En enkel metod för mus Lung Intubation

Summary

Detta dokument beskriver en striaghforward och effektiv metod för intuberande möss för lungfunktion mätningar eller pulmonell instillation som gör att mössen att återhämta sig och studeras vid senare tillfällen. Förfarandet innebär en billig fiberoptisk ljuskälla som direkt belyser luftstrupen.

Abstract

En enkel procedur för att intubera möss för lungfunktion mätningar skulle ha flera fördelar i longitudinella studier med ett begränsat antal eller dyra djur. En av anledningarna till att det inte görs mer rutinmässigt är att det är relativt svårt, trots att det finns flera publicerade studier som beskriver olika sätt att uppnå det. I detta dokument visar vi ett förfarande som eliminerar en av de stora hindren i samband med denna intubationen, som visualisera luftstrupen under hela tiden för intubering. Det tillvägagångssätt använder en 0,5 mm fiberoptiskt ljuskälla som fungerar som ett införingsorgan för att styra intuberingskanyl in musen luftstrupen. Vi visar att det är möjligt att använda detta förfarande för att mäta lungmekanik i individuella möss under ett tidsförlopp för åtminstone flera veckor. Tekniken kan ställas in med relativt liten kostnad och expertis, och det kan rutinmässigt genomföras med relativt lite utbildning. Detta bör makE det möjligt för alla laboratorier att rutinmässigt utföra denna intubation, varigenom longitudinella studier i enskilda möss, vilket minimerar antalet nödvändiga möss och öka den statistiska strömmen med varje mus som sin egen kontroll.

Introduction

Under 1999, publicerade Brown et al. Ett dokument som beskriver en metod för intubation av muslunga ^1. En sådan teknik har stor nytta av att göra upprepade lungfunktion eller bronkoalveolär lavage i enskilda möss i longitudinella studier ^2. Sedan den ursprungliga papper har det funnits flera andra tidningar som har beskrivit olika metoder för mus intubering ^3-9. Även om alla dessa metoder kan användas med framgång, kräver de oftast stora utbildning eller kostnader. En av de viktigaste frågorna med sådan intubering är att eftersom strategierna intuberingskanyl närmar luftstrupen väntan införing blockerar kanylen själv ljuset och därmed visualisering av där den måste gå. Sålunda, blir insättningen blinda vid den mest kritiska tiden. I denna artikel visar hur man enkelt och billigt eliminera detta visualisering problem och därigenom säkerställa framgångsrika intubering med relativt liten utbildning ellererfarenhet.

Protocol

1. Förberedelser inför förfarande

Man måste först få och förbereda följande:

1. Kanylen. För intubering av 20-35 g möss använder vi en 1 eller 1,5 tum lång, 20 gauge intravenös kateter (BD Insylte, Sparks, MD eller Jelco Optiva, Carlsbad, CA). En ny steril kateter kan användas för varje mus, men katetrar kan också återanvändas efter sterilisering genom blötläggning i 70% etanol över natten. Även om varken svalget eller luftstrupen av musen är sterila korrekta renlighet förfaranden, inbegripet användning av sterila handskar och instrument bör följas.
2. Den fiberoptiska kabeln. Vi använder ≈ 70 cm 0,5 mm optisk kabel från Edmund Optics, men längden är inte kritisk. Det är viktigt att se till att fibern har sin kant utjämnade, sedan efter kapning av kabeln till rätt längd med en rakkniv, är kanten lämnas relativt skarp, och det tar inte mycket ansträngning för att tränga igenom trakeala väggen. Men jag detär väldigt lätt att jämna denna kant genom att hålla fibern ca 2 cm från änden och sedan göra små cirklar under några sekunder med kanterna spetsen vidrör en bit av 1000 grit sandpapper (se demonstrationen i videon och figur 1 i Macdonald, et al. ^10). Den andra änden är införd genom en gummipropp. Detta är enklast genom att först trycka en 18-gauge nål genom proppen, insättning av den optiska fibern genom nålhålet, sedan dra nålen. Gummiproppen är ansluten till en 150 watt halogenlampa källa (t.ex. NCL-150, Volpi USA, eller någon annan eller ljuskälla, ännu mindre än 150 watt). Det är viktigt att se till att använda en stopp gjord av silikongummi (eller annat värmetåligt material), eftersom vanlig gummi eller kork kan brinna när den ligger så nära den varma ljuskällan.

2. Utföra Intubation

1. Se figur 1 och 2. Sätt fiberoptisk kabel through en kort bit av silikongummislang (≈ 0,8 mm ID x 4 mm YD, Cole-Palmer, EW-96.410-13). Knyt denna gummislang ganska tight, men ändå låta den fiberoptiska kabeln som ska justeras. Sätta silikonröret tätt i Luer-änden av kanylen fixerar den fiberoptiska kabelns läge inuti kanylen. Justera positionen av den fiberoptiska kabeln så att den sträcker sig genom kanylen ≈ 4 mm framför kanylspetsen.
2. Placera sövda musen på en vertikalt stöd, upphängd i dess övre framtänderna (Figur 3). De flesta forskare att hitta den bästa visualisering med den ventrala sidan av musen vänd själva. Mycket försiktigt dra ut tungan och håll med tummen och pekfingret. Långfingret placeras mellan halsen och plast stöd. Dragkraft på tungan med pekfingret och tummen används för att öppna munnen, och för att räta ut intuberingen banan, är vinkeln hos huvudet justeras med långfingret bakom nackenvisas i figur 3.
3. Använda den fiberoptiska kabeln som en ljuskälla och införaren, driva igenom de visualiserade stämbanden. Om kablarna inte syns genom att försiktigt dra hårdare på tungan med långfingret som stöd. När isatt framåt kanylen ≈ 5 mm längre. Sedan är mycket noga med att inte röra kanylen, dra den fiberoptiska kabeln. Lie musen nedåt och säkra kanylen med en bit tejp och stödja kanylen navet på en bit Modellera (modelleran), såsom visas i figur 4.
4. Förfarandet i steg 3 kan inte enkelt lärs ut eller ens visat, eftersom det är en solo operation. Men genom subtila justeringar av dragkraft på tungan och stöd bakom huvudet nästan alla som försöker här hitta snart det rätta sättet att placera musen för att visualisera stämbanden.

Representative Results

Som en utvärdering av metoden, använde vi fyra 20 veckor gamla BALB / c möss med medelvikt (± SEM) av 27,7 ± 0,40 gram. De studerades på fem på varandra följande veckor, där lungmotstånd uppmättes med användning av ett system såsom tidigare beskrivits ^11. Varje mus bedövades med ketamin (100 ug / g kroppsvikt) och xylazin (15 pg / g kroppsvikt) i saltlösning via IP-injektion. De därefter intuberades såsom beskrivits ovan. Om det finns några tvivel om huruvida kanylen är i luftstrupen och inte i matstrupen, kan detta valideras med hjälp av en liten tand spegel. Förvara spegeln i en frys, och vid behov plats framför Luer navet hos katetern. Om katetern är i luftstrupen, kommer utandningsluft bilda en synlig kondensat på spegeln.

Efter intubering, ansluten vi sedan mössen till ventilatorn och uppmätta lungresistens Mössen ventilerades med en hastighet av 2 Hz och tidalvolym av 0,2 ml, och respiratorisk resis avståndet mättes genom den inspiratoriska ocklusion metoden som tidigare beskrivits ^11. visar 5 vecka mätningarna i varje av de 4 mössen Figur 5. Reproducerbarhet är utmärkt, vilket visar att, åtminstone med en veckas intervall, finns det ingen effekt av den tidigare mätningen. Detta överensstämmer med tidigare rapporterade vecka bedömningar av mekanik och BAL profiler cell i enskilda BALB / c möss med en svårare och potentiellt traumatiska förfarande ^2.

Figur 1. Bild som visar artiklar som används för intubation. Den fiberoptiska kabeln visas införd i en silikongummi propp, med en liten bit av silikongummislang bundet nära den motsatta änden. En silikongummi propp är fäst till ljuskällan som visas i Figur 2.

">
Figur 2. Bild som visar gummipropp ansluten till ljuskällan med andra änden av den fiberoptiska kabeln införd genom intubationskanyl. En enkel stöd stå att hålla musen under intubering visas också till vänster.

Figur 3. Två perspektiv som visar läget för musen klar för intubering.

Figur 4. Denna figur visar en intuberade mus redo för ventilation. Bandet runt munnen hjälper till att hålla kanylen från att flytta. En liten bit av Modellera (modelleran) ger ett bekvämt vila för att säkra kanylen nav för anslutning till ventilatorn.

ontent "fo: keep-together.within-page =" alltid ">
Figur 5. Lungmotstånd från vardera av 4 möss (i olika färger) mätt vid 5 veckors intervall.

Figur 6. Visas är ett diagram rekord av luftvägstryck i en intuberade mus efter injektioner av 0,5, 0,75 och 1 ml. Varje volym hölls för 20-40 sekunder, sedan släpptes innan dess nästa inflationen. Även om det kan vara en mycket långsam läcka efter spänningsrelaxation återhämtning, skulle det ha försumbar effekt på normal ventilation eller bedömning av dynamiska lungfunktion mätningar. Klicka här för att se större bild .

Discussion

Förfarandet beskrivet här har flera fördelar. Först anordningen är enkel och relativt billig .. Tillverkningen av anordningen kräver inte några speciella verktyg eller dyrbar utrustning. Användningen av en kateter införs som också är ljuskällan innebär att man aldrig förlorar ur sikte trakeala öppning som införingsanordningen närmar sig trakeala öppningen. Användningen av en 0,5 mm införare tjänar även till att minimera trauma som kan uppstå med en initial insättning av en större kanyl. Vi noterar här att en liknande optisk sond finns tillgänglig från en kommersiell leverantör (Braintree Scientific, Braintree, MA). Deras enhet använder en batteridriven ljuskälla och optisk fiber.

I föreliggande arbete, testade vi proceduren med upprepad mätning av lungmekanik, men sådan intubering skulle lika lätt användas för att ingjuta kemikalier eller celler in i lungan, såsom har beskrivits för upprepad leverans av LPS ^12. Dessutom, enföregående rapport med en mer primitiv intubering som beskrivs möjligheten att göra upprepade BAL i enskilda möss ^2, och detta skulle vara mycket enklare åstadkommas med den nya intubation metoden.

I praktiken har den här beskrivna metoden har lätt lära sig medmänniskor, studenter och tekniker som aldrig försökt intubering. Faktum är att under sessioner gruppträning, några av eleverna blir tillräckligt kompetenta att sedan lära några av de andra studenter som ännu inte provat det. Denna metod har således en avsevärd fördel eftersom det minimerar antalet möss som behövs för praxis och bör tillåta minimal skada i upprepade studier.

Genom att göra det intubation, finns det flera praktiska frågor som bör nämnas. Det är viktigt att vara så mild som möjligt med tillbakadragning av tungan i den inledande öppningen av munnen. Om oskyddade pincett används är det lätt att skada tungan, och detta kan lead till död mus. I det första lära att göra intubering, är det viktigaste användningen av fingret bakom nacken för att justera vinkeln på huvudet för att möjliggöra visualisering av trakeala öppningen. När du gjort korrekt, med tillräcklig dragkraft på tungan, kan stämbanden lätt ses. Det är detta första steg visualisering som vanligtvis kräver mest tid, eftersom när väl den trakeala öppningen ses, är det relativt enkelt att införa fiberkabeln och intravenös kateter. Inledningsvis om det finns ett problem med denna visualisering är praktikanten ofta inte dra på tungan med tillräcklig kraft. Öka denna Dra lätt att räta ut visualisering sökvägen så stämbanden kan ses. Hamacher, et al. Beskrivna ett unikt intubering system med mikroskopisk visualisering ^4. Deras online video av denna intubation är utmärkta och mycket lärorikt, även om medel för att placera huvud och hals är inte helt klart VIDeo och figur. Medan systemet de beskriver verkar fungera mycket effektivt krävs det en särskild mikroskop. Med användning av systemet och förfarandet vi beskriver, stämbanden och trakeal öppning kan ses med blotta ögat. I vår ursprungliga beskrivning av denna metod ^10, beskrev vi ett förfarande för att lägga till en kon i intubationskanyl. Denna kon kilar in i smala mus svalget och förhindrar kanylen från att införas alltför djupt. Vi har funnit att denna kil är användbar undervisa elever förfarandet, eftersom det är mycket lätt att sätta in kanylen till carina eller bortom, möjligen tränger genom en luftväg vägg. Enkla instruktioner för att tillverka kilen finns i det dokumentet. Men när någon lär proceduren tillräckligt väl och var att placera kanylen är denna anpassning inte längre behövs.

Slutligen bör vi notera att vi bara har testat denna procedur med 20 g kanylen i unga vuxna möss av några stammar. I denna situation, har vi bekräftat att luftstrupen och stämbanden kan ge en mycket god tätning runt kanylen med normala ventilation tryck, dvs det finns minimalt luftläckage ut ur lungan med mekanisk ventilation. Figur 6 visar resultat från på kanylering i en C57BL / 6 mus, där 3 ökande luft bolusdoser (0,5, 0,75, och 1 ml) användes för att blåsa upp lungorna. Det framgår av denna figur än tryckläckage är minimala för en luftvägstryck på minst 15 CMH ₂ O. Men om man använder betydligt yngre eller äldre möss, eller möss från stammar med olika lunga anatomi, skulle det vara klokt att bekräfta att det finns minimala läckor. Om det finns, kan förfarandet behöva sedan användning av en annan storlek kanyl.

Sammanfattningsvis är det intubering förfarandet beskrivs här billig att tillverka och enkel att använda, och det bör göra det möjligt flesta utredare och laboratorietekniker för att snabbt lära sig att framgångsriktintubera möss med relativt liten erfarenhet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Intubation cannula	BD Insylte, Sparks, MD or Jelco Optiva, Carlsbad, CA		1-in.-long, 20-gauge intravenous (IV) catheter
Fiber-optic cable	Edmund Optics, Barrington, NJ	#NT02-542	Approximately 2-ft length of 0.5-mm optical fiber (Communication grade plastic fiber). The edge of the fiber end that is inserted into the trachea should be gently rounded by holding the fiber ≈2 cm from the end and then making small circles while dragging the tip for a few seconds on 1,000-grit emory paper.
Light Source	Volpi	NCL-150	Although we use a 150-W halogen light source, any equivalent light source, even with much lower wattage can be used.
Aluminum tube			One inch O.D., with 1/16 inch wall. This may need to be change to fit whichever light source is used.
Rubber stopper			A #4 rubber stopper fits the 1 inch tube.
Small silicone rubber tube	Cole-Palmer	EW-96410-13	A ≈1.5 cm piece of silicone rubber tubing (0.8 inner diameter, 4 mm outer diameter)
Angled support stand			Ours is constucted from plexiglass, but any material to which a thread or wire can be affixed to hold the mouse at an almost vertical angle can be use.