Summary
Здесь мы рассмотрим два анализы, которые были созданы для изучения возрастных нейродегенеративных дофаминергических (ДА) нейронов в
Abstract
Дрозофилы является ценным организма моделью для изучения старения и патологических дегенеративных процессов в нервной системе. Преимущества летать в качестве экспериментальной системе, включают свой генетический трактабильность, короткий срок службы, а также возможность наблюдать и количественно анализируют сложные поведения. Выражение заболеваний связанных генов в специфических популяций нейронов головного мозга Drosophila, могут быть использованы для моделирования человеческих нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера 5.
Дофаминергические (DA) нейроны являются одними из самых уязвимых популяций нейронов в процессе старения человеческого мозга. При болезни Паркинсона (БП), наиболее распространенными нейродегенеративных расстройств движения, ускоренной потери DA нейронов приводит к прогрессирующему и необратимому снижению двигательной функции. Помимо возраста и воздействия токсинов окружающей среды, потеря да нейронов усугубляется специфических мутаций в кодирующихили промоторных областей ряда генов. Выявление таких PD-связанных аллелей обеспечивает экспериментальную базу для использования Drosophila в качестве модели для изучения нейродегенерацию DA нейронов в живом организме. Например, экспрессия PD-связанный человеческий α-синуклеина гена у дрозофилы DA повторяет нейронов некоторые особенности болезней человека, например прогрессирующую потерю нейронов DA и снижение двигательной функции 2. Соответственно, эта модель была успешно использована для выявления потенциальных терапевтических мишеней при БП 8.
Здесь мы рассмотрим два анализов, которые обычно используются для изучения возрастных нейродегенеративных DA нейронов у дрозофилы: восхождение анализ, основанный на испуг индуцированных отрицательный ответ геотаксис и тирозин гидроксилазы иммуноокрашивания целого мозга взрослого монтирует контролировать количество да нейронов в разном возрасте. В обоих случаях в естественных условиях выражение UAS тransgenes в частности, в нейронах DA может быть достигнуто с помощью тирозин-гидроксилазы (TH) промотор-Gal4 драйверов линии 3, 10.
Introduction
Специфичность анализов, описанных здесь опирается на использование Gal4 шнура, который использует регуляторные последовательности гена тирозин-гидроксилазы для достижения конкретных выражение в дофаминергических нейронов 3. Тирозингидроксилаза катализирует первую и ограничивающей скорость стадией в синтезе дофамина. TH иммунореактивности в мозге взрослой мухи накладывается на допамин, что делает TH хорошим кандидатом для выявления да нейронов в естественных условиях (см., например, 6). Более того, характер экспрессии THGal4 является более конкретным, чем у других Gal4 линии, такие как DdcGal4, которая содержит регуляторные последовательности из гена допа-декарбоксилазы и приводит трансгенной экспрессии не только в нейронах DA, но и в серотонинергических нейронов и подмножества глиальные клетки три .
Feany и Бендер (2000) первым заметил, что пан-нейронов выражение PD-α человека связан-синуклеина ускоряет прогрессирующей потерей станцииrtle индуцированных негативное поведение геотаксис у дрозофилы. Мы наблюдали подобные результаты помощью DA-нейронов конкретных THGal4 линии ездить expressionof α-синуклеина трансгенов 10 и использовать этот функционал для чтения с целью изучения роли нейропротекторные Nrf2 пути в этом Drosophila модели БП 14. Конкретные анализа, описанного здесь адаптирован из 2 и 3.
Мозг дрозофилы содержит более 100 DA нейронов, расположены по меньшей мере 5 различных кластеров (PPL1, PPL2, PAL, PPM1 / 2, PPM3), которые могут быть визуализированы в тотальных мозга с помощью конфокальной микроскопии (см., например, 11 и 7). До сих пор спорным, является ли количество нейронов DA в мозге Drosophila снижается с возрастом 9, 11, однако возрастной нейродегенерации наблюдается у мух где PD-сцепленных генов мутировали / сверхэкспрессия для моделирования болезней человека5. Выражение человеческого α-синуклеина в DA нейронов имеет такой эффект, а значит, был использован в качестве модели для PD. Здесь мы опишем тест для DA нейронов рассчитывать на весь мозг монтирует использованием TH как клеточный маркер. Этот анализ был адаптирован от 13 до 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Startle индуцированных отрицательном анализе геотаксис
- Выберите мух нужного генотипа, разделите их по полу, случайно сгруппировать их в когортах 20-30 животных и отражение их в новые флаконы еды каждые 2-3 дня; тестов каждый набор мух (т.е. соответствующего возраста когорты, одна когорта / генотип) по крайней мере раз в неделю.
- За тридцать минут до отрицательного теста геотаксис, обезболить мух с CO 2 и поместить их в предварительно меченных прозрачные пластиковые трубы, изготовленные с двумя пустыми флаконами питания (см. материалы таблица) присоединился в их отверстия с четкими лентой (размер камеры: 19 см х 2,85 см). В нашем анализе мы обычно используем 25 мух / трубки.
Примечание. Время восстановления после анестезии может изменяться от нескольких минут до нескольких часов (например, O / N), а также должна быть оптимизирована для конкретного генотипа испытания. - Отметить разной высоты (от 1 до 20 см) на лист промокательной бумаги и ленты бумаги на вертикальной поверхностное, перпендикулярного к скамейке.
- Место труб перед бумаге: трубы должны быть все выровнены и как можно ближе к бумаге, чтобы позволить точного измерения высоты.
- Поместите цифровой камеры (см. "Специальное оборудование" таблицы) в передней части трубы, на расстоянии 20-30 см от бумаги, на подставке (например, коробку пипетки), выберите "фильм" вариант и начать записи; в это время вы также должны начать таймер для отслеживания времени между последовательными испытаниями.
- Разрешить мух собирать на дне пробирки, нажав на трубке в течение нескольких секунд (например, 10 секунд). Этот шаг должен выполняться последовательно (то же продолжительности, так же силы, того же оператора) в течение всего эксперимента.
- Запись мух движения с цифровой камеры в течение 10 сек.
- Повторите шаги 1.5-1.7 четырнадцать раз в одно-минутным интервалом.
- Анализ данных:
- Подсчитайте количество мух, которые находятся выше2 см знак после 10 сек при визуальном осмотре записанные фильмы.
Примечание: В наших условиях анализа мух негативное поведение геотаксис не последний за пределы первых 10 секунд после поразительное (т.е. мухи начали двигаться во всех направлениях через 10 секунд после вспугнуть). Минимальное расстояние увеличилось на контроль мух (т.е. 1 неделя мух выражающие THGal4 драйвера см. легенду рис. 1) в это время окно было 2 см. Таким образом, мы использовали 2 см марки в качестве основы для анализа скалолазание мух разных возрастов и генотипы 10 сек после начала поведения. Эти параметры могут потребовать настройки для учета различий в поведении мух испытания (например, из-за различных генетических фонов или лабораторных условиях). Обратите внимание, что в наших условиях анализа, все генотипы испытания выполняются хуже или так же, мухи контролем генотипа. - Возьмем среднее значение результатов от пятнадцатииспытаниях.
- Экспресс средний в виде процента от общего количества мух в трубку (= восхождение% активности); количество повторов (N) задается число независимых когортах испытания для каждого генотипа
- Оценка статистическое значение между различными генотипами с течением времени. Это может быть достигнуто с Т-критерий Стьюдента (при сравнении двух генотипов) или 2-полосная ANOVA анализа по Бонферрони апостериорного теста (при выполнении нескольких сравнений) с использованием коммерческого программного обеспечения, таких как GraphPad (GraphPad Software, Inc.La Хойя, Калифорния, США).
- Подсчитайте количество мух, которые находятся выше2 см знак после 10 сек при визуальном осмотре записанные фильмы.
Внимание
Мы выполняем все наши анализы в то же время суток, при комнатной температуре и при тех же условиях освещения. Ведение мух в 12 часов циклом свет / темнота среды рекомендуется контролировать влияние циркадных ритмов на поведение опорно-двигательного мух.
2. Тирозин гидроксилазы ИммунофлуоресценцияКоличественный анализ тотальных мозга
Растворы и буферы
Фиксирующий раствор: 4% параформальдегид (PFA) в фосфатном буферном растворе (PBS)
Промывочный буфер: 0,1% Тритон Х-100 в PBS
Блокирующий буфер: 0,1 М Трис-HCl, рН 7,5, 0,15 М NaCl, 0,1% Тритон Х-100 и 0,5% BSA
Монтаж СМИ: Mowiol-Dabco (см. протокол, описанный в Харлоу E, D. Lane, Антитела-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor лаборатории Press, Cold Spring Harbor, Нью-Йорк, США, 10:418 (1988))
Процедура
- Положите мух в рассечение блюдо заполнено 70% этанола в течение приблизительно 1 мин для удаления кутикулы воска.
- Передача летит в другую рассечение блюдо заполнено ледяным PBS.
- Проанализируйте мозга:
- Наведите лету с вентральной стороной вверх (опционально: удалить крыльев и ног).
- Потяните голову от тела: использовать один набор щипцыдержаться за тело и еще один, чтобы держаться за кутикулой под глазом, чтобы предотвратить повреждение мозга
- Снимите хоботка.
- Держись за голову кутикулы на противоположных сторонах щели остается открытой после удаления хоботком и тянуть в противоположном направлении, пока мозг не будет удален из головной капсулы.
- Удалить все кутикулы из мозга.
- Удалить все заполненные воздухом трахеи, это позволит предотвратить мозга от плавающих в течение следующих этапов инкубации.
- Вырезать несколько миллиметров от кончика P-200 пипетки и уравновешивают его с 0,1%-ным раствором Triton X-100/PBS
- Использование подготовленных P-200 пипетки, передача мозги на 0,5 мл Eppendorf трубки, заполненной 0,5 мл 4% PFA / PBS и держать на льду до вскрытия не будет завершена.
- Исправить мозги при комнатной температуре в течение 20 мин: нанести легким вращением, поставив Эппендорф труб на стойке и размещение стойка на nutator.
- Снимите фиксаториспользованием P-1000 микропипеткой, добавляют 0,5 мл 0,1% X-100/PBS Тритон, перемешать с помощью инверсии и пусть инкубировать 1 минуту; повторить эту стадию промывки один раз.
- Удалите буфер из второй стирки, добавляют 0,5 мл 0,1% Тритон X-100/PBS и пусть инкубируют при комнатной температуре в течение 20 мин; повторить этот шаг дважды.
- Удалить промывочного буфера и пусть мозги инкубировали в блокирующем буфере (0,1 М Трис-HCl, рН 7,5, 0,15 М NaCl, 0,1% Тритон Х-100 и 0,5% БСА) в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Выдержите мозги разведении 1:100 анти-TH антител (см. "Таблица специфических реагентов") в блокировании решения, в течение двух дней, при 4 ° С, с легким вращением (см. шаг 2.6.).
- Повторите шаги стиральной 2.7. и 2,8 ..
- Равновесие мозги разведении 1:200 вторичных antibodyin блокирующий раствор, в течение двух дней, при 4 ° С, с легким вращением.
- Повторите шаги стиральной 2.7. и 2,8 ..
- Подготовьте монтажные защелки, как показано на рисунке 2А:
- дд 2 x 25 мкл капли монтажа средств массовой информации для покровного стекла (24 х 60 мм, нет. 1.5).
- Поместите два покровных стекол (размер 18 х 18 мм, нет. 2) на монтажной СМИ, оставляя зазор в середине слайда и дайте высохнуть.
- Снимите промывочный буфер, добавить 50 мкл монтажа носителе и позволяют мозгу, чтобы уравновесить с ним с помощью пипетки вверх и вниз.
- Использование порогового P-200 пипетки (см. шаг 2.4) передать мозги к слайду в пространстве между двумя покровные и покроют их покровного нет. 1,5 (см. рисунок 2А; ориентироваться мозги на слайде см. 7).
Примечание: Образцы установлены между двумя покровных стекол, чтобы визуализация оба передних и ПостRIOR стороне мозга. - Заполнять все пространство между крышкой очки с монтажными средствами массовой информации; пипетки из угла в угол, чтобы удалить весь воздух, дайте высохнуть и печать с лаком для ногтей.
- Для оценки количества дофаминергических нейронов в определенном кластере приобретать серию оптических срезов вдоль оси с 1,0 мкм размер шага с использованием конфокального микроскопа (для идентификации анатомических дофаминергических кластеров в головном мозге взрослых Drosophila см. 7).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы использовали анализы, описанные здесь, чтобы изучить роль стресса защитные путь Nrf2 в модели дрозофилы PD 14. Эта модель основана на экспрессию человеческого α-синуклеина в нейронах DA использованием TH Gal4 водитель 2, 10.
На рисунке 1 показана представитель результате испуга индуцированного отрицательный геотаксис (восхождение) анализа в самцов мух, экспрессирующих различные трансгены под контролем TH Gal4 водителя. Все генотипы испытания демонстрируют снижение двигательной активности с течением времени, однако, летит выражающие PD-связаны, человеческий α-синуклеина трансгенов демонстрируют ускоренное снижение относительно соответствующего возраста мух управления (TH Gal4 водитель в одиночку) или летит коэкспрессирующей Nrf2 ДНК-связывающего партнера Маф-S. Аналогичные результаты наблюдались в женских мух.
Фиг.2 иллюстрирует типичный результат для TH иммунофлуоресценции на основе DAнейрон считается. Влияние различных генетический фон от количества PPL1 нейронов в мозге от 4 недельных самцов мух количественно, как описано в подписи к фигуре. Обратите внимание на небольшую, но значимую потерю PPL1 нейронов в мозге от мух выражения α-синуклеина.
Рисунок 1. Startle индуцированных отрицательном анализе геотаксис. Когорты соответствующего возраста мух указанных генотипов были протестированы на двигательную активность в одно-недельными интервалами. Восхождение активность вычисляли путем подсчета количества мух выше 2 см метка 10 сек после нажатия флакона и выражая это значение в процентах от общего количества мух, содержащихся в ампулу. Данные показаны ± SEM из пяти независимых когорт 20-30 мух. Значение оценивали с помощью двусторонней ANOVA с Бонферрони апостериорного теста (P <0,05). Разницамежду TH, α-Synflies и мух из трех других генотипов испытания было значительным в 4 и 5 недель.
Рисунок 2. Обнаружение и количество нейронов DA с помощью иммунофлуоресценции TH. А. Блок-схема иллюстрирует протокол для подготовки мозга слайдов. Для более подробного описания каждого шага см. текст. B. Репрезентативная микрофотография тотальных мозга (правая hemibrain, задний вид) иммунологическое окрашивание на ТД. Набор конфокальной Z-серии изображений была приобретена с Leica SP2 конфокальной микроскопии, объектив 40Х масла (N / A 1,25), средняя рамка 2, шаг размером 1 мкм, в 1024 х 1024 формат и скомпилирован как максимальный выступ ( показаны). Положение кластер PPL1 DA нейронов выделена. C. представитель RESULTS для DA нейронов отсчеты, полученные с использованием TH иммунной окраски. Количество нейронов в кластере PPL1 оценивали путем проверки отдельных изображений каждого конфокальной Z-серии. N представляет собой количество независимых выборок проанализированы для каждого генотипа. Данные являются средними ± SEM Значение оценивали с помощью Т-критерий Стьюдента (* р <0,05). Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Генотип: «Con», THGal4 / +; THGal4 / +; "БАС-син, THGal4, UAS
ΑSynuclein-/ +; THGal4, UAS-αSynuclein / +; 'UAS-Маф-S', THGal4/UASMaf-S; THGal4 / +; 'UAS-α SYN / UAS-Маф-S', THGal4, UAS-αSynuclein / UASMaf-S; THGal4, UAS-αSynuclein / +; 'Keap1 EY5, THGal4 / +; THGal4/keap1 EY5;' UAS-α Syn/keap1 EY5, THGal4, UAS-αSynuclein / +; THGal4, UAS -αSynuclein/keap1 EY5.
[Воспроизводится по Бароне и соавт. 2011) по согласованию с «открытого доступа» политики «болезнь моделей и механизмов".]
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Анализы, описанные здесь обеспечить полезный подход к изучению роли определенных генов, сигнальных путей или небольших соединений в поддержании DA нейронов в процессе старения, а также в различных болезней, связанных генетическим фоном (см. обзор в 5).
Испуга-индуцированной негативное поведение геотаксис дрозофилы была широко используется в качестве функционального считывания для функционирования нейронов в различных DA генетический фон, особенно в присутствии PD-связанных мутаций. Некоторые расхождения между различных исследований наблюдалось (см. 12 на более подробное обсуждение). Они были приписаны по крайней мере частично различным анализа установок и условий, в том числе количество мух испытаны в каждую пробирку (одна муха против когорты мух), время восстановления после CO 2-опосредованного анестезии и число последовательных испытаний (см. 4 и 11 в качестве примера дианализа различны х установок). Поэтому было бы целесообразно контролировать такие параметры, и при необходимости их оптимизации для конкретных требований анализа.
Количественное нейронов DA по TH иммунное / конфокальной микроскопии был использован взаимозаменяемо с методом, основанным на THGal4 управляемой выражение GFP и идентификации нейронов DA по флуоресценции GFP / конфокальной микроскопии. Оба метода дают сопоставимые результаты в большинстве случаев, однако, в общем, метод TH иммунной предпочтительнее нами и другими исследователями как она чувствительна к функциональным состоянием нейронов DA. Для более детального сравнения см. 11 и 10. Этот анализ может быть дополнен путем измерения уровня допамина в лету руководители гомогенаты [см. 1 в качестве примера].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Мы заявляем, что у нас нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим Лев Pallanck для лета акции, Кристин Соммерс в технической помощи и Герасим Павлович Sykiotis за полезные обсуждения. Эта работа финансировалась подготовка NIH грант T32CA009363 к MCB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody | Millipore | AB152 | |
| Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-026-152 | |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| DABCO | Sigma | D2522 | |
| Equipment | |||
| Polystyrene vials | VWR | 89092-734 | 28.5 x 95 mm |
| Digital camera | Canon | PowerShot A3100IS (model) | 12.1 Megapixels 4X Optical Zoom |
| Glass coverslips no. 1.5 | VWR | 48366 205 48393 252 | Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm |
| Glass coverslips no. 2 | VWR | 48368-040 | Size: 18 x 18 mm |
| Dissection dishes | Electron Microscopy Sciences | 70543-01 | Size: 30 mm O.D. |
| Dumostar No. 5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72705-01 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 (model) | |
| Confocal microscope | Leica | SP2 or SP5 (model) | |
Materials Table. |
|||
References
- Bayersdorfer, F., Voigt, A., Schneuwly,, Botella, J. Dopamine-dependent neurodegeneration in Drosophila models of familial and sporadic Parkinson's disease. Neurobiol. Dis. 40, 113-119 (2010).
- Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson's disease. Nature. 404, 394-398 (2000).
- Friggi-Grelin, F., Coulom, H., Meller, M., Gomez, D., Hirsh, J., Birman, S. Targeted gene expression in Drosophila dopaminergic cells using regulatory sequences from tyrosine hydroxylase. J. Neurobiol. 54, 618-627 (2003).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).
- Hirth, F. Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 504-523 (2010).
- Lundell, M., Hirsh, J. Temporal and spacial development of serotonin and dopamine neurons in the Drosophila CNS. Dev. Biol. 165, 385-396 (1994).
- Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).
- Mizuno, H., Fujikake, N., Wada, K., Nagai, Y. Alpha-Synuclein Transgenic Drosophila As a Model of Parkinson's Disease and Related Synucleinopathies. Parkinsons Dis. 2011, 212706 (2011).
- Neckameyer, W. S., Woodrome, S., Holt, B., Mayer, A. Dopamine and senescence in Drosophila melanogaster. Neurobiol. Aging. 21, 145-152 (2000).
- Trinh, K., Moore, K., et al. Induction of the phase II detoxification pathway suppresses neuron loss in Drosophila models of Parkinson's disease. J. Neurosci. 28, 465-472 (2008).
- White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila. Front Neurosci. 4, 205 (2010).
- Whitworth, A. J., Wes, P. D., Pallanck, L. J. Drosophila models pioneer a new approach to drug discovery for Parkinson's disease. Drug Discov. Today. 11, 119-126 (2006).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat. Protoc. 1, 2110-2115 (2006).
- Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson's disease. Dis. Model Mech. 4 (5), 701-707 (2011).
