Isolering av cerebrospinalvätska från Gnagare Embryon för användning med Dissekerade cerebrala kortikala Explantat

Summary

Den ventrikulära cerebrospinalvätskan (CSF) badar neuroepiteliala och cerebral kortikala progenitorceller under hjärnans tidiga utveckling i embryot. Här beskriver vi den metod som utvecklats för att isolera ventrikulär CSF från gnagare embryon i olika åldrar för att undersöka dess biologiska funktion. Dessutom visar vi vår cerebral kortikal explantat dissektion och kultur teknik som möjliggör explantat tillväxt med minimala volymer odlingsmedium eller cerebrospinalvätska.

Abstract

CSF är en komplex vätska med ett dynamiskt varierande proteom hela utveckling och i vuxen ålder. Under fosterutvecklingen, skiljer den begynnande CSF från fostervattnet vid stängning av den främre neuralröret. Cerebrospinalvätskan ökar sedan över följande dagar som neuroepiteliala stamceller kantar ventriklar och koroidea plexus generera CSF. De embryonala CSF kontaktar apikala, ventrikulär yta av neurala stamceller i utvecklingsländerna hjärnan och ryggmärgen. CSF ger avgörande vätsketryck för utbyggnad av den växande hjärnan och distribuerar viktiga tillväxtbefrämjande faktorer till neurala stamceller i en tidsmässigt-specifikt sätt. För att undersöka funktionen av CSF, är det viktigt att isolera rena prover av embryonala CSF utan kontaminering från blod eller utvecklingsländerna telencephalic vävnaden. Här beskriver vi en teknik för att isolera relativt rena prover av ventrikulär embryonal CSF som kan användas förett brett spektrum av experimentella tester inkluderande masspektrometri, protein-elektrofores, och cell-och primär explantat kultur. Vi visar hur att dissekera och kultur kortikala explantat på porösa polykarbonatmembran för att växa utveckla kortikal vävnad med minskade volymer av media eller CSF. Med denna metod, kan experiment utföras med användning av CSF från olika åldrar eller villkor för att undersöka den biologiska aktiviteten av CSF proteomet på målceller.

Introduction

CSF är en komplex vätska som badar utvecklingsländerna neuroepitelet ^1-6 och ger grundläggande tryck ⁷ och tillväxtbefrämjande ledtrådar för den växande hjärnan ^8-12. För att studera GSR under loppet av hjärnans utveckling, har vi utvecklat tekniker för att isolera ventrikulär CSF från att utveckla råtta eller mus embryon under olika stadier av utveckling ^6,9. Tidigare metoder för isolering ingår med ett glas mikro-nål och isolera GSR med en mikro-injektor ^1,2. Vår metod använder en glas mikro-kapillärpipett vars spets har dragits för att skapa en ultrafin punkt för förbättrad vävnadspenetrering. Glaset mikro-kapillärpipett är ansluten till en sug så att ventrikulär CSF samling kan styras med mjuka förändringar i trycket. För att undersöka påverkan stamceller av CSF-signaler, dissekera vi cerebrala kortikala explantat, placera dem på polykarbonatmembran och flyta dem på lämpliga culture medium kompletterat med CSF-prov ^9. Med denna teknik, minskade volymer av media är tillräckliga för att kulturen vävnaden, vilket möjliggör en effektiv användning av CSF ^9.

Protocol

1. Embryo Isolering / beredning

Denna teknik kan användas för mus eller råtta. I detta protokoll visar vi CSF insamling teknik och cerebral kortikal explantat dissektion med musen embryonala hjärnan. Vi kommer att kommentera några viktiga skillnader för råttor jämfört möss som finns inom de allmänna tekniker. För den embryonala åldern iscensättning systemet, E1 klassificeras som dagen för plugg för råttor, och E0.5 klassificeras som dagen för plugg för möss.

1. Förbered en mikro-dissektion maträtt med Sylgard silikonelastomer. Sylgard 184 silikonelastomer levereras som ett tvådelat vätskekomponent, del A och del B. Del A och B del blandas i ett 10:1 förhållande i vikt eller volym. Efter de flytande komponenterna blandas, häll Sylgard elastomeren i en petriskål för att täcka hela ytan av skålen. Vissa luftbubblor kan vara närvarande som kommer att försvinna under härdningsprocessen. Placera petriskålen locket och låt elastomER att bota. Elastomeren kan härdas vid rumstemperatur under 24 timmar, eller vid högre temperaturer (t.ex. 37 ° C) för snabbare härdning. När de flytande komponenterna stelna, är dissektion skålen klar att använda. Skålen kan användas upprepade gånger för flera experiment, förutsatt att det städas väl följa förfarandet.
2. Beredning av mikro-kapillärpipett (nål). Micro-kapillärpipetter bereds genom att värme och dra med en Narishige PC-10 vertikal mikropipett avdragare med följande inställningar: Ett steg pull, Värmare # 2 satt till 58, 100 g Dra vikt. Den fina spets mikropipett är noggrant fästs utanför med fina # 55 pincett. Den resulterande genomsnittliga innerdiameter hos nålen är 85 um.
3. Förbered aspirator aggregatet för CSF aspiration. Sätt mikro-kolv försedd med mikro-kapillärpipetter i kapillären nålen. Alternativt bifoga en plast engångsfilter till slutet av sugrör församling som är ansluten to mikro-kapillärpipett. Tryck nålen genom packningen på den motsatta änden av suganordningen aggregatet.
4. Överför embryo isolerad från kullen till en mikro-dissektion maträtt beredd med Sylgard.
5. Ta bort extra embryonala membran och vävnader så att embryot är klart utsatt. Varje tissueskikt-första livmoderväggen och sedan decidua-kan dissekeras med fina iridektomi sax (dvs. Fine Science Tools # 15.000-02). Vid varje implanteringsstället, först livmoderväggen, då decidua kan snittas parallell med den långa axeln av livmodern, och snittet kan sedan öppnas ytterligare med användning av fin pincett. Den decidua kan avlägsnas efter en liknande snitt, exponerar fosterhinnorna. Försiktighet bör iakttas så att fosterhinnorna inte snittas eller punkteras.
6. Tvätta med steril Hanks balanserade saltlösning (HBSS) och avlägsna överflödig vätska från det omgivande embryot med användning av en pipett och en Kimwipe eller filterpapper skuren i trianglar.

2. Ventrikulär CSF Insamling

1. Visualisera embryo under dissektion mikroskop: för mus bör embryot liggande på sin sida, så att man har en sagittal bild av det utvecklande embryot. Med råttembryon E16 eller äldre, placera embryot på sin dorsala ryggraden, längs sin längsta plana dimensionen, från en kranial till kaudal riktning, som om embryot ligger på sin rygg. På detta sätt CSF kan uppsamlas från både höger och vänster lateral ventrikel.
2. Stadigt in mikro-kapillärpipett i den laterala ventrikeln, mesencefal ventrikel eller cisterna magna, försöker inte att kontakta neuroepitelceller när pipetten har satts in. För musembryon E14.5 eller äldre, kan CSF sugas från den högra ventrikeln och sedan nålen avlägsnas och införes i den vänstra ventrikeln. På grund av öppenheten hos ventriklarna och neuralröret i embryon yngre än E14.5, denhela cerebrospinalvätskan kan ofta aspireras från de laterala ventriklarna med en enda nål insättning. Detta är dock inte alltid fallet eftersom utvecklingsmässiga tider och öppenheten hos de anslutande ventriklarna kan variera något, och därför kan den mikro-kapillärpipett också införas i cisterna magna att samla den maximala cerebrospinalvätskan.
3. När mikro-kapillärpipett sätts in i laterala ventrikeln, mesencefal ventrikel eller cisterna magna, noggrant och försiktigt börja aspirera GSR i pipetten, med antingen mikro-kolven för att skapa undertryck och aspirera CSF eller genom att tillhandahålla en mild undertryck som åstadkoms av munnen så att CSF börjar försiktigt strömma in i mikro-kapillärpipett i en långsam och kontrollerat sätt. Vi rekommenderar att betraktaren kontrollerar med egna lokala tjänstemän i samband med institutionella politik på dessa metoder.
4. Fortsätta att tillämpa undertryck och samla in CSF i mikro-kapillärpipett.I båda mus och råtta embryon E16.5/E17 eller yngre, är det möjligt att observera kammaren kollaps något genom uppkomsten av en torva bildas på sidan av huvudet att mikro-kapillärpipett är i. I äldre embryon, på grund av den större storleken av hjärnan, kan det inte vara möjligt att observera huvudet kollapsar.
5. Sluta utöva påtryckningar och ta försiktigt bort mikro-kapillärpipett från den laterala ventrikeln.
6. Försiktigt utvisa CSF provet i ett Eppendorf-rör som har kylts på is.
7. Fortsätt samla CSF från en hel kull av djur och pool proverna i samma rör.
8. Centrifugera vid 10.000 xg vid 4 ° C under 10 minuter för att avlägsna eventuella kontaminerande celler.
9. Analysera proverna efter tecken på kontaminerande neuroepitelceller eller röda blodkroppar. Tecken på kontamination brukar anges av vätskan visas grumlig eller röd / rosa, eller förekomsten av en pellet med en blod färgad fläck. Efter centrifugering, CSF kan analyseras mikroskopiskt tecken på celler eller cellulärt skräp. Om det finns tecken på förorening vätskan ska kasseras. Som en ytterligare kontroll, kan pelleten innehåll även färgas för celler. Ett rent CSF-prov kan användas för cellodling, kortikal kultur, spektrometri, western blöt, ELISA och andra analyser. Den klara CSF bör överföras till ett nytt sterilt Eppendorf-rör. Provet kan nu användas för analys, poolades med andra prover, eller snabbfrystes med flytande kväve och lagrades vid -80 ° C. Frysning och upptining av små prover av vätska kan resultera i en liten volym minskar och förändringar i proteinkoncentration. Detta kan undvikas genom frystorkning av proverna.

3. Kortikal Explantation Dissektion

1. Överför E14.5 embryot isolerad från kullen på en mikro-dissektion maträtt beredd med Sylgard.
2. Ta embryo från extra embryonala membran och vävnader som beskrivs i steg 1,5.
<li> Tvätta med steril Hanks balanserade saltlösning (HBSS) och avlägsna överflödig vätska från det omgivande embryot användning av en pipett.
3. Dissekera genom hals-regionen separerar huvudet från resten av embryot (Figur 1A).
4. Med hjälp av en fin skalpell (oftalmisk kniv), minska mittlinjen i hårbotten. Fatta varje sida av detta snitt med fin pincett och ta bort huden. Använd sedan iridektomi sax för att göra ett snitt som löper längs mittlinjen i utvecklingsländerna kraniet. Därefter gör ytterligare två snitt, ungefär 1/3 av avståndet från de främre och bakre ändarna av utvecklingsländerna skallen. Använd fin pincett för att ta tag i "flikar" av kranium som följer av denna del av dissektion och ta bort utvecklingsländerna skallen vävnaden, utsätta cortex (Figur 1B).
5. Använda skalpell HALVERA hjärnan längs mittlinjen i mitten sagital plan, separera de högra och vänstra hemisfärerna kortikala (figurerna1B, C). PIA och spindelvävshinnan lämnas fäst cortex och dura avlägsnas tillsammans med utvecklingsländerna skallen.
6. Förbered varje kortikala hemisfär separat. Placera halvklotet mediala uppåt så att du kan se den ganglionär eminens och utvecklingsländerna cortex (figur 1C, D).
7. Med hjälp av skalpell görs en koronalt snitt genom den kortikala neuroepitelet kaudalt utvecklingsländerna luktbulben. Detta snitt bör börja vid den främre gränsen för de laterala och mediala ganglieblockerande höjder, och sträcker sig genom den främre cingulum regionen utvecklingsländerna kortikala rudiment (Figur 1E).
8. Gör en koronalt snitt bara kaudalt till den bakre gränsen av den laterala ganglionär eminens (Figur 1F). Detta snitt bör också sträcka sig från den laterala gräns ganglionär eminens till den mediala vägg utveckla kortikala rudiment.
9. Dra tillbaka den kortikala "fliken" created av de två snitt görs i steg 3,7 och 3,8, med användning av en skalpell eller lätt tryck från en ström av HBSS levereras med en 200 ul pipett för att undvika mekanisk skada på cortex. Sedan göra en tvärgående snitt längs gränsen mellan den laterala ganglionär eminens från utvecklingsländerna cortex (figur 1G, H). Därefter, dissekera bort utvecklingsländerna hippocampus och kortikala fållen på mediala telencefalon, vid spetsen av hjärnbarken där den laterala kortikala ytan möter Interhemispheric väggen.
10. Gör en tvärgående snitt längs gränsen mellan den laterala ganglionär eminens från utvecklingsländerna cortex (Figur 1H).
11. Ta bort eventuella extra dissekerade vävnad som finns på Sylgard plattan från dissekerade kortikala explantatet. Man kan använda försiktig pipettering med färsk HBSS buffert för pipettera bort någon extra dissekerad vävnad. Den dissekerade cortex är nu med meningeal nedåt (Figur 1I).

1. Förbered en slinga platinatråd ansluten till en glaspipett. Värm glaspipett med en vikt platinatråd införd i änden av glaspipett. Genom att vrida änden av platinatråd slingan, kan storleken för slingan ökas eller minskas, och slingan kan vara formad för att passa storleken på den önskade explantatet. (Detta kan framställas i förväg och återanvändas.)
2. Värm änden av platinatråd att sterilisera slingan.
3. Isolera dissekerade kortikala Explantation och ta bort de extra HBSS medierna genom försiktig pipettering, lämnar en liten mängd för att använda med tråden slingan.
4. Placera en 1 cm polykarbonat membran i en 4 cm diameter avbildning skål.
5. Använda sidan av platinatråd slingan försiktigt vända cortex så att meningeal är vänd uppåt.
6. Lyft kortikala explantatet från dissektion skålen, genom att placera explantatet i mitten av slingan och använda de inneboende hydrostatiska krafterlyfta explantatet på ett plant plan.
7. Försiktigt placera explantatet på polykarbonatmembran och lyft öglan platinatråd bort så att explantatet kvar på membranet på en plan yta med den ventrikulära yta i kontakt med membran.
8. Lyft försiktigt membranet och pipettera 50 pl CSF eller andra medier under membranet.
9. Täck bildenheten skålen, placera den i en fuktig sekundär behållare, och inkubera vid 37 ° C i 5% CO ₂ under 24 timmar för att främja fortsatt celltillväxt och explantation tillväxt. Figur 2 visar en schematisk bild av den slutliga kortikala explantatet skålen beredning.

Representative Results

CSF kollektionen ska ge en tydlig, transparent vätska. Det bör inte finnas några tecken på förorening från blod, vilket framgår av en röd eller gul färgad vätska i aspirera och i Eppendorf-rör. Det bör också finnas några tecken på vävnad i aspirationsposition och Eppendorf-rör. När CSF centrifugeras, kan man också bedöma CSF mikroskopiskt för att säkerställa att det inte finns någon kontaminering. Om det finns tecken på förorening bör CSF kasseras. Från en E14.5 mus kull kan en förutse samla 10-15 ul CSF. Tabell 1 visar genomsnittliga volymer av CSF samlats in från genomsnittliga kullstorlek hos både möss och råttor från olika embryonala åldrar. När rena CSF prover har samlats in, kan CSF analyseras med hjälp av en rad olika tekniker. Figur 3 visar en representativ gel silverfärgad med 2UG av mus E14.5 CSF.

Cerebrala kortikala explantat kan odlas kvickheth varierande volymer av CSF plus en basmedium vid behov så att den totala volymen är 50 | il. Figur 4 visar representativa explantat odlas med 50 | il 100% embryonal CSF under 24 timmar. Explantaten har visat sig överleva och proliferera med 100% CSF och har vävnad histologi som liknar gnagare embryon vid samma graviditetsålder ^9, såsom indikeras av immunoreaktiviteten för fosfo-histon H3 (PH3), en markör för celldelning, längs den ventrikulära yta, BrdU, en markör för DNA-syntes, inkorporering längs ventrikulära zonen och Tuj1, en neuronal markör, i utvecklingsländerna kortikala plattan.

Sprague Dawley kull Embryonala Ålder	Volym per kull	CD1 kull embryonala Ålder	Volym per kull
E13	30-50 ul	E10.5	15-20 ul
E14	40-75 ul	E12.5	15-20 ul
E16	50-90 ul	E14.5	10-15 ul
E18	40-75 ul	E16.5	5-10 ul

Tabell 1. Genomsnittliga volymer av CSF som erhållits från standard Sized kullar.

Figur 1. Schematisk Skissera cerebrala kortikala Explantation Dissection.

Figur 2. Skiss av Final maträtten Tillredningstid.

Figur 3. Silverfärgning av mus E14.5 CSF. Detta är en representativ silverfärgning av 2UG mus E14.5 CSF-protein kördes på 4-12% Bis-Tris NuPAGE gradientgel från Invitrogen. Silverfärgning gjort med SilverQuest silver färgningskit utvecklats under 5 min 40 sek.

Figur 4. E15 råtta kortikala explantat odlas under 24 timmar. Dessa representativa bilder av cerebrala kortikala explantat odlas under 24 timmar i 100% linda CSF. Dessa explantat har fastställts av Carnoys metod, paraffin i snitt, och förberett för immunfärgning. PH3 (röd), och Tuj1 (grön), BrdU (blå).

Discussion

Den beskrivna metoden för ventrikulär CSF insamling har gett relativt rena prover av embryonala CSF med stabil proteinkomposition och konsekvent aktivitet i ett antal cellulära analyser ^9. Med en bra samling teknik och kullstorlek på tio E14.5 möss, kan man förvänta sig att samla 10-15 il CSF och från en kull på E16 råttor kan man förvänta att samla cirka 50-90 il CSF. Denna samling teknik minimerar kontaminering från blod och vävnad, genom noggrann observation, centrifugering och kassering av prover med några bevis på cellulära skräp eller blod skiftning. Vi har analyserat fluiden mikroskopiskt att bedöma för cellulärt skräp eller celler inom cerebrospinalvätskan efter centrifugering, och fann att prover som inte har någon pellet efter centrifugering är fria från cellulära föroreningar. I motsats till proteomet av utvecklingsländerna hjärnvävnad eller prover av kontaminerade CSF (data ej visade), som använder denna metod av CSF extraktion,CSF proteomet innehöll inga mitokondriella proteiner när analyseras med en masspektrometer ^6.

Baserat på den fysiska lokaliseringen av den ventrikulära CSF inom telencephalic blåsor och neuralrörsdefekter, den enda metoden för isolering är att tränga igenom utvecklingsländerna hud, skallben och telencephalon. Därför är nålinförande genom dessa vävnader en källa för eventuella föroreningar. Spetsen av nålen bör vara så smal som möjligt, så att nålen kan föras in smidigt genom vävnaden och in i ventrikeln. Mikro-kapillärpipett kan samla vävnad inuti hålet i nålen under införandet av nålen i ventrikeln. Beroende på ålder av embryot, och om koroidea plexus har utvecklats inom ventrikeln, är det viktigt att inte suga innehållet i koroidea plexus in i pipetten. Det är emellertid viktigt att skapa tillräckligt undertryck så att CSF samlar in tHan pipett utan att störa omgivande utveckla hjärnvävnad eller plexus koroidea. Närvaron av vävnadskontamination kan visualiseras under dissektionsmikroskop, genom pipettering CSF på en glasskiva med en täckglas och direkt visualisera för cellrester.

De metoder vi beskriver för CSF isolering ger relativt rena prover av CSF som vi har bestämt hittills. När kända förorenade CSF-prover har analyserats med hjälp av masspektrometri, har de avslöjat närvaron av mitokondriella proteiner (data ej visade). En inneboende svaghet i tekniken är att CSF erhålls genom punktering utvecklingsländerna skallen och kortex, och därför celler och vävnader kan vara närvarande i CSF. Genom centrifugering CSF, analys av en pellet, och mikroskopiskt analysera CSF under mikroskop, har vi optimerat en metod för CSF isolering som ger relativt rena prover av CSF.

Tekniken feller ventrikulär linda CSF insamling och cerebrala kortikala explantat har beskrivits och visats i filmen för en embryonal mus. Emellertid kan denna teknik användas för ventrikulär CSF insamling och cerebrala kortikala explantat från alla embryonala gnagare och har tillämpats på både råttor och möss. Den metod som beskrivs i detta protokoll har utvecklats speciellt för isolering av ventrikulär CSF och är inte avsedd för uppsamling av CSF i subaraknoidalrummet.

Tekniken för cerebrala kortikala explantat skapades för att kunna växa explantat med en minskad volym av media, med tanke på de begränsade mängder embryonala CSF för enskilda experiment. Den minsta volymen av mediet som används för att odla explantat tillförlitligt under 24 h var 50 pl. Ibland var explantaten odlas längre än 24 timmar, med den längsta är 72 timmar. Med längre experiment, är det bäst att komplettera odlingsmediet varje 24 timmar. När explantat are odlas under den önskade tidsperioden, kan explantaten kan användas för ett antal olika analyser, inklusive immunofluoresence, genererar neurosfärer, celldöd, eller RNA-extraktion.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Wiretrop II capillary needles	Drummond Scientific	#5-000-2020
Sylgard	Ellsworth Adhesives	#184 SIL ELAST kit
Aspirator tube assembly	Sigma	#A5177-5EA
Disposable filter	Venturi or local pharmacy	not available	Standard cigarette filter
Roundstock opthalmic knife (15 degree stab knife)	World Precision Instruments, Inc.	#500250
35mm glass bottomed culture dish	MatTek Corp.	#P35G-1.5-14-C
Platinum-iridium wire	Tritech Research	#PT-9010-010-3FT
Nuclepore Track-Etch Membrane	Whatman	#09-300-57
Hanks Balanced Salt Solution	Fisher Scientific	#SH30031.FS
Iridectomy Scissors	Fine Science Tools	#15000-02