Un metodo semplice di intubazione mouse polmone

Summary

Il presente documento descrive un metodo striaghforward ed efficiente intubazione topi per le misure di funzionalità polmonare o instillazione polmonare, che consente ai topi di recuperare e da studiare in tempi successivi. La procedura prevede una fonte economica di luce a fibre ottiche che illumina direttamente la trachea.

Abstract

Una procedura semplice per intubare i topi per le misure di funzionalità polmonare avrebbe diversi vantaggi in studi longitudinali con un numero limitato di animali o costoso. Uno dei motivi per cui questo non è fatto più di routine è che è relativamente difficile, nonostante sia diversi studi pubblicati che descrivono il modo di realizzarla. In questo lavoro dimostrare una procedura che elimina uno dei principali ostacoli associati a questa intubazione, che di visualizzare la trachea durante l'intero tempo di intubazione. L'approccio utilizza una sorgente di luce a fibre ottiche 0,5 millimetri che serve come un introduttore di dirigere l'intubazione cannula nella trachea mouse. Abbiamo dimostrato che è possibile utilizzare questa procedura per misurare meccanica polmonare in singoli topi in un corso di tempo di almeno parecchie settimane. La tecnica può essere impostato con una spesa relativamente poco e competenze, e può essere realizzato con la formazione di routine relativamente poco. Questo dovrebbe makE 'possibile per qualsiasi laboratorio per eseguire routine out questo intubazione, consentendo studi longitudinali in singoli topi, minimizzando il numero di topi necessari e aumentare la potenza statistica utilizzando ogni topo come proprio controllo.

Introduction

Nel 1999, Brown et al. Pubblicato un documento che descrive un metodo per intubazione del polmone mouse ^1. Tale tecnica ha utilità notevole facendo funzione polmonare ripetizione o lavaggio broncoalveolare nei topi singoli studi longitudinali ^2. Dal momento che la carta originale, ci sono stati diversi altri giornali che hanno descritto i diversi approcci per l'intubazione del mouse ^3-9. Mentre tutti questi metodi possono essere utilizzati con successo, di solito richiedono formazione considerevole o costo. Uno dei problemi principali con l'intubazione come è che con l'approssimarsi delle cannula di intubazione si avvicina l'inserimento trachea in attesa, la stessa cannula blocca la luce e quindi la visualizzazione di dove deve andare. Pertanto, l'inserimento diventa cieco nel momento più critico. In questo articolo mostriamo come eliminare semplice ed economico il problema di visualizzazione, assicurando in tal modo l'intubazione di successo con la formazione relativamente poco oesperienza.

Protocol

1. Preparazione per la procedura di

Si deve prima ottenere e preparare i seguenti elementi:

1. La cannula. Per l'intubazione di 20-35 g di topi, usiamo un 1 o 1,5 pollici di lunghezza, 20 calibro catetere IV (BD Insylte, Sparks, MD o Jelco Optiva, Carlsbad, CA). Un nuovo catetere sterile può essere utilizzato per ciascun topo, cateteri ma può anche essere riutilizzato dopo la sterilizzazione immergendo in etanolo al 70% durante la notte. Sebbene né la faringe, né trachea del mouse è sterili procedure di pulizia adeguate, compreso l'uso di guanti sterili e strumenti, devono essere seguite.
2. Il cavo a fibre ottiche. Usiamo ≈ 70 cm di cavo da 0,5 mm ottico da Edmund Optics, ma la lunghezza non è critica. È importante assicurarsi che la fibra ha il suo bordo smussato, in quanto dopo il taglio del cavo di lunghezza con un rasoio, il bordo rimane relativamente forte, e non ci vuole molto sforzo per perforare la parete tracheale. Tuttavia, is molto facile per lisciare questo bordo tenendo la fibra di circa 2 cm dalla fine e poi facendo piccoli cerchi per pochi secondi con i bordi della punta toccare un pezzo di carta 1000 grana abrasiva (vedi dimostrazione nel video e alla figura 1 Macdonald, et al. ^10). L'altra estremità è inserita attraverso un tappo di gomma. Questo è più facilmente realizzabile dal primo spingendo un ago calibro 18 attraverso il tappo, inserire la fibra ottica attraverso il foro dell'ago, quindi estrarre l'ago. Il tappo di gomma è collegato ad una sorgente alogena da 150 watt di luce (ad esempio NCL-150, Volpi USA, o qualsiasi altra sorgente luminosa o, addirittura inferiore a 150 watt). E 'importante assicurarsi di utilizzare un tappo in gomma di silicone (o materiale resistente al calore), in quanto normale gomma o sughero può bruciare quando si trova così vicino alla fonte di luce calda.

2. Esecuzione della intubazione

1. Vedere le figure 1 e 2. Inserire il cavo in fibra ottica tttraverso un breve pezzo di tubo in gomma siliconica (≈ 0.8 mm ID x 4 mm, Cole-Palmer, EW-96410-13). Tie questo tubo di gomma abbastanza stretto, pur consentendo al cavo in fibra ottica da regolare. Inserimento del tubo al silicone comodamente alla fine Luer della cannula fissa la posizione del cavo in fibra ottica è all'interno della cannula. Regolare la posizione del cavo a fibre ottiche in modo che si estende attraverso la cannula 4 mm ≈ davanti alla punta della cannula.
2. Posizionare il mouse anestetizzato su un supporto verticale, sospesa dai suoi incisivi superiori (Figura 3). La maggior parte dei ricercatori a trovare la migliore visualizzazione con il lato ventrale del mouse affrontare se stessi. Molto delicatamente tirare fuori la lingua e tenere premuto con il pollice e l'indice. Il dito medio è posto tra il collo e il supporto plastico. Trazione sulla linguetta con il dito indice e pollice viene utilizzato per aprire la bocca, e per raddrizzare il percorso intubazione, l'angolo della testa viene regolata con il dito medio dietro il collomostrato in Figura 3.
3. Utilizzando il cavo in fibra ottica da una sorgente di luce e introduttore, spingerlo attraverso le corde vocali visualizzate. Se i cavi non sono visibili, delicatamente tirare con forza sulla lingua con il dito medio come supporto. Una volta inserito, far avanzare la cannula ≈ 5 mm più. Quindi, non essendo molto attento a spostare la cannula, ritirare il cavo in fibra ottica. Giacciono il mouse e fissare la cannula con un pezzo di nastro e sostenere il mozzo cannula su un pezzo di plastilina (modellazione argilla), come mostrato in Figura 4.
4. La procedura del passo 3 non può essere facilmente insegnato o anche dimostrato, poiché è un'operazione da solo. Tuttavia, regolazioni fini della trazione sulla lingua e il sostegno dietro la testa quasi tutti coloro che provare questo presto trovare il modo giusto per posizionare il mouse per visualizzare le corde vocali.

Representative Results

Come una valutazione del metodo, abbiamo utilizzato quattro 20 settimane vecchio maschio topi BALB / c con peso medio (± SEM) di 27,7 ± 0,40 g. Essi sono stati studiati su cinque settimane consecutive, in cui la resistenza polmonare è stata misurata usando un sistema come descritto in precedenza ^11. Ogni mouse è stato anestetizzato con ketamina (100 mg / g di peso corporeo) e xilazina (15 mg / g di peso corporeo) in soluzione salina tramite iniezione IP. Sono stati quindi intubati come descritto sopra. Se c'è qualche dubbio se la cannula è la trachea e non nell'esofago, questo può essere convalidato utilizzando uno specchietto dentale. Tenere lo specchio in un congelatore, e quando necessario posto davanti al mozzo Luer del catetere. Se il catetere è in trachea, il respiro esalato formerà una condensa visibile sullo specchio.

Dopo l'intubazione, abbiamo poi collegato i topi al ventilatore e resistenza polmonare misurata sono stati ventilati I topi con una frequenza di 2 Hz e il volume corrente di 0,2 ml, e la resistenza respiratoria za è stata misurata con il metodo occlusione inspiratoria come precedentemente descritto ^11. Figura 5 mostra cinque misurazioni settimanali in ciascuno dei quattro topi. Riproducibilità è eccellente, dimostrando che, almeno a intervalli settimanali, non vi è alcun effetto della precedente misura. Ciò è coerente con le valutazioni precedentemente riportati settimanali della meccanica e dei profili delle cellule BAL nei singoli topi BALB / c con una procedura più difficile e potenzialmente traumatica ^2.

Figura 1. Oggetti immagine mostrano utilizzato per intubazione. Il cavo a fibre ottiche è mostrato inserito in un tappo di gomma di silicone, con un piccolo pezzo di tubo di gomma di silicone legato vicino all'estremità opposta. Un tappo di gomma siliconica è collegata alla fonte di luce, come mostrato in Figura 2.

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Figura 2. Immagine che mostra tappo di gomma collegato alla sorgente di luce con altra estremità del cavo a fibre ottiche inserito attraverso la cannula di intubazione. Un semplice supporto stand per tenere il mouse durante l'intubazione viene mostrato anche sulla sinistra.

Figura 3. Due prospettive che illustrano la posizione del mouse preparato per l'intubazione.

Figura 4. Questa figura mostra un mouse intubati pronta per la ventilazione. Il nastro intorno alla bocca aiuta a mantenere la cannula di muoversi. Un piccolo pezzo di plastilina (modellazione argilla) fornisce un riposo conveniente per fissare il mozzo cannula per il collegamento al ventilatore.

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Figura 5. Resistenza polmonare da ciascuno di 4 topi (in diversi colori) misurato a 5 intervalli settimanali.

Figura 6. Mostrato è un record grafico della pressione delle vie aeree in un mouse intubati dopo iniezioni di 0,5, 0,75 e 1 ml. Ogni volume si è tenuta per 20-40 secondi, poi rilasciato prima di allora l'inflazione prossimo. Anche se ci può essere una perdita molto lenta dopo il recupero rilassamento stress, questo avrebbe effetti trascurabili sul normale ventilazione o di valutazione delle dinamiche misurazioni della funzionalità polmonare. Clicca qui per ingrandire la figura .

Discussion

La procedura qui descritta presenta diversi vantaggi. Prima l'apparecchiatura è semplice e relativamente poco costoso .. La fabbricazione del dispositivo non richiede utensili speciali o attrezzature costose. L'uso di un catetere che presenta anche la sorgente luminosa significa che non si perde di vista dell'apertura tracheale come introduttore avvicina l'apertura tracheale. L'uso di un introduttore 0,5 millimetri serve anche a minimizzare il trauma che potrebbe verificarsi con un inserimento iniziale di una cannula più grande. Notiamo qui che una sonda simile ottica è disponibile da un fornitore commerciale (Braintree scientifico, Braintree, MA). Il loro dispositivo utilizza una sorgente di luce batteria alimentato e fibra ottica.

Nel presente lavoro, abbiamo testato la procedura con misurazione ripetizione di meccanica polmonare, ma intubazione quali potrebbe facilmente essere utilizzato per infondere chimici o cellule nel polmone, come è stato descritto per la consegna ripetuta di LPS ^12. Inoltre, unrelazione precedente con una procedura di intubazione più primitiva descritta la capacità di fare BAL ripetute nei topi singoli ^2, e questo sarebbe molto più semplicemente realizzato con l'approccio nuovo intubazione.

In pratica, il metodo qui descritto è stato facilmente insegnato a borsisti, studenti e tecnici che non avevano mai tentato intubazione. In realtà, durante le sessioni di formazione di gruppo, alcuni degli studenti diventano sufficientemente abili per insegnare poi alcuni degli altri studenti che non avevano ancora provato. Questo metodo ha quindi un notevole vantaggio in quanto minimizza il numero di topi necessarie per la pratica e dovrebbe consentire danni minimi in studi ripetuti.

Nel fare l'intubazione, ci sono diversi problemi pratici che devono essere menzionati. È importante essere più delicata possibile con la retrazione della lingua nella prima apertura della bocca. Se pinza non protetti sono usati è facile ferisca la lingua, e questo può lead alla morte del mouse. In prima imparare a fare il intubazione, la cosa più importante è l'uso del dito dietro il collo per regolare l'angolo della testa per consentire la visualizzazione dell'apertura tracheale. Se fatto correttamente, con trazione sufficiente sulla lingua, le corde vocali può essere visto facilmente. È questo passaggio visualizzazione iniziale che di solito richiede più tempo, in quanto una volta l'apertura tracheale è visto, è relativamente semplice da inserire il cavo in fibra e catetere endovenoso. Inizialmente se c'è un problema con questa visualizzazione, il tirocinante è spesso non tirare la linguetta con forza sufficiente. L'aumento di questo tiro leggermente si raddrizzare il percorso di visualizzazione in modo che le corde vocali può essere visto. Hamacher, et al., Descritto un sistema unico intubazione con ⁴ visualizzazione microscopica. Il loro video online di questo intubazione è eccellente e molto istruttivo, anche se i mezzi di posizionamento della testa e del collo non è del tutto chiaro il video e la figura. Mentre il sistema descrivono sembra funzionare molto efficiente, richiede un microscopio dedicato. Utilizzando il sistema e la procedura che descriviamo, le corde vocali ed apertura tracheale può essere visto ad occhio nudo. Nella nostra descrizione originale di questo metodo ^10, abbiamo descritto un procedimento per aggiungere un cono alla cannula di intubazione. Questo cono cunei nella faringe del mouse stretto e impedisce la cannula venga inserito troppo in profondità. Abbiamo trovato che questo cuneo è utile per insegnare agli studenti la procedura, poiché è molto facile inserire la cannula dalla carena o oltre, eventualmente penetrando attraverso una parete delle vie aeree. Semplici istruzioni per fabbricare il cuneo può essere trovato nel documento. Tuttavia, una volta che qualcuno viene a sapere la procedura abbastanza bene e dove posizionare la cannula, questo adattamento non è più necessaria.

Infine, dobbiamo notare che abbiamo solo testato questa procedura con il G-20 cannula in topi adulti giovani e pochi ceppi. In questa situazione, si hanno confermato che la trachea e le corde vocali può fornire una tenuta molto buona intorno alla cannula con pressioni di ventilazione normali, cioè vi è perdita d'aria minima fuori del polmone con ventilazione meccanica. Figura 6 mostra i risultati di incannulazione su una C57BL / 6 topo, dove sono stati utilizzati tre boli aria crescenti (0,5, 0,75 e 1 ml) per gonfiare i polmoni. E 'chiaro da questa figura di perdite di pressione sono minime ad una pressione delle vie aeree di almeno 15 cm H ₂ O. Tuttavia, se si utilizza sostanzialmente topi più giovani o più anziani, o nei topi da ceppi con una anatomia del polmone diversa, allora sarebbe saggio per confermare che non vi siano perdite minime. Se ci sono, la procedura può quindi richiedere l'uso di una cannula di dimensioni diverse.

In sintesi, la procedura di intubazione descrivere qui è poco costoso da produrre e facile da usare, e dovrebbe consentire la maggior parte dei ricercatori e tecnici di laboratorio per imparare rapidamente a successointubare topi con esperienza relativamente poco.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Intubation cannula	BD Insylte, Sparks, MD or Jelco Optiva, Carlsbad, CA		1-in.-long, 20-gauge intravenous (IV) catheter
Fiber-optic cable	Edmund Optics, Barrington, NJ	#NT02-542	Approximately 2-ft length of 0.5-mm optical fiber (Communication grade plastic fiber). The edge of the fiber end that is inserted into the trachea should be gently rounded by holding the fiber ≈2 cm from the end and then making small circles while dragging the tip for a few seconds on 1,000-grit emory paper.
Light Source	Volpi	NCL-150	Although we use a 150-W halogen light source, any equivalent light source, even with much lower wattage can be used.
Aluminum tube			One inch O.D., with 1/16 inch wall. This may need to be change to fit whichever light source is used.
Rubber stopper			A #4 rubber stopper fits the 1 inch tube.
Small silicone rubber tube	Cole-Palmer	EW-96410-13	A ≈1.5 cm piece of silicone rubber tubing (0.8 inner diameter, 4 mm outer diameter)
Angled support stand			Ours is constucted from plexiglass, but any material to which a thread or wire can be affixed to hold the mouse at an almost vertical angle can be use.