Isolering af cerebrospinalvæske fra Gnaver Embryoner til brug med dissekeret Cerebral Cortikale Eksplantater

Summary

Den ventrikulære cerebrospinalvæske (CSF) bader neuroepitelceller og cerebral cortical progenitorceller under tidlig hjernens udvikling i embryoet. Her beskrives fremgangsmåden udviklet til isolering af ventrikulær CSF fra gnavere embryoner i forskellige aldre for at undersøge dets biologiske funktion. Derudover viser vi vores cerebral kortikal eksplantat dissektion og dyrkning teknik, der giver mulighed for eksplantat vækst med minimale volumen af ​​kulturmedium eller CSF.

Abstract

CSF er en kompleks væske med en dynamisk varierende proteom hele udviklingen og i voksenlivet. Under embryonisk udvikling, adskiller den spirende CSF fra fostervandet ved lukning af den forreste neuralrøret. CSF volumen stiger derefter i de efterfølgende dage som de neuroepitelceller progenitorceller foring hjertekamrene og choroid plexus generere CSF. De embryoniske CSF kontakter den apikale, ventrikulære overflade af de neurale stamceller i den udviklende hjerne og rygmarv. CSF giver afgørende fluidtryk til udvidelse af den udviklende hjerne og distribuerer vigtige vækstfremmende faktorer til neurale progenitorceller i en tidsmæssigt specifik måde. At undersøge funktionen af ​​CSF, er det vigtigt at isolere rene prøver af embryonisk CSF uden kontaminering fra blod eller udviklingslandene telencephalic væv. Her beskriver vi en teknik til at isolere relativt rene prøver af ventrikulær embryonisk CSF, der kan anvendes tilen lang række eksperimentelle assays, herunder massespektrometri, protein elektroforese og celle og primære eksplantat kultur. Vi viser, hvordan man dissekere og kultur kortikale eksplantater på porøse polycarbonatmembraner for at vokse udvikle cortexvæv med reducerede mængder af medier eller CSF. Med denne metode kan forsøg udføres under anvendelse af CSF fra forskellige aldre eller tilstande at undersøge den biologiske aktivitet af CSF proteomet på målceller.

Introduction

CSF er en kompleks væske, der bader udviklingslandene neuroepithelium ^1-6 og giver væsentlig tryk ⁷ og vækstfremmende signaler til hjernens udvikling ^8-12. For at undersøge CSF i løbet af hjernens udvikling, vi udviklet teknikker til at isolere ventrikulær CSF i at udvikle rotte-eller muse embryoer på forskellige udviklingsstadier ^6,9. Tidligere fremgangsmåder til isolering inkluderet under anvendelse af en glas mikronål og isolering af CSF ved anvendelse af en mikro-injektor ^1,2. Vores fremgangsmåde anvender et glas mikro-kapillær pipette hvis spids er trukket for at skabe en ultrafin for forbedret vævspenetration. Glasset mikro-kapillære pipette er forbundet til en aspirator så ventrikulær CSF samling kan styres med blide trykændringer. For at undersøge stamceller påvirkninger af CSF-signaler, vi dissekere cerebrale kortikale eksplantater, placere dem på polycarbonatmembraner, og flyde dem på passende culture medium suppleret med CSF-prøver ^9. Med denne teknik er reducerede volumener af alle tilstrækkelige til dyrkning af væv, giver mulighed for en effektiv udnyttelse af CSF ^9.

Protocol

1. Embryo Isolation / præparat

Denne teknik kan anvendes til mus eller rotte. I denne protokol vi vise FSR indsamling teknik og cerebral cortical eksplantat dissektion med muse embryonale hjerne. Vi vil kommentere eventuelle væsentlige forskelle for rotter versus mus, der findes inden for de generelle teknikker. For det embryoniske alder staging system, er E1 klassificeret som dagen af ​​proppen for rotter, og E0.5 er klassificeret som dagen af ​​proppen for mus.

1. Forbered en mikro-dissektion fad med Sylgard Silikone Elastomer. Sylgard 184 silikoneelastomer leveres som et todelt flydende komponent, del A og B. Del A og del B blandes i et forhold på 10:1 efter vægt eller volumen. Efter de flydende komponenter blandes, hældes Sylgard elastomer i en petriskål til at dække hele overfladen af ​​skålen. Nogle luftbobler kan være til stede, der vil fjerne under hærdningsprocessen. Anbring petriskålen låg på og lad elastomare at hærde. Elastomeren kan hærdes ved stuetemperatur i 24 timer, eller ved højere temperaturer (fx 37 ° C) for hurtigere hærdning. Når de flydende komponenter størkner, dissektion skålen er klar til brug. Skålen kan anvendes gentagne gange til flere eksperimenter, forudsat at det rengøres godt efter proceduren.
2. Fremstilling af mikro-kapillært pipette (nålen). Micro-kapillarpipetter fremstilles ved anvendelse af varme og træk ved hjælp af en Narishige PC-10 lodret mikropipette aftrækker med følgende indstillinger: Et skridt pull, Heater # 2 sat til 58, 100 g pull vægt. Den fine spids mikropipette omhyggeligt knækket ved hjælp af fine # 55 pincet. Det resulterende gennemsnitlige indre diameter af nålen er 85 um.
3. Forbered aspirator samling for CSF aspiration. Indsæt mikro-stempel forsynet med mikro-kapillarpipetter i det kapillære nål. Alternativt kan vedhæfte en plastik engangsfilter til enden af ​​aspiratoren slangesamlingen, der er tilsluttet to mikro-kapillære pipette. Stik nålen igennem pakningen i stilling på den modsatte ende af den aspiratorens samlingen.
4. Overfør isoleret embryon fra kuldet til en mikro-dissektion fad fremstillet med Sylgard.
5. Fjern den ekstra-embryonale membraner og væv, således at embryoet er tydeligt eksponeret. Hver tissuelag-first livmodervæggen og derefter decidua-kan dissekeres med fine iridectomy saks (dvs. Fin Science Tools # 15.000-02). Ved hvert implantationsstedet, livmodervæggen først, derefter decidua kan indsnit parallelt med den lange akse af livmoderen, og snittet kan derefter åbnes yderligere under anvendelse af fine tænger. The decidua kan fjernes efter et lignende snit, udsætter fosterhinderne. Omhu bør udvises, således at fosterhinderne ikke indskårne eller punkteres.
6. Vask med steril Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) og fjerne overskydende fluid fra det omgivende embryo anvendelse af en pipette og en Kimwipe eller filterpapir skæres i trekanter.

2. Ventrikulær CSF Collection

1. Visualisere embryo under dissektion mikroskop: for mus, bør fosteret om på siden, således at man har et sagittalbillede af den udviklende embryo. Med rotteembryoer E16 eller ældre, placere embryonet på sin dorsale rygsøjlen, langs dens længste plane dimension, fra en kraniel til haleretningen, som hvis fosteret ligger på ryggen. På denne måde CSF kan opsamles fra både højre og venstre laterale ventrikel.
2. Støt indsætte mikro-kapillære pipette i den laterale ventrikel, mesencephaliske ventrikel, eller Cisterna magna, forsøger ikke at kontakte de neuroepitelceller når pipetten er blevet indsat. For musefostre E14.5 eller ældre, kan CSF blive aspireret fra den højre ventrikel, og derefter fjernes nålen og indsættes i den venstre ventrikel. På grund af åbenheden af ​​hjertekamrene og neuralrøret i embryoner yngre end E14.5, atHele CSF volumen kan ofte aspireret fra de laterale ventrikler med en enkelt indføring af kanylen. Imidlertid er dette ikke altid tilfældet udviklingsmæssige gange og åbenheden af ​​forbindelseselementerne ventrikler kan variere en smule, og derfor kan den mikro-kapillære pipette også indsættes i cisterna magna at indsamle den maksimale CSF volumen.
3. Når den mikro-kapillære pipette indsættes i den laterale ventrikel, mesencephale ventrikel eller cisterna magna, omhyggeligt og forsigtigt begynde opsugning CSF ind i pipetten ved hjælp af enten mikro-stemplet til at skabe negativt tryk og sug CSF, eller ved at tilvejebringe en blid negativt tryk skabes af munden, således at CSF begynder at forsigtigt strømme ind i mikro-kapillære pipette på en langsom og styret måde. Vi anbefaler, at beskueren kontrollerer med deres egne lokale embedsmænd med hensyn til institutionelle politikker på disse tilgange.
4. Fortsæt med at anvende undertryk og indsamle CSF ind i mikro-kapillære pipette.I både mus og rotter embryoner fra E16.5/E17 eller derunder, er det muligt at observere ventriklen sammenbrud lidt ved tilsynekomsten af ​​en divot dannes på den side af hovedet, som den mikro-kapillar pipette er i. I ældre fostre, på grund af den større størrelse af hjernen, kan det ikke være muligt at observere hovedet kollapser.
5. Stoppe pres og fjern forsigtigt mikro-kapillært pipette fra den laterale ventrikel.
6. Forsigtigt udvise CSF-prøve i et eppendorfrør, der er blevet afkølet på is.
7. Fortsætte indsamlingen af ​​CSF fra en hel kuld af dyr og pool prøverne i det samme rør.
8. Centrifuger ved 10.000 x g ved 4 ° C i 10 minutter for at fjerne eventuelle kontaminerende celler.
9. Analyser prøverne for eventuelle tegn på kontaminerende neuroepitelceller eller røde blodlegemer. Tegn på kontaminering er normalt angivet ved fluidet vises uklar eller rød / pink, eller tilstedeværelsen af ​​en pellet med en blod farvet plet. Efter centrifugering CSF kan analyseres mikroskopisk for tegn på celler eller cellerester. Hvis der er tegn på kontaminering væsken skal kasseres. Som yderligere kontrol, kan pelleten indhold ligeledes farvet for celler. En ren CSF-prøve kan anvendes til cellekultur, cortical kultur, spektrometri, western blot, ELISA og andre assays. Den klare CSF bør overføres til et nyt sterilt Eppendorf-rør. Prøven kan nu anvendes til analyse, poolet med andre prøver, eller snap frosset med flydende nitrogen og opbevaret ved -80 ° C. Frysning og optøning af små prøver af fluid, kan resultere i et lille volumen fald og ændringer i proteinkoncentration. Dette kan undgås ved frysetørring af prøverne.

3. Cortical Eksplantation Dissection

1. Overfør E14.5 embryo isoleret fra kuldet på en mikro-dissektion fad fremstillet med Sylgard.
2. Fjern embryo fra ekstra-embryonale membraner og væv som beskrevet i trin 1.5.
<li> Vask med steril Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) og fjerne overskydende fluid fra det omgivende embryo anvendelse af en pipette.
3. Dissekere gennem den cervikale region adskille hovedet fra resten af embryoet (fig. 1A).
4. Med en fin skalpel (ophthalmisk kniv), skære ned midterlinjen af ​​hovedbunden. Gribe hver side af denne incision med fine tænger og fjerne huden. Brug derefter iridectomy saks til at lave et snit, der løber langs midterlinjen af ​​udviklingslandene baghovedet. Efterfølgende har to yderligere snit, tilnærmelsesvis 1/3 af afstanden fra de forreste og bageste ender af det udviklende kraniet. Brug tynde pincet til at gribe de "flapper" af kraniet som følge af denne del af dissektion, og fjern udvikle kranium væv, udsætte cortex (figur 1B).
5. Ved hjælp af skalpel halveres hjernen langs midterlinien i midten af sagital plan, der adskiller højre og venstre corticale halvkugle (fig.1B, C). PIA og arachnoid efterlades fastgjort til cortex, og dura fjernes sammen med det udviklende kraniet.
6. Udarbejder hvert cortical halvkugle separat. Placer halvkugle mediale side op, så du kan se ganglios eminence og udviklingslandene cortex (figur 1C, D).
7. Ved hjælp af skalpel, en koronal indsnit gøre gennem den kortikale neuroepithelium caudalt for udviklingslandene lugtekolben. Dette indsnit bør begynde ved den forreste grænse af de laterale og mediale ganglioniske eminencers, og strækker sig gennem den forreste cingulate område af udviklingen cortical ansats (fig. 1E).
8. Foretage endnu koronale snit lige caudalt til den bageste grænse af den laterale ganglioniske eminence (figur 1F). Dette indsnit bør også strækker sig fra den laterale grænse af ganglioniske eminence til den mediale væg af udviklingen cortical Rudiment.
9. Træk kortikale "flap" CREAindikeret med de to indsnit foretaget i trin 3.7 og 3.8 under anvendelse af en skalpel eller let tryk fra en strøm af HBSS leverede med en 200 pi pipette for at undgå mekanisk beskadigelse af cortex. Derefter foretage en tværgående incision langs grænsen adskiller den laterale ganglioniske eminence fra det udviklende cortex (figur 1G, H). Derefter dissekere væk udvikle hippocampus og cortex Fligen af ​​den mediale telencephalon, ved spidsen af ​​neocortex, hvor den laterale kortikale overflade møder interhemispheric væg.
10. Gør et tværgående indsnit langs grænsen adskiller den laterale ganglioniske eminence fra det udviklende cortex (figur 1 H).
11. Fjern eventuelle ekstra dissekeret væv, der er på Sylgard plade fra det dissekerede kortikal eksplantat. Man kan bruge forsigtig pipettering med frisk HBSS buffer at pipettere væk nogen ekstra dissekeret væv. Den dissekeret cortex er nu med meningeal side nedad (fig. 1I).

1. Der fremstilles en platintråd sløjfe forbundet med en glaspipette. Varm glaspipette med et foldet platintråd indsat i enden af ​​glaspipette. Ved at dreje udgangen af ​​platintråd loop, kan størrelsen af ​​sløjfen forøges eller formindskes, og sløjfen kan formes til at passe til størrelsen af ​​den ønskede eksplantation. (Dette kan fremstilles i forvejen og genbruges.)
2. Opvarme enden af ​​platintråden at sterilisere sløjfen.
3. Isoler dissekerede kortikal eksplantat og fjerne de ekstra HBSS medier ved forsigtig pipettering, hvilket efterlader et lille beløb for at benytte med wiren loop.
4. Sætte et 1 cm polycarbonatmembran i en 4 cm diameter imaging skål.
5. Ved hjælp af den side af platintråd loop, forsigtigt vende cortex, således at meningeal side vender opad.
6. Løft cortical eksplantat fra dissektion skålen, ved at anbringe eksplantatet i midten af ​​sløjfen og med de iboende hydrostatiske kræfter tilløft af eksplantatet på et fladt plan.
7. Forsigtigt anbringe eksplantatet på polycarbonatmembran, og løft platintråd sløjfe væk sådan, at eksplantatet forbliver på membranen på et fladt plan med den ventrikulære overflade får kontakt med membranen.
8. Forsigtigt løfte membranen og pipetteres 50 ul CSF eller andre medier under membranen.
9. Tildæk skålen, som anbringes i en befugtet sekundær beholder, og der inkuberes ved 37 ° C i _5% CO2 i 24 timer for at understøtte fortsat celleproliferation og eksplantat vækst. Figur 2 viser en skematisk fremstilling af den endelige cortical eksplantat skålen præparat.

Representative Results

CSF indsamling bør give en klar og gennemsigtig væske. Der bør ikke være noget bevis for kontaminering fra blod, hvilket fremgår af en rød eller gul farvet fluidum i indsugningsstillingen, og i Eppendorf-rør. Der bør også være tegn på væv i indsugningsstillingen, og Eppendorf-rør. Når CSF centrifugeres, kan man også vurdere CSF mikroskopisk at sikre, at der ikke er nogen forurening. Hvis der er tegn på kontaminering bør CSF kasseres. Fra den ene E14.5 mus kuld, kan man forudse at indsamle 10-15 gl CSF. Tabel 1 viser de gennemsnitlige mængder CSF indsamlet fra gennemsnitlige kuldstørrelse hos både mus og rotter fra forskellige embryonale aldre. Når rene CSF-prøver er blevet indsamlet, kan CSF analyseres under anvendelse af en række forskellige teknikker. Figur 3 viser et repræsentativt sølvfarvede gel med 2ug af muse-E14.5 CSF.

Cerebrale corticale eksplantater kan dyrkes with varierende mængder CSF plus et basalt medium om nødvendigt, så det samlede volumen er 50 pi. Figur 4 viser repræsentative eksplantater dyrket med 50 ul 100% embryonisk CSF i 24 timer. Eksplantaterne er blevet vist at overleve og proliferere med 100% CSF og have væv histologi ligner gnaver embryoer på samme svangerskabsalder ^9, som vist ved immunreaktivitet over for phospho-histone H3 (PH3), en markør for celledeling, langs ventrikulære overflade, BrdU, en markør for DNA-syntese, inkorporering langs den ventrikulære zone, og Tuj1, en neuronal markør, i udviklingslandene cortical plade.

Sprague Dawley kuld Embryonic Age	Volumen pr kuld	CD1 kuld Embryonale Age	Volumen pr kuld
E13	30-50 pi	E10.5	15-20 pi
E14	40-75 pi	E12.5	15-20 pi
E16	50-90 pi	E14.5	10-15 pi
E18	40-75 pi	E16.5	5-10 pi

Tabel 1. Gennemsnitlige mængder af CSF opnået fra standard størrelse Kuld.

Figur 1. Skematisk Disposition Cerebral Cortical Eksplantation Dissection.

Figur 2. Skematisk diagram af Final ret Tilberedningstid.

Figur 3. Sølv plet af muse E14.5 CSF. Dette er et repræsentativt Sølv plet af 2ug muse E14.5 CSF protein kørt på 4-12% Bis-Tris NuPAGE gradientgel fra Invitrogen. Sølvfarvning udført med SilverQuest Sølvfarvning kit udviklet i 5 min 40 sek.

Figur 4. E15 rotte-corticale eksplantater dyrket i 24 timer. Disse er repræsentative billeder af cerebrale corticale eksplantater dyrket i 24 timer i 100% embryonisk CSF. Disse eksplantater er blevet fastsat ved Carnoy metode, paraffin snit, og forberedt til immunfarvning. PH3 (rød), og Tuj1 (grøn), BrdU (blå).

Discussion

Den beskrevne fremgangsmåde til ventrikulær CSF samling har givet forholdsvis rene prøver af embryonisk CSF med stabilt protein sammensætning og ensartet aktivitet i en række cellulære assays ^9. Med en god samling teknik og kuldstørrelse af ti E14.5 mus, kan man forvente at indsamle 10-15 pi CSF, og fra et kuld på E16 rotter, kan man forvente at indsamle omkring 50-90 ul CSF. Denne samling teknik minimerer kontaminering fra blod og væv, ved omhyggelig observation, centrifugering og kassation af prøver med tegn på cellerester eller blod skær. Vi har analyseret fluidet mikroskopisk at vurdere for cellerester eller celler inde i CSF efter centrifugering og fandt, at prøverne, der ikke har pellet efter centrifugering er fri for cellulær forurening. I modsætning til proteomet for udvikling hjernevæv eller på prøver af forurenet CSF (data ikke vist), der anvender denne fremgangsmåde til CSF ekstraktion,FSR proteomet ikke indeholdt nogen mitokondrielle proteiner når de analyseres med et massespektrometer ^6.

Baseret på den fysiske placering af den ventrikulære CSF inden for telencephalic vesikler og neuralrørsdefekter, den eneste fremgangsmåde til isolation er at trænge igennem den udviklende hud, kranium, og telencephalon. Derfor er indføring af kanylen gennem disse væv er en kilde for mulig kontaminering. Spidsen af ​​nålen bør være så smal som muligt, så at nålen kan indføres glat igennem vævet og ind i ventriklen. Mikro-kapillære pipette kan indsamle væv inden i boringen i kanylen under indføring af kanylen i ventriklen. Afhængigt af alderen af ​​fostret, og hvis choroid plexus udviklet i ventriklen, er det vigtigt at ikke opsuge indholdet af choroid plexus i pipetten. Det er imidlertid vigtigt at skabe tilstrækkeligt undertryk, således at CSF samler i than afpipetteres, uden at forstyrre det omgivende udvikle hjernevæv eller choroid plexus. Tilstedeværelsen af ​​vævet kontaminering kan visualiseres under dissektionsmikroskop, ved pipettering CSF på et objektglas med et dækglas og direkte visualisering af celleaffald.

De metoder vi beskriver for CSF isolation giver forholdsvis rene prøver af CSF, som vi har besluttet at date. Når kendt forurenede CSF-prøver er blevet analyseret under anvendelse af massespektrometri, har de afsløret tilstedeværelsen af ​​mitokondrielle proteiner (data ikke vist). En iboende mangel ved teknikken er, at CSF opnås ved at punktere udvikle kranium og cortex, og derfor celler og væv kan være til stede i CSF. Ved centrifugering af CSF til analyse for et pellet, og mikroskopisk analyse af CSF under mikroskop har vi optimeret en fremgangsmåde til CSF isolering, der giver forholdsvis rene prøver af CSF.

Teknikken feller ventrikulær embryonisk CSF indsamling og cerebrale corticale eksplantater er blevet beskrevet og vist i filmen for en embryonisk mus. Imidlertid kan denne teknik anvendes til ventrikulær CSF indsamling og cerebrale corticale eksplantater fra alle embryonale gnavere og er blevet anvendt til både rotter og mus. Fremgangsmåden beskrevet i denne protokol blev designet specielt til isolering af ventrikulære CSF, og er ikke beregnet til opsamling af CSF i det subaraknoidale rum.

Teknikken til cerebrale corticale eksplantater blev skabt for at kunne vokse eksplantater med et lavere volumen af ​​medier i betragtning af de begrænsede mængder af embryonisk CSF rådighed for de enkelte eksperimenter. Den mindste mængde medium anvendes til dyrkning af eksplantater pålideligt i 24 timer blev 50 ul. Lejlighedsvis blev eksplantater dyrket i mere end 24 timer, med den længste periode er 72 timer. Med længere eksperimenter, er det bedst at supplere vækstmediet hver 24 timer. Når eksplantaterne are dyrket i det ønskede tidsrum, kan eksplantaterne anvendes til en række forskellige assays, herunder immunofluoresence, generering af neurosfærer, celledød, eller RNA-ekstraktion.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wiretrop II capillary needles	Drummond Scientific	#5-000-2020
Sylgard	Ellsworth Adhesives	#184 SIL ELAST kit
Aspirator tube assembly	Sigma	#A5177-5EA
Disposable filter	Venturi or local pharmacy	not available	Standard cigarette filter
Roundstock opthalmic knife (15 degree stab knife)	World Precision Instruments, Inc.	#500250
35mm glass bottomed culture dish	MatTek Corp.	#P35G-1.5-14-C
Platinum-iridium wire	Tritech Research	#PT-9010-010-3FT
Nuclepore Track-Etch Membrane	Whatman	#09-300-57
Hanks Balanced Salt Solution	Fisher Scientific	#SH30031.FS
Iridectomy Scissors	Fine Science Tools	#15000-02