Summary
Эта статья описывает striaghforward и эффективный метод интубации мышей для измерения легочной функции или легочной инстилляции, что позволяет мыши, чтобы восстановиться и быть изучен на более позднее время. Процедура включает в себя недорогие волоконно-оптический источник света, который освещает непосредственно в трахею.
Abstract
Простая процедура интубация мышей для измерения легочной функции будет иметь ряд преимуществ в продольных исследованиях с ограниченным числом или дорогих животных. Одной из причин того, что это не будет сделано более регулярно том, что это довольно сложно, несмотря на наличие нескольких опубликованных исследований, которые описывают способы его достижения. В этой статье мы покажем процедура, которая устраняет одно из основных препятствий, связанных с этим интубации, что визуализации трахеи в течение всего времени интубации. Этот подход использует 0,5 мм волоконно-оптический источник света, который служит интродьюсер направить интубации канюли в трахее мыши. Мы показываем, что можно использовать эту процедуру для оценки механики легких в отдельных мышей за время хода по крайней мере, несколько недель. Этот метод может быть установлен с относительно небольшими расходами и опыта, и она может быть выполнена регулярно с относительно небольшой подготовки. Это должно макE возможно в любой лаборатории регулярно проводят эту интубации, тем самым позволяя продольных исследований в отдельных мышей, уменьшая тем самым количество мышей необходима и повышения статистической мощности с помощью мыши, как каждый свой контроль.
Introduction
В 1999 году Браун и др.. Опубликовал статью, описывающую метод интубации легких мыши 1. Такой метод имеет значительный полезный в этом повторные легочные функции или бронхоальвеолярного лаважа в отдельных мышей в продольных исследованиях 2. Так что оригинальная бумага, было несколько других работ, которые описал различные подходы к мыши интубации 3-9. Хотя все эти методы могут быть успешно использованы, они обычно требуют значительной подготовки или затрат. Одним из основных вопросов, с такой интубации в том, что по мере приближения интубации канюли приближается к трахее до вставки, канюли сама блокирует свет и, следовательно, визуализации, где она должна идти. Таким образом, становится слепым вставки в самый критический момент. В этой статье мы покажем, как просто и недорого устранить эту задачу визуализации, обеспечивая тем самым успешное интубации с относительно небольшой подготовки илиопыт.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка к процедуре
Надо сначала получить и подготовить следующие пункты:
- Канюли. Для интубации 20-35 мышей г, мы используем 1 или 1,5 дюйма длиной, 20 калибра IV катетер (BD Insylte, Sparks, MD или Jelco Optiva, Carlsbad, CA). Новый стерильный катетер может быть использован для каждой мыши, но катетеры также может быть повторно использован после стерилизации путем замачивания в 70% этаноле в течение ночи. Хотя ни глотки, ни трахеи мыши стерильную чистоту соответствующих процедур, в том числе использование стерильных перчаток и инструментов, должны быть соблюдены.
- Волоконно-оптического кабеля. Мы используем ≈ 70 см 0,5 мм оптический кабель от Эдмунд оптики, но длина не является критическим. Важно, чтобы убедиться, что волокно имеет свои края сглаженными, так как после резки кабеля длиной бритвой, краем остается относительно резким, и это не займет много усилий, чтобы пробить стенки трахеи. Тем не менее, яОчень легко сгладить этот край, держа волокно около 2 см от конца, а затем сделать небольшие круги в течение нескольких секунд с краями касаясь кончиком кусок бумаги зернистостью 1000 наждак (см. демонстрацию в видео и рисунке 1 Макдональд, и др.. 10). На другом конце вводится через резиновую пробку. Проще всего это достигается путем нажатия первой 18-иглы через пробку, вставки оптического волокна через иглу отверстие, затем снимают иглу. Резиновой пробкой связано с мощностью 150 Вт галогенных источников света (например, NCL-150, Volpi США, или любой другой источник света или даже менее 150 Вт). Важно удостовериться, чтобы использовать пробку из силиконовой резины (или другого термостойкого материала), так как обычные резиновые или пробка может гореть, когда расположены так близко к горячему источнику света.
2. Выполнение интубации
- См. рисунки 1 и 2. Вставьте волоконно-оптический кабель тhrough короткий кусок резиновой трубки силиконовые (≈ 0,8 мм ID х 4 мм OD, Cole-Palmer, EW-96410-13). Свяжите эту резиновую трубку достаточно жесткой, хотя и предоставляет волоконно-оптического кабеля для настройки. Установка силиконовых трубок уютно в Luer конца канюли фиксирует положение волоконно-оптического кабеля внутри канюли. Отрегулируйте положение волоконно-оптического кабеля так, чтобы она проходит через канюлю ≈ 4 мм в передней части канюли.
- Положите под наркозом мыши на вертикальной опоре, взвешенных по его верхние резцы (рис. 3). Большинство исследователей найти лучшие визуализации с вентральной стороне мыши перед собой. Очень осторожно вытащите язык и удерживать большим и указательным пальцами. Средний палец находится между шеей и пластиковые поддержки. Тяговые на языке с указательным и большим пальцем используется, чтобы открыть рот, и, чтобы выпрямить путь интубации, угол голове регулируется с помощью среднего пальца за шеюпоказано на рисунке 3.
- Использование волоконно-оптического кабеля в качестве источника света и интродьюсер, нажмите на нее через визуализировать голосовые связки. Если кабели не видна, осторожно тянуть сильнее на язык помощью среднего пальца в качестве поддержки. При вставке продвижению канюли ≈ 5 мм дальше. Тогда, будучи очень осторожным, чтобы не переместить канюлю, снять волоконно-оптического кабеля. Ли мышь вниз и закрепите канюлю с помощью ленты и поддерживать центр канюли на кусок пластилина (пластилин), как показано на рисунке 4.
- Процедура, описанная в пункте 3 не могут быть легко учить или даже продемонстрировал, поскольку это сольный операции. Однако, тонкие настройки тяги на языке и поддержку за голову почти все, кто пытается это скорее найти правильный путь для позиционирования мыши, чтобы представить себе голосовые связки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В качестве оценки этого метода, мы использовали четыре 20 неделя мужской линии BALB / C мышей среднего веса (± SEM) на 27,7 ± 0,40 г. Они были изучены на пять недель подряд, в котором легкого сопротивления измерялась с помощью системы, как описано выше 11. Каждая мышь была под наркозом с кетамином (100 мкг / г BW) и ксилазина (15 мкг / г BW) в физиологическом растворе с помощью IP-инъекции. Затем они были интубировали как описано выше. Если есть какие-либо сомнения в том, канюли в трахее, а не в пищевод, это может быть подтверждено с помощью небольшого стоматологического зеркала. Держите зеркало в морозильной камере, а при необходимости место в передней части Luer центр катетер. Если катетер находится в трахее, выдыхаемого воздуха образует видимый конденсата на зеркале.
После интубации, то мы подключили мышь к вентилятору и измеренного сопротивления легких мышей вентилируемые с частотой 2 Гц и дыхательный объем 0,2 мл, и дыхательные сопротивления расстояние измерялось вдоха методом окклюзии, как описано выше 11. рисунке 5 показаны 5 еженедельных измерений в каждой из 4 мышей. Воспроизводимость отлично, показав, что, по крайней мере, с интервалом в неделю, нет эффекта перед измерением. Это согласуется с ранее сообщал еженедельник оценкам механика и BAL профили ячейки в отдельных BALB / C мышей с более сложной и потенциально травматических процедур 2.
Рисунок 1. Изображение показывает предметы, используемые для интубации. Волоконно-оптических кабелей показано вставлен в пробку силиконовой резины, с небольшой кусок резиновой трубки силиконовые связали рядом с противоположного конца. Пробкой из силиконовой резины крепится к источнику света, как показано на рисунке 2.
Рисунок 2. Изображение показывает резиновой пробкой подключены к источнику света с другого конца волоконно-оптического кабеля вставляется через трахеи канюли. Простая поддержка стоять, чтобы удерживать мышь во время интубации также показано на рисунке слева.
Рисунок 3. Две перспективы показывающий положение мыши готовится к интубации.
Рисунок 4. Эта цифра показывает, интубированных мышь готова к вентиляции. Ленту вокруг рта помогает сохранить канюли двигаться. Небольшой кусок пластилина (пластилин) предоставляет удобный остальное, чтобы обеспечить центр канюли для подключения к искусственной вентиляции легких.
Рисунок 5. Легкое сопротивление каждой из 4 мышей (в разные цвета), измеренный на 5 недельными интервалами.
Рисунок 6. Показана диаграмма записи давления в дыхательных путях в одном интубированных мыши после инъекции 0,5, 0,75 и 1 мл. Каждый том был проведен в течение 20-40 секунд, затем отпустили раньше следующего инфляции. Хотя может быть очень медленным утечки после восстановления релаксации напряжений, это будет иметь незначительное влияние на нормальную вентиляцию или оценки динамических измерений легочной функции. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Описанная здесь процедура имеет ряд преимуществ. Первое устройство является простым и относительно недорогим .. Изготовление аппарата не требует никаких специальных инструментов или дорогостоящего оборудования. Использование катетера вводится что также является источником света означает, что никто никогда не теряет из виду трахеи отверстие, как интродьюсер приближается к открытию трахеи. Использование 0,5 мм интродьюсер также служит для минимизации травм, которые могут возникнуть с начальной вставки больших канюли. Отметим здесь, что аналогичный оптический зонд можно получить из коммерческого поставщика (Braintree научных, Braintree, MA). Их устройство использует питанием от батареи источника света и оптического волокна.
В настоящей работе мы проверили процедуру повторить измерения механики легких, но таких интубации может так же легко использовать для внушения химических веществ или клеток в легких, как это было описано для повторной доставки LPS 12. Кроме того,Перед доклад с более примитивными интубации процедуру, описанную возможность сделать повторный BAL в отдельных мышей 2, и это было бы гораздо проще осуществляется с новым подходом интубации.
На практике, метод, описанный здесь было легко научить парней, студентов и техников, которые никогда не пытались интубации. В самом деле, во время сессий групповое обучение, некоторые студенты стали достаточно опытными, чтобы потом научить некоторым другим студентам, которые еще не пробовали. Этот метод таким образом, имеет значительное преимущество, так как это сводит к минимуму количество мышей, необходимых для практики и должны позволить минимальным ущербом при повторных исследованиях.
При этом интубации, есть несколько практических вопросов, которые должны быть упомянуты. Важно, чтобы быть как можно ласковее с втягивание языка в начальной открывание рта. Если незащищенный щипцы используются легко травмировать язык, и это может Leaд до смерти мышь. В первом научиться делать интубации, самое главное, использование пальцы за шею, чтобы отрегулировать угол наклона головы, чтобы включить визуализацию трахеи открытия. Если все сделано правильно, с достаточной тяги на язык, голосовые связки можно легко увидеть. Именно это начальный этап визуализации, как правило, требуется больше всего времени, поскольку после открытия трахеи видно, это было сравнительно просто вставить кабель волокна и внутривенного катетера. Изначально, если есть проблемы с этой визуализации, стажер часто не тянет на языке с достаточной силой. Увеличение этого притяжения чуть-чуть выпрямить визуализации путь, чтобы голосовые связки могут быть видны. Hamacher и соавт., Описал уникальная система зондирование с микроскопическим 4 визуализации. Их онлайн-видео из этой интубации является прекрасным и очень поучительная, хотя средства позиционирования головы и шеи не совсем ясно, с VIDео и фигуры. В то время как системы, которую они описывают, кажется, работает очень эффективно, оно требует специального микроскопа. Используя систему и процедуру мы опишем, голосовых связок и трахеи открытия можно увидеть невооруженным глазом. В наше оригинальное описание этого метода 10, мы описали процедуру, чтобы добавить конуса к интубации канюли. Этот конус клин в узкую глотку мыши и предотвращает канюлю из вставляется слишком глубоко. Мы обнаружили, что этот клин полезен в обучении студентов процедуру, так как это очень легко вставить канюлю на киль или за ее пределами, возможно, проникая сквозь стены дыхательных путей. Простые инструкции для изготовления клина можно найти в этом документе. Однако, как только кто-то узнает процедура достаточно хорошо и где расположить канюлю, это приспособление больше не нужно.
Наконец, мы должны отметить, что мы проверили только эту процедуру с 20 г канюли в молодых взрослых мышей из нескольких штаммов. В этой ситуации, мы подтверждено, что в трахею и голосовые связки могут обеспечить очень хорошее уплотнение вокруг канюли с нормальным давлением вентиляции, то есть минимальная утечка воздуха из легких с механической вентиляцией. Рисунке 6 показан результат по катетеризации в C57BL / 6 мышей, где 3 увеличению воздуха болюсов (0,5, 0,75 и 1 мл) были использованы для раздувания легких. Как видно из этого рисунка, чем давление утечки минимальными давление в дыхательных путях, по меньшей мере, 15 смН 2 O. Однако, если используется значительно моложе или старше мышей или мышей от штаммов с различной анатомии легких, то было бы целесообразно, чтобы подтвердить, что существуют минимальные утечки. Если они есть, то процедура может потребовать использования различных канюлю размером.
Таким образом, процедура интубации описать здесь является недорогим в изготовлении и проста в использовании, и это должно позволить большинство исследователей и лаборантов быстро научиться успешноинтубация мышей с относительно небольшим опытом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ни один из авторов есть какие-то конфликты интересов раскрывать.
Acknowledgments
Поддерживается NIH HL-10342.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Intubation cannula | BD Insylte, Sparks, MD or Jelco Optiva, Carlsbad, CA | 1-in.-long, 20-gauge intravenous (IV) catheter | |
| Fiber-optic cable | Edmund Optics, Barrington, NJ | #NT02-542 | Approximately 2-ft length of 0.5-mm optical fiber (Communication grade plastic fiber). The edge of the fiber end that is inserted into the trachea should be gently rounded by holding the fiber ≈2 cm from the end and then making small circles while dragging the tip for a few seconds on 1,000-grit emory paper. |
| Light Source | Volpi | NCL-150 | Although we use a 150-W halogen light source, any equivalent light source, even with much lower wattage can be used. |
| Aluminum tube | One inch O.D., with 1/16 inch wall. This may need to be change to fit whichever light source is used. | ||
| Rubber stopper | A #4 rubber stopper fits the 1 inch tube. | ||
| Small silicone rubber tube | Cole-Palmer | EW-96410-13 | A ≈1.5 cm piece of silicone rubber tubing (0.8 inner diameter, 4 mm outer diameter) |
| Angled support stand | Ours is constucted from plexiglass, but any material to which a thread or wire can be affixed to hold the mouse at an almost vertical angle can be use. |
References
- Brown, R. H., Walters, D. M., Greenberg, R. S., Mitzner, W. A method of endotracheal intubation and pulmonary functional assessment for repeated studies in mice. J. Appl. Physiol. 87, 2362-2365 (1999).
- Walters, D. M., Wills-Karp, M., Mitzner, W. Assessment of cellular profile and lung function with repeated bronchoalveolar lavage in individual mice. Physiol. Genomics. 2, 29-36 (2000).
- Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science / American Association for Laboratory Animal Science. 44, 52-55 (2005).
- Hamacher, J., et al. Microscopic wire guide-based orotracheal mouse intubation: description, evaluation and comparison with transillumination. Laboratory Animals. 42, 222-230 (2008).
- Spoelstra, E. N., et al. A novel and simple method for endotracheal intubation of mice. Laboratory Animals. 41, 128-135 (2007).
- Zhao, X., et al. A technique for retrograde intubation in mice. Lab Animal. 35, 39-42 (2006).
- Vergari, A., et al. A new method of orotracheal intubation in mice. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 8, 103-106 (2004).
- Vergari, A., Polito, A., Musumeci, M., Palazzesi, S., Marano, G.
- Hastings, R. H., Summers-Torres, D.
- MacDonald, K. D., Chang, H. Y., Mitzner, W. An improved simple method of mouse lung intubation. J. Appl. Physiol. 106, 984-987 (2009).
- Ewart, S. L., Levitt, R. C., Mitzner, W. Respiratory system mechanics in mice measured by end-inflation occlusion. Journal of Applied Physiology. 79, 560-566 (1995).
- MacDonald, K. D., McKenzie, K. R., Mitzner, W., Zeitlin, P. L. Lung Mechanics in Heterozygous CF Mice after Repeated LPS Dosing. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 175 (4), A930 (2007).
