dynamics Dantec, וLaVision. ניתן להשיג אלגוריתמים חוצים קשר רגילים דרך אפשרויות תוכנה רבות, כולל MATLAB. התוכנה היא לא המפתח, להבין מה את תיבות הדיאלוג מתאימות לבחינה מתמטית ישמשו שימושR הרבה יותר טוב. בפרוטוקול זה דיוויס, תוכנת הקניינית של LaVision או MATLAB מנוצלות. הפרוטוקול הוא לא תוכנה ספציפית, אבל האפשרויות בתפריט יכולות להיות במקומות שונים בחבילות תוכנה שונות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. שבב ייצור

הצעד הראשון הוא ליצור או לרכוש microchannel שלך. ישנן אפשרויות רבות עבור חומר שבב אלקטרוני.

אחד החומרים הנפוצים ביותר שנבחרו הוא פולי (dimethylsiloxane) (PDMS). ישנם פרסומים רבים על הכיוונים לPDMS ייצור באמצעות יתוגרפיה הרכה 16,17,18.

ברגע שערוץ PDMS הוא מפוברק, ישנם מספר טיפולי שטח העומדים לרשות להפוך hydrophobicity הטבעי שלה. טיפול פלזמה חומצן הוא אפשרות נפוצה.

ואו, אליס, וVoelcker (2009) נותנים סקירה של טיפולי שטח וכיצד הם משפיעים על PDMS. תוצאות אלו הן למים לעומת זאת, ויש לו דם מאפיינים שונים. מחקר על מה שאומר על טיפול במשטח דם נעשה על ידי פיטס et al. (2012a).

לקבלת התוצאות שהוצגו כאן, משטחי שבבים ושקופיות הזכוכית הם היוערובה לשניהם נחשפו לפלזמת חומץ למשך 45 שניות ולאחר מכן לחץ יחד כתוצאה היטב בקשר קבוע.

2. הכנת דם

  1. לאסוף דגימות דם ממתקן מוכר. לדוגמא דם חזירי ניתן להשתמש בחומצת ethylenediaminetetraacetic (EDTA) כנוגד קרישה. הוסף 1 גרם EDTA עם 4 מ"ל של מים, ולאחר מכן להוסיף את הפתרון לכל 1 ליטר של הדם, ערבוב בעדינות 10x.

כשתרימו את דגימות דם, לאפשר להם להתקרר באיטיות לRT. דגימות דם צריכה להיות טריות, ומשמשות באופן אידיאלי היום הם נאספים כדי לשמר את מאפייני rheological של הדם.

דגימות עשויות להיות בקירור פעם אחת ב RT; דם כל זאת ללא נוגד קרישה יהיה שמיש לאחר קירור. בהתאם לנוגד הקרישה, יכול להישמר בקירור RBCs לתקופה של עד 42 ימים, וכולו דם יכול להישמר בקירור במשך 35 ימים, אך הזיהום יהיה אפשרי שבאינם מ 'מתקן edical 21.

בנוסף, יש להיזהר משיטת איסוף דגימות עם שור או חזיריות, ולמנוע זיהום על ידי מח עצם.

  1. צנטריפוגה דגימות דם 3x בסל"ד 3000 למשך 10 דקות בכל פעם. לאחר צנטריפוגה הראשונה, הסר את הפלזמה ומעיל באפי, זורקים. זה בדרך כלל הקל ביותר כדי להסיר את הפלזמה ראשונה, ולאחר מכן למחוק או לשמור לשימוש עתידי, ולאחר מכן להסיר את מעיל באפי לבד.

להציג את פיפטה לאט, כדי שלא לערבב את מעיל באפי חזרה אל הדם. לאחר הסרת מעיל באפי, להוסיף כ -20 מ"ל של בופר פוספט (PBS) ומערבבים בעדינות, recentrifuge. חזור על השלב אחרון. לאחר צנטריפוגה השלישית, הסר את מעיל באפי PBS ונותר, זורקים.

כמו כן ניתן להשתמש בפלזמת היליד במקום PBS אם אתה רוצה לשמור את מאפייני הצבירה של הדם. הקפד לא לערבב כל אפי מעיל או לבןתאי דם לתוך הפלזמה.

  1. קח את תאי דם אדומים (RBCs ניקו) ולהשעות בPBS או פלזמה בריכוזים רצויים (hematocrits). בדקו hematocrits עם microcentrifuge (CritSpin FisherSci, ארה"ב).

דם ב -10 עד 20% המטוקריט צריך להיות קל יותר לדמיין מאשר 40 או 50% (המטוקריט פיסיולוגי). בזרימת הדם, הדם הוא בדרך כלל חצי המטוקריט של מחזור מאקרו, ולכן H = 20 הוא נאות 15.

  1. הוסף fluorescing חלקיקים נותבים בריכוז הרצוי לדגימות הדם. הכלל הוא שיש 10 חלקיקים בחלון מתאם, אשר יכול להיות מחושבים מראש.

לדוגמה, 30 μl של חלקיקים מתווספים ל1 מ"ל של תמיסת דם להגדרה המתוארת בסרטון. לחלופין, את RBCs עצמם יכולים להיות מתויג fluorescently.

  1. בנוסף לכך, להפוך את פתרון כיול עם מים ושפעתorescing חלקיקים. יהיה צורך לכייל את המערכת עם פתרון הניוטונית.

לדוגמה, בעת שימוש במטרת 10X עם ערוץ בקנה המידה של 100 מיקרומטר, ריכוז מתאים הוא 300 μl של חלקיקים מעורבבים עם 15 מ"ל של מים מזוקקים. אפשרות נוספת היא להשתמש בגליצרול מדולל במים מזוקקים לצמיגות של 3cP, שהוא קרוב יותר לצמיגות המאקרו של הדם.

3. מדידות μPIV

  1. בטיחות לייזר: בדקו טמפרטורה ולחות. להרכיב משקפיים בטיחות לייזר מתאימים. סגור את וילון לייזר או להדליק את סימן לייזר על דלת המעבדה על כדי למנוע מאנשים אינם מוגנים מלהיות חשוף.
  2. הליך עם תוכנת דייוויס מוצג בסרטון. לפרטים נוספים עיין במדריך למשתמש של מערכת ספציפית.
  3. לפני שלקח את הנתונים, היקף המצלמה צריך להיות מכויל באמצעות מיקרומטר.
  4. כדי להקטין את התאימות של המערכת, השתמש בכמות הקצרה ביותר של צינורותד המזרק הנוקשה הקטן ביותר האפשרי, כגון מזרק 15 או 50 μl המילטון gastight. כדי להפחית זליגה של דם או צריכת אוויר למערכת, לאטום צינור למזרק ולשבב. ניתן לעשות זאת עם דבק, PDMS או וזלין (נזהר שלא לזהם את הדם).

כדי למלא את מזרק מיקרו עם מים מהולים חלקיקים נותב להשתמש בשיטת backflow מכיוון שעוצמת השמע של מזרק מיקרו היא בדרך כלל הרבה יותר קטנה מאשר הנפח למלא.

השיטה שלנו מורכבת backflow למלא את מזרק מיקרו וערוץ יחד באמצעות הפלט של הערוץ באמצעות מזרק פלסטיק משני. לשם כך, תחילה להסיר את מזרק מיקרו הבוכנה, ואז לדחוף את הנוזל באמצעות מזרק הפלסטיק הקלסית שצורף ליציאה של הערוץ, לאפשר את זרימת הנוזל מתוך מזרק מיקרו עד שכל microbubbles נמצא מחוץ למייקרו מזרק, צינורות או שבב, סוף סוף החזיר את הבוכנה, ונתק את מזרק הפלסטיק. נוכחות oהיעדר R של microbubbles ניתן לאמת עם מיקרוסקופ.

  1. רמת משאבת המזרק כדי להשיג צינורות אופקי. לתכנת את משאבת המזרק לקצב זרימה רצויה.

להיות מודע להשפעות המעבר האפשריות, כמו "אפקט צוואר הבקבוק", למערכת נוקשה או התאימות של המערכת שמשנה את קצב הזרימה בפועל. פעמים אופייניות של מערכת יכולות להיות מוערכות כפונקציה של החומרים והממדים של המערכת. (פרק 2, עמ '77-81, Tabeling, 2005)

  1. הנח שבב על הבמה מיקרוסקופ ולהתחיל את המשאבה. השתמש במים עם חלקיקים לכייל את המערכת לפרופיל המהירות הבינונית ולכייל את dT (הזמן בין תמונות פעמו).

החלקיקים צריכים לנוע בין 5 ל 10 פיקסלים בין מסגרות למתאם טוב 11. כאשר הכיול, להיות זהיר כדי למדוד באמצע הערוץ. מטוס ההתמקדות באמצע יש הגבוה ביותרמהירות 8.

אם להשתמש בערוץ עגול, להיות זהיר של הצללה אפקטים.

תמונת מדגם מוצגת באיור 2, תוך שימוש במצלמת פעם, ואילו בתמונה העליונה היא הדופק הראשון והתמונה התחתונה היא הדופק השני. ניתן לראות באיור שהנקודות הבהירות (fluorescing חלקיקים) הן הכי בפוקוס.

  1. אופציונלי: על ידי לקיחת נתונים בגבהים שונים ניתן לשחזר פרופיל מהירות 3D על ידי הוספת הווקטורים השונים לתמונה אחת. הווידאו מציג את שגרה שפותחה עבור האוטומציה של התהליך.
  2. כאשר לוקחים נתונים עם הדם, למלא את המזרק עם כמות רצויה של דם באותה השיטה כמו מים. לתכנת את משאבת המזרק לקצב הזרימה הרצויה, ולקחת את הנתונים רצויים. דוגמה לתמונות גולמיות המתקבלות מוצגת באיור 2. היזהר של שקיעת RBC גם כן. מילוי במזרק כל ריצה או כלריצה אחרת תפחית את יישוב RBC.
  3. לאחר רכישת תמונות, מתאם הצלב מבוצע על זוגות התמונה לקבל שדות וקטור מהירות בין תמונות. זה חשוב לנו תמונות טובות שיש מתאם טוב. לפני תתאים, אפשר לעשות עיבוד מראש כדי להסיר רעשי רקע.

מתאם הצלב נעשה בין חלונות בתמונות הסמוכות, אשר יכולה להיות מגוונות בגודל ובצורה להשפיע על הקשר. לאחר מתאם צלב, אפשר לעשות את עיבוד תמונה להודעה להסיר וקטורים או חריגים שגויים.

ניתן למצוא תיאור מפורט של האפשרויות הזמינות השונות ודיוקיהם בפיטס et al. (2012b), שבו העיבוד הטוב ביותר עבור דם נמצא כי השיטה של "תמונת חפיפה" עם החלונות הוארך באורך ומיושר עם הזרם . ניתן לעשות פעולות אלו באופן ידני בתכנית כמו MATLAB, או בתוך חבילת תוכנה עם המערכת שלך. תוכנה היא לא חשובה, את המתמטיקה שמאחורי הפעילות היא חשובה יותר וכל פעולה יכולה להשפיע על הדיוק של פרופיל המהירות הסופי.

יכולים להיות בממוצע הווקטורים וכתוצאה מכך השטח מעבר לתעלה כדי להשיג פרופילי מהירות רגעיים, ולאחר מכן שוב בממוצע בזמן כדי להשיג את פרופיל מהירות ממוצע, נציג. Kloosterman et al. (2011) נותן הסבר לשגיאה במדידות μPIV בי עומק השדה הוא גדול. ניתן למצוא דיונים על השגיאה של עיבוד נתונים שהוצג כאן בפיטס et al. (2012b) למדידות ופעמו Chayer et al. (2012) למדידות במהירות הגבוהות.

דוגמאות לפרופילי מהירות מוצגות באיורים 3 ו -4. איור 3 מציג פרופיל מהירות אחת לאמצע של זרימת 10 μl / שעה של RBC ב-H = 10 בערוץ 140 מיקרומטר רחב.

אוהל "> פרופיל יחיד זו מושגת על ידי חישוב ממוצע וקטורי קורלציה מעבר לתעלה כדי לקבל פרופיל מהירות, ולאחר מכן בממוצע בזמן כדי לקבל מדידה מייצגת. במקרה זה, 100 זוגות היו בממוצע בזמן על פני שדה הראייה.

דוגמה לפרופיל המשוחזר 3D נלקח לכיול זרימת מים בערוץ מרובע 100 מיקרומטר עם קצב זרימה מתוכנת של 30 μl / שעה נמצאת באיור 4. באיור 4, את הפרופילים נמדדים במרווחים של 1 מיקרומטר.

  1. אופציונלי: בתמונות המתוארות הגדרת המהירות הגבוהות שניתן לנקוט באותם תנאים על ידי מיתוג מצלמות (ורכישת מערכות מידע). זה יכול להיות שימושי עבור לדמיין את שכבת תא ללא בערוץ, וצבירה לכימות. ניתוח הנתונים הוא שונה במקצת (Chayer et al., 2012).

דוגמאות של תמונות אור לבנות עם ובלי RBC צבירה הן presented באיור 5 ב-H = 20. את התמונות למעלה מראה H = 20 ב-PBS, אשר מסיר את היכולת של RBC לצבירה, בμl 1 / שעה. התמונה התחתונה היא H = 20 בפלזמה האם ברמה של 0.5 μl / שעה. בתמונה התחתונה, הצבירה גלויה.

  1. לסגור את המערכת בצורה בטוחה כאשר הושלמו מדידות. השתמש בנהלי בטיחות לייזר מתאימים עד לייזר מקור כוח הוא לסגור לחלוטין.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בכל הדמויות, זרימה היא משמאל לימין בתמונות גולמיות, ומעלה במהירות פרופילים מחושבים. דוגמה של הנתונים הגולמיים שהושגו בדם במטוקריט H = 10 זורמים ב10 μl / שעה מוצגת באיור 2. הנתונים גולמיים ניתן לחצות-מתואמים ללא כל עיבוד נתונים כדי להשיג פרופילי מהירות. ההשפעה של שיטות עיבוד מראש ועיבוד נתונים נדונה בפיטס, et al., (2012b). דוגמה לפרופילי מהירות כתוצאה מנתונים דומים לאיור 2 בhematorcrit H = 10 וקצב זרימה של 10 μl / שעה מוצגים באיור 3, פרופיל 3D מכיול מים מוצג איור 4. איור 3 ו -4 נכללים סטנדרטי עיבוד נתונים. פרופילי מהירות אלה יכולים לשמש כדי לבצע מדידות כגון מהירות המרבית במרכזו של הערוץ, קצב הזרימה בערוץ, ושיעור הגזירה בקיר לתנאי זרימה שונים, ערוץ שיתוףnfigurations, ופיזיולוגיה. איור 5 נותן דוגמה של תמונה במהירות גבוהה עם ובלי צבירה של RBC. תמונות במהירות גבוהות כמו אלה באיור 5 יכולות לשמש גם כדי לחשב פרופילי מהירות באמצעות מתאם צלב.

איור 1
איור 1. תרשים של μPIV הגדרה שם () מייצג את 140 מיקרומטר ב -40 מיקרומטר ערוצים מלבניים מפוברקים של PDMS עם התזרים נע משמאל לימין וכן (ב) מייצג את המערכת כולה.

איור 2
איור 2. כתוצאה מנתוני תמונה פעמו גולמיים ממערכת μPIV עם H = 10 ב PBS בקצב זרימה מתוכנת של 10μl / שעה (זורם משמאל לימין). תמונה למעלה היא הדופק ראשון.

איור 3
איור 3. כתוצאה מפרופיל מהירות ממערכת μPIV עם H = 10 ב PBS בקצב זרימה מתוכנת של 10 μl / שעה. פרופיל הוא הסתובב כדי להראות זרימה כלפי מעלה.

איור 4
איור 4. דוגמה לפרופיל מהירות 3D משוחזר של כיול מים בערוץ מרובע 100 מיקרומטר עם פרופילים מרובים מפורק 1 מיקרומטר. פרופיל הוא הסתובב כדי להראות זרימה כלפי מעלה. לחץכאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 5
איור 5. דוגמה של תמונות במהירות גבוהות שבי למעלה) היא H = 20 PBS ב μl 1 / שעה (ללא צבירה) ותחתון) היא H = 20 בפלזמה האם ברמה של 0.5 μl / שעה (צבירה). בשתי תמונות הזרימה הוא משמאל לימין .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

שימוש μPIV למדידות זרימת דם בקנה המידה של זרימת הדם יכול לתת תובנה מספר רב של תהליכי הנדסה ביו רפואית, מכאני וכימיים הנוגעים בדבר. חלק מגורמי המפתח לחשבון להוא הצפיפות של RBC עצמם, וצבירת deformability של RBC, הצבירה או התנועה של חלקיקי מייקר fluorescing, ויישובם של RBC בערוצים. כל אלה יכולים להיות אחראים אם ההנחיות הכלליות שהותוו לעיל הן אחריו. יש רשימה בסיסית שכדאי לזכור למדידות טובות באמצעות מערכת זו. קודם כל, לקבוע כמה עמידה היא במערכת או המערכת מוצעת. כדי למזער את העמידה להשתמש בכמות של צינורות הקצר ביותר אפשרי והמזרק הקטן ביותר האפשרי. יש מערכות נוקשות פחות עמידה, אבל יכולות להוביל לצווארי בקבוק. למרות קנה המידה הקטנה של המדידות, כוח המשיכה תשפיע על RBC. שמירה על מזרק, צינורות וערוץ באותו הגובה אניאידיאלי של. שנית, קביעת הריכוזים של ההשעיות. ודא שיש מספיק fluorescing חלקיקים נותבים בפתרון ולא יותר מדי גבוהה של ריכוז של RBC. הגדלת הצפיפות של חלקיקים נותבים של מדגם לא להתגבר על האטימות הגלומות של RBCs. כמות החלקיקים נותב תשפיע על הקשר, אבל יש RBCs רבים מדי תגרום הנוזל האטום ואת החלקיקים נותב קשה לתמונה. המטוקריט הכולל של המדגם חייב להישמר נמוך מספיק שמטוס אמצע הערוץ יכול להיות צילמו בצורה ברורה. זוהי פשרה בין המטוקריט וגודל ערוץ. בעומק גדל, הסכום של RBC בין העדשה והמטוס של מדידה גדל, אפילו בhematorcrit הנמוך. כדי דגימות hematorcrit גבוהות יותר תמונה או ערוצים גדולים יותר, יכולה להיות מנוצל בשיטת "תאי רפאים", ואילו פנים אטומים של RBC מוחלף בנוזל שקוף עבור חלק מRBC (גולדסמית וSkalak, 1975). שלישית, יש לוודא כי microscoPE הוא התמקדות במטוס אמצע הערוץ. ידיעת הגובה של הערוץ המדויק היא חיונית למציאת המטוס באמצע. זכור את הגודל של החלקיקים בגודל של הערוץ, ולחשב את עומק הקשר (DOC) במערכת שלך (Wereley et al., 1998). DOC יכול מאוד להשפיע על הדיוק הנחוץ כדי להשיג במציאת המטוס באמצע. הבדל של מיקרון אחד יכול להשפיע לרעה על הדיוק. ברגע שכמות החלקיקים, בגודל של הערוץ, וDOC נמצאים, ההבדל בזמן בין תמונות פעמו (DT) צריך להיות נחוש. הקפד על 5 עד 10 פיקסלים של תנועה של החלקיקים בין החלונות. התנועה של החלקיקים חייבת להתאים את חלונות המתאם המתוארים בסעיף 3.9. לבסוף, להחליט על השיטה מראש עיבוד, עיבוד או לאחר העיבוד של נתוני וקטור. שיטות רבות זמינות בספרות, אך חלקם מוצלחים יותר מאחרים כשהם מיושמים לדם. השיטה של ​​"תמונה חופפת" היא עו"דised לתזרים דם (פיטס et al., 2012b).

גורם נוסף שיש לזכור הוא השכבה "החופשית תא", שמתועדת היטב בmicrohemodynamics. זהו חוסר RBCs בקיר של הערוץ או הכלי. בבעקבות החלקיקים נותב fluorescing, המשתמש הוא למעשה בעקבות התנועה של הפלזמה. במרכזו של הערוץ או הכלי, המהירות היא מקסימאלי והן יהיו נעים באותה המהירות. בקיר, הפלזמה עדיין תהיה תנועה בזמן תהיה כמה, אם בכלל, RBCs הווה. בקנה המידה שהוצגה כאן עם הגדלה 10X, השכבה ללא תא היא לא measureable אבל בהגדלות גדולות יותר הוא חייב להיות מטופלת. וידאו במהירות גבוהה יאפשר מדידה של עובי השכבה ללא תא.

מסקנות

μPIV שימש במשך hemorheology ומחקרים ביו מאז זמן קצר לאחר התפתחותה. כאשר מוחלים על הדם זורם בקנה המידהשל זרימת הדם, את ההתנהגות המורכבת של הדם יש בחשבון. פרוטוקול למדידות μPIV של דם זורם בmicrochannels הוצג כאן יחד עם עצות להתמודדות עם האופי המורכב של דם. אפשרויות הדמיה כמה הותוו, כולל תמונות, תמונות פעמו במהירות גבוהה ואפשרות 3D, כמו גם מידע לעיבוד הנתונים. בבאמצעות μPIV למחקר microflow דם, ניתן לנתח את ההשפעה של תרופות, מחלות וטיפולים טיפוליים בצורה של פרופיל המהירות. מדידות אלה שימושיים לרפואה המודרנית והנדסה מאז את הספיגה של חומרים מזינים ותרופות היא גזירה תלויה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לNSERC (מדעי טבע והנדסת מועצה של קנדה) למימון, קתרין Pagiatikis על עזרתה בריצות ראשוניות, סורה אבו Mallouh ופרדריק פהים לבדיקת הפרוטוקול, ריצ'רד פרבו של LaVision, Inc לקבלת תמיכה טכנית, וגיא קלוטייה מאוניברסיטת מונטריאול להלוואה של המצלמה במהירות גבוהה DALSA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
poly(dimethylsiloxane) (PDMS), i.e. Sylgard-184 Dow-Corning 3097358-1004
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma Aldrich E9884-100G
poshpate buffered saline (PBS) Sigma Aldrich P5368-10PAK
fluorescing micro particles Microgenics/FisherSci R900
glycerol (OPTIONAL) Sigma Aldrich G6279-500 ml
microcentrifuge, i.e. CritSpin FisherSci 22-269-291
syringe, i.e. 50 μl Gastight Hamilton 80965
camera, i.e. Imager Intense, high speed LaVision, Dalsa Imager Intense
microscope, i.e. MITAS LaVision MITAS
Nd:YAG laser New Wave Research Solo-II
syringe pump, i.e. Nexus3000 Chemyx, Inc. Nexus-3000
flexible tubing, i.e. Tygon FisherSci 14-169-1A
data processing software, i.e. DaVis LaVision DaVis
centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2 Thermo Scientific 004260F

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Santiago, J. G., Wereley, S. T., Meinhart, C. D. A particle image velocimetry system for microfluidics. Experiments in Fluids. 25, 316-319 (1998).
  2. Evaluation of Velocity Measurement in Micro Tube by Highly Accurate PIV Technique. Sugii, Y., Okamoto, K., Nishio, S., Nakano, A. 4th International Symposium on Particle Image Velocimetry (PIV '01), 17-19 Sept. 2001, , 1-5 (2001).
  3. Park, J. S., Choi, C. K., Kihm, K. D. Optically sliced micro-PIV using confocal laser scanning microscopy (CLSM). Exp. Fluids. 37 (1), 105-119 (2004).
  4. King, M. R., Bansal, D., Kim, M. B., Sarelius, I. H. The effect of hematocrit and leukocyte adherence on flow direction in the microcirculation. Ann. of Biomed. Eng. 32 (6), 803-814 (2004).
  5. Lima, R., Wada, S., Tsubota, K., Yamaguchi, T. Confocal micro-PIV measurements of three-dimensional profiles of cell suspension flow in a square microchannel. Meas. Sci. Tech. 17 (4), 797-808 (2006).
  6. Wereley, S. T., Santiago, J. G., Chiu, R., Meinhart, C. D., Adrian, R. J. Micro-resolution particle image velocimetry. Micro- and Nanofabricated Structures and Devices for Biomedical Environmental Applications. 3258, 122-133 (1998).
  7. Meinhart, C. D., Wereley, S. T., Gray, M. Volume illumination for two-dimensional particle image velocimetry. Measurement Science and Technology. 11, 809-814 (2000).
  8. Chayer, B., Pitts, K. L., Cloutier, G. Velocity measurement accuracy in optical microhemodynamics: experiment and simulation. Physiological Measurement. , In Press (2012).
  9. Tabeling, P. Introduction to Microfluidics. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2005).
  10. Olson, M. G., Adrian, R. J. Out-of-focus effects on particle image visibility and correlation in microscopic particle image velocimetry. Experiments in Fluids. 29, S166-S174 (2000).
  11. Wereley, S. T., Meinhart, C. D. Recent advances in micro-particle image velocimetry techniques. Ann. Rev. Fluid Mech. 42, 557-576 (2010).
  12. Williams, S. J., Park, C., Wereley, S. T. Advances and applications on microfluidic velocimetry. Microfluid. Nanofluid. 8 (6), 709-726 (2010).
  13. Chiu, J. J., Chen, S. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: Pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiol. Rev. 91 (1), 327-387 (2011).
  14. Secomb, T. W., Pries, A. R. The microcirculation: Physiology at the mesoscale. J. Physiol. 589 (5), 1047-1052 (2011).
  15. Popel, A. S., Johnson, P. C. Microcirculation and hemorheology. Annual Review of Fluid Mechancis. 37, 43-69 (2005).
  16. Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Angewandte Chemie International Edition England. 37, 551-577 (1998).
  17. Whitesides, G. M., Stroock, A. D. Flexible methods for microfluidics. Physics Today. , 42-48 (2001).
  18. Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated of poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophoresis. 24, 3563-3576 (2003).
  19. Zhou, J., Ellis, A. V., Voelcker, N. H. Recent developments in PDMS surface modifications for microfluidic devices. Electrophoresis. 31, 2-16 (2009).
  20. Pitts, K. L., Abu-Mallouh, S., Fenech, M. F. Contact angle study of blood dilutions on common microchip materials. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. , (2012).
  21. Hovav, T., Yedgar, S., Manny, N., Barshtein, G. Alteration of red blood cell aggregability and shape during blood storage. Transfusion. 39, 277-281 (1999).
  22. Pitts, K. L., Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. F. Micro-particle image velocimetry measurement of blood flow: validation and analysis of data pre-processing and processing methods. Measurement Science and Technology. 23, 105302 (2012).
  23. Kloosterman, A., Poelma, C., Westerweel, J. Flow rate estimation in large depth-of-field micro-PIV. Exp. Fluids. 50 (6), 1587-1599 (2011).
  24. Goldsmith, H. L., Skalak, R. Hemodynamics. Annual Review of Fluid Mechanics. 7, 213-247 (1975).

Tags

Bioengineering גיליון 74 ביופיזיקה הנדסה כימית הנדסת מכונות הנדסה ביו רפואית רפואה אנטומיה פיזיולוגיה ביולוגיה תאית ביולוגיה מולקולרית המטולוגיה תופעות פיסיולוגיות דם Hemorheology המטוקריט מאפייני זרימה מדידת זרימה זרימה להדמיה rheology אדום תאי דם מתאם צלב תזרים דם מיקרו מיקרופלואידיקה microhemorheology זרימת דם velocimetry הדמיה הדמיה
Velocimetry תמונת מיקרו חלקיקים למדידות בפרופיל מהירות של מיקרו זורם דם
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pitts, K. L., Fenech, M.… More

Pitts, K. L., Fenech, M. Micro-particle Image Velocimetry for Velocity Profile Measurements of Micro Blood Flows. J. Vis. Exp. (74), e50314, doi:10.3791/50314 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter