Um método simples de intubação Lung Rato

Summary

Este artigo descreve um método striaghforward e eficiente de entubar ratos para medições de função pulmonar ou instilação pulmonar, que permite que os ratos a se recuperar e ser estudado em momentos posteriores. O procedimento envolve uma fonte de luz de fibra óptica de baixo custo que ilumina diretamente a traquéia.

Abstract

Um procedimento simples para entubar ratos para medições de função pulmonar teria várias vantagens em estudos longitudinais com um número limitado de animais ou caro. Uma das razões que isso não é feito rotineiramente mais é que é relativamente difícil, apesar de haver vários estudos publicados que descrevem formas de o conseguir. Neste artigo é demonstrar um procedimento que elimina um dos principais obstáculos associados com este intubação, que de visualizar a traqueia durante todo o tempo de intubação. A abordagem utiliza uma fonte de luz de 0,5 milímetros de fibra óptica, que serve como um introdutor para dirigir a cânula de intubação para dentro da traqueia do rato. Mostra-se que é possível usar este procedimento para medir a mecânica pulmonar em ratos individuais ao longo de um curso de tempo de pelo menos várias semanas. A técnica pode ser configurado com despesa relativamente pequena e experiência, e pode ser realizado rotineiramente com relativamente pouco treinamento. Isto deve makÊ possível para qualquer laboratório para realizar rotineiramente este intubação, permitindo assim estudos longitudinais em ratinhos individuais, minimizando assim o número de ratinhos necessários e aumentar o poder estatístico usando cada rato como seu próprio controlo.

Introduction

Em 1999, Brown et al. Publicado um artigo científico que descreve um método para intubação de pulmão de rato ^1. Tal técnica tem utilidade considerável em fazer função de repetição pulmonar ou lavado bronco-alveolar em camundongos individuais em estudos longitudinais ^2. Desde que o papel original, houve vários outros documentos que descrevem abordagens diferentes para intubação rato ^3-9. Embora todos estes métodos podem ser utilizados com sucesso, eles normalmente requerem formação considerável ou custo. Um dos principais problemas para intubação tal é que, como as abordagens cânula de intubação se aproxima a inserção traquéia pendente, a cânula própria bloqueia a luz e, portanto, a visualização de onde ele precisa ir. Assim, a inserção se torna cego no momento mais crítico. Neste artigo vamos mostrar como simples e barata eliminar este problema de visualização, garantindo assim a intubação bem sucedida com relativamente pouco treinamento ouexperiência.

Protocol

1. Preparando-se para o Procedimento

Deve-se primeiro obter e preparar os seguintes itens:

1. A cânula. Para intubação de 20-35 ratinhos g, usamos uma polegada de 1 ou 1,5 de comprimento, 20 gauge cateter IV (BD Insylte, Sparks, MD ou Jelco Optiva, Carlsbad, CA). Um novo cateter estéril pode ser usada para cada rato, mas cateteres também pode ser reutilizado depois da esterilização por imersão em etanol a 70% durante a noite. Embora nem faringe nem traqueia do mouse é estéreis procedimentos adequados de limpeza, incluindo a utilização de luvas estéreis e instrumentos, devem ser seguidas.
2. O cabo de fibra ótica. Usamos ≈ 70 cm de 0,5 mm de cabo óptico de Edmund Optics, mas o comprimento não é crítica. É importante para garantir que a fibra tem a sua aresta suavizada, uma vez que após o corte do cabo de comprimento com uma lâmina de barbear, a borda é deixada relativamente acentuada, e não é preciso muito esforço para perfurar a parede traqueal. No entanto, is muito fácil de suavizar esta borda, segurando a fibra de cerca de 2 cm da extremidade e, em seguida, fazendo pequenos círculos durante alguns segundos, com as extremidades da ponta de tocar um pedaço de papel de lixa 1000 grit (ver demonstração no vídeo e na Figura 1 de Macdonald et al. ^10). A outra extremidade é introduzido através de uma rolha de borracha. Isto é mais facilmente conseguido, em primeiro lugar empurrando uma agulha de calibre 18 através da tampa, a inserção da fibra óptica através do furo da agulha, depois de retirar a agulha. A rolha de borracha é ligada a uma fonte de halogénio de 150 watt de luz (por exemplo, NCL-150, Volpi EUA, ou qualquer outra fonte de luz, ou, ainda menos do que 150 Watts). É importante certificar-se de usar uma tampa de borracha de silicone (ou material de calor resistente), uma vez que a borracha comum ou de cortiça pode queimar quando localizado tão perto da fonte quente luz.

2. Realizar a intubação

1. Ver Figuras 1 e 2. Insira cabo de fibra óptica through um pequeno pedaço de tubo de borracha de silicone (≈ 0,8 milímetros ID x 4 mm de diâmetro externo, Cole-Palmer, EW-96410-13). Amarre este tubo de borracha bastante apertado, enquanto ainda permitindo que o cabo de fibra óptica a ser ajustado. Inserir o tubo de silicone firmemente na extremidade da cânula Luer corrige a posição do cabo de fibra óptica no interior da cânula. Ajustar a posição do cabo de fibra óptica de modo que ela se estende através da cânula ≈ 4 mm à frente da ponta da cânula.
2. Colocar o rato anestesiado num suporte vertical, suspenso pelos seus incisivos superiores (Figura 3). A maioria dos investigadores encontrar a melhor visualização com o lado ventral do rato enfrentam-se. Muito gentilmente puxar a língua para fora e segure com o polegar eo indicador. O dedo médio é colocada entre o pescoço e o suporte de plástico. Tração da língua com o dedo indicador e polegar é utilizado para abrir a boca, e para endireitar o caminho de intubação, o ângulo da cabeça é ajustada com o dedo médio por trás do pescoçomostrado na Figura 3.
3. Utilizando o cabo de fibra óptica como uma fonte de luz e do introdutor, empurrá-lo através das cordas vocais visualizadas. Se os cabos não são visíveis, puxe mais sobre a língua usando o dedo médio como apoio. Quando inserido, o avanço da cânula ≈ 5 mm mais. Então, não sendo muito cuidadoso para mover a cânula, retire o cabo de fibra óptica. Deite-se o rato para baixo e segurar a cânula com um pedaço de fita adesiva e apoiar o cubo da cânula sobre um pedaço de plastilina (argila de modelagem), como mostrado na Figura 4.
4. O processo no passo 3 não pode ser facilmente ensinado ou mesmo demonstrada, uma vez que é uma operação de solo. No entanto, por ajustes sutis da tração sobre a língua e com o apoio atrás da cabeça quase todos que tentar isso em breve encontrar o caminho certo para posicionar o mouse para visualizar as cordas vocais.

Representative Results

Como uma avaliação do método, utilizou-se quatro 20 semanas de idade BALB / c fêmeas com peso médio (± SEM) de 27,7 ± 0,40 g. Eles foram estudados em cinco semanas consecutivas, em que a resistência pulmonar foi medida utilizando um sistema tal como foi previamente descrito ^11. Cada rato foi anestesiado com cetamina (100 mg / g de peso corporal) e xilazina (15 mg / g de peso corporal) em solução salina por injecção IP. Eles foram então entubados, como descrito acima. Se houver alguma dúvida sobre se a cânula estiver na traqueia e o esófago não, este pode ser validado usando um pequeno espelho dental. Manter o espelho num congelador e, quando necessário, em lugar da frente do cubo do cateter Luer. Se o cateter está na traqueia, o ar exalado vai formar um condensado visível no espelho.

Após a intubação, então, conectado os ratos para o ventilador e a resistência pulmonar medido Os ratos foram ventilados com uma taxa de 2 Hz e volume corrente de 0,2 ml, e resistência respiratória tância foi medida pelo método de oclusão inspiratória como previamente descrito ^11. Figura 5 mostra 5 medições semanais em cada um dos 4 ratinhos. A reprodutibilidade é excelente, mostrando que, pelo menos, a intervalos semanais, não há nenhum efeito da medição anterior. Isto é consistente com os previamente relatados avaliações semanais de mecânica e perfis de células individuais em LBA ratinhos BALB / c com um processo mais difícil e potencialmente traumática ^2.

Figura 1. Imagem mostrando itens utilizados para intubação. O cabo de fibra óptica é mostrada inserida uma rolha de borracha de silicone, com um pequeno pedaço de tubo de borracha de silicone atado, perto da extremidade oposta. Uma rolha de borracha de silicone é ligado à fonte de luz, como mostrado na Figura 2.

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Figura 2. Imagem mostrando tampa de borracha ligada a fonte de luz com outra extremidade do cabo de fibra óptica inserida através da cânula de intubação. Um suporte simples pé para segurar o rato durante a intubação também é mostrado à esquerda.

Figura 3. Duas perspectivas mostrando a posição do mouse preparado para intubação.

Figura 4. Esta figura mostra um rato intubado pronto para ventilação. A fita em torno da boca ajuda a manter a cânula de se mover. Um pequeno pedaço de plastilina (argila de modelagem) fornece um resto conveniente para fixar o cubo de uma cânula para a conexão com o ventilador.

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Figura 5. Resistência pulmonar a partir de cada um dos quatro ratinhos (em cores diferentes), medida a 5 intervalos semanais.

Figura 6. Mostrado é um registro gráfico de pressão das vias aéreas em um rato intubado após injeções de 0,5, 0,75 e 1 ml. Cada volume foi mantido por 20-40 segundos, em seguida, liberado antes, então a inflação próxima. Embora possa haver um vazamento muito lento após a recuperação relaxamento de tensão, o que teria efeito insignificante sobre a ventilação normal ou avaliação de dinâmicas medidas de função pulmonar. Clique aqui para ver maior figura .

Discussion

O procedimento aqui descrito tem várias vantagens. Primeiro, o aparelho é simples e relativamente barata .. A fabricação do aparelho não necessita de quaisquer ferramentas especiais ou equipamento dispendioso. A utilização de um cateter que apresenta também é a fonte de luz quer dizer que nunca perde-se a abertura traqueal como o introdutor se aproxima da abertura traqueal. O uso de um introdutor de 0,5 mm, também serve para minimizar o trauma que pode ocorrer com uma inserção inicial de uma cânula maior. Notamos aqui que uma investigação similar óptica está disponível a partir de um fornecedor comercial (Braintree Científica, Braintree, MA). Seu dispositivo utiliza uma fonte de luz alimentado por bateria e fibra óptica.

No presente trabalho, testou-se o procedimento com a repetição da medição da mecânica pulmonar, mas intubação tal poderia tão facilmente ser usado para infundir produtos químicos ou de células para o pulmão, tal como foi descrito para entrega repetida de LPS ^12. Além disso, umrelatório prévio com um procedimento de intubação mais primitiva descrita a capacidade de fazer BAL repetida em ratos individuais ^2, e isso seria muito mais simplesmente conseguido com a abordagem nova intubação.

Na prática, o método descrito aqui foi facilmente ensinadas aos companheiros, estudantes e técnicos que nunca tinham tentado intubação. De fato, durante as sessões de treinamento em grupo, alguns dos alunos tornam-se suficientemente proficiente para depois ensinar alguns dos outros estudantes que ainda não tinha tentado isso. Este método tem, assim, uma vantagem considerável uma vez que minimiza o número de ratinhos necessários para a prática e deve permitir que o mínimo de danos em estudos repetidos.

Ao fazer a intubação, há várias questões práticas que devem ser mencionados. É importante ser o mais gentil possível com a retração da língua na abertura inicial da boca. Se fórceps desprotegidos são utilizados, é fácil de ferir a língua, o que pode lead a morte do mouse. Em primeiro aprender como fazer a intubação, o mais importante é a utilização de um dedo por trás do pescoço para ajustar o ângulo da cabeça para permitir a visualização da abertura traqueal. Quando feito corretamente, com tração suficiente na língua, as cordas vocais pode ser facilmente visto. É este passo de visualização inicial, que geralmente requer mais tempo, uma vez que uma vez que a abertura traqueal é visto, é relativamente simples de inserir o cabo de fibra e cateter intravenoso. Inicialmente, se há um problema com esta visualização, o estagiário muitas vezes não é puxando a língua com força suficiente. Aumentar esse puxar um pouco vai endireitar o caminho para a visualização das cordas vocais pode ser visto. Hamacher et al., Descreveu um sistema único de intubação com ⁴ visualização microscópica. O vídeo on-line deste intubação é excelente e muito instrutiva, embora os meios de posicionamento da cabeça e do pescoço não é inteiramente clara da vidEO e figura. Enquanto o sistema que descrevem parece funcionar de forma muito eficiente, que requer um microscópio dedicado. Usando o sistema e processo que descrevemos, as cordas vocais e abertura traqueal podem ser vistas a olho nu. Na nossa descrição original da presente método ^10, foi descrito um processo para adicionar um cone para a cânula de intubação. Este cone cunhas na faringe rato estreito e impede a cânula seja inserido demasiado profundamente. Descobrimos que esta cunha é útil no ensino de estudantes do procedimento, uma vez que é muito fácil de inserir a cânula para a carina, ou para além de, eventualmente, penetrar através de uma parede das vias aéreas. Instruções simples para fabricar a cunha pode ser encontrada em que o papel. No entanto, uma vez que alguém aprende o procedimento suficientemente bem e onde posicionar a cânula, esta adaptação não é mais necessário.

Finalmente, devemos notar que só temos testado esse procedimento com a cânula de 20 g em ratos adultos jovens de algumas tensões. Nesta situação, temos que validou a traqueia e cordas vocais pode proporcionar uma vedação muito boa em torno da cânula, com pressões normais de ventilação, isto é, existe uma fuga de ar mínima de fora do pulmão com a ventilação mecânica. Figura 6 mostra os resultados de canulação na numa C57BL / 6 mouse, onde 3 bolus de ar crescentes (0,5, 0,75, e 1 ml) foram usados ​​para inflar os pulmões. É claro a partir desta figura que vazamentos de pressão são mínimos a uma pressão das vias aéreas de pelo menos 15 cmH ₂ O. No entanto, se um usa substancialmente ratos mais jovens ou mais velhos, ou ratos de estirpes com uma anatomia pulmão diferente, então seria sábio para confirmar que não há vazamentos mínimos. Se existirem, o processo pode, em seguida, requerem o uso de uma cânula de tamanho diferente.

Em resumo, o procedimento de intubação descrever aqui é barato de fabricar e fácil de utilizar, e deve permitir a maioria dos investigadores e técnicos de laboratório para aprender rapidamente com sucessoentubar ratos com relativamente pouca experiência.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Intubation cannula	BD Insylte, Sparks, MD or Jelco Optiva, Carlsbad, CA		1-in.-long, 20-gauge intravenous (IV) catheter
Fiber-optic cable	Edmund Optics, Barrington, NJ	#NT02-542	Approximately 2-ft length of 0.5-mm optical fiber (Communication grade plastic fiber). The edge of the fiber end that is inserted into the trachea should be gently rounded by holding the fiber ≈2 cm from the end and then making small circles while dragging the tip for a few seconds on 1,000-grit emory paper.
Light Source	Volpi	NCL-150	Although we use a 150-W halogen light source, any equivalent light source, even with much lower wattage can be used.
Aluminum tube			One inch O.D., with 1/16 inch wall. This may need to be change to fit whichever light source is used.
Rubber stopper			A #4 rubber stopper fits the 1 inch tube.
Small silicone rubber tube	Cole-Palmer	EW-96410-13	A ≈1.5 cm piece of silicone rubber tubing (0.8 inner diameter, 4 mm outer diameter)
Angled support stand			Ours is constucted from plexiglass, but any material to which a thread or wire can be affixed to hold the mouse at an almost vertical angle can be use.