Summary
Простой и надежный способ для визуализации и количественной дыхательных путей подвижность ресничек и реснички создан поток с помощью мыши трахеи описано. Этот способ может быть модифицирован, чтобы определить, как широкий спектр факторов, влияющих реснички подвижность, в том числе фармакологические агенты, генетические факторы, воздействия окружающей среды и / или механических факторов, таких как слизь нагрузки.
Abstract
Бывших естественных условиях технику для работы с изображениями мыши эпителия дыхательных путей для количественного анализа подвижных функция ресничек важно для понимания функции мукоцилиарного клиренс был создан. Свежесобранных мыши трахею разрезают в продольном направлении через trachealis мышц и установлен в мелкой стенами палаты по стеклянным дном блюда. Образец трахеи, расположенных вдоль его продольной оси, чтобы воспользоваться trachealis мышц к скручиванию в продольном направлении. Это дает возможность получить изображение цилиарной движения в виде профиля по всей длине трахеи. Видео со скоростью 200 кадров / сек получены с использованием дифференциального интерференционного контрастной микроскопии и высокоскоростные цифровые камеры, чтобы позволить количественного анализа ресничек частота биений и цилиарного сигнала. С добавлением флуоресцентные шарики во время съемки, реснички генерируется поток жидкости также может быть определена. Протокол отрезки времени около 30 мин, всего 5 мин для приготовления камере, 5-10 мин для образцамонтаж, и 10-15 мин для видеомикроскопии.
Introduction
Анализ функции подвижных ресничек эпителия дыхательных путей экспериментально важно для выяснения генетических и экологических факторов, которые могут повлиять мукоцилиарный клиренс и легочной здоровья 1. Простой протокол, разработанный для работы с изображениями мыши эпителия дыхательных путей обеспечивает эффективный способ, чтобы допросить подвижность ресничек в дыхательных путях мутанта и нокаут модели мыши и требуются только базовые навыки в мышь рассечение тканей трахеи и бывших естественных изображений ресничками дыхательных путей с высокой подвижностью видеомикроскопии разрешение. Этот протокол был создан и уточняться в ходе крупномасштабной экрана мутагенеза мыши для обеспечения быстрой оценки функции подвижные реснички (частота реснички бить, бить форму реснички, реснички создан поток) у мутантов с врожденными пороками сердца, связанных с heterotaxy 2-5.
Современные методы используются для изучения подвижности ресничек дыхательных путей могут быть сгруппированы либо в естественных условиях острого типа бывших или LONGER термин в пробирке экспериментальных подходов. Острых опытах, последующую визуализации естественных носа человека / дыхательных путей биопсии кистью 6,7 и анализ простых поперечных срезов дыхательных путей 8. В пробирке подходы используют различные методы клеточной культуры для создания листов мерцательного эпителия дифференцированных например в воздухе жидких культур интерфейса или дыхательных путей суспензионных культур 9-11. Однако эти методы эпителия дыхательных путей reciliation требуют очень значительных затрат времени и подготовки, прежде чем какая-либо полезная мерцательного эпителия клетки производятся для экспериментов (4-6 недели 9,10). В то время как анализ естественных условиях острой Ех эпителия дыхательных путей биопсии кисти обычно используются для человека клинические исследования, этот метод не может использоваться в исследованиях на мышах усугубляется из-за механического повреждения тканей 12.
Техники, изложенные в настоящем Протоколе для анализа МОВэлектронной трахеи эпителия дыхательных путей не только простых для исполнения, но это не требует никаких специальных навыков вскрытия, ни специального оборудования, кроме тех, стандартных для работы с изображениями на видеомикроскопии. Есть много преимуществ для этого простой протокол. Во-первых, как ткани мыши трахеи урожай быстро и легко выполнить, оно позволяет для быстрой оценки функции ресничек дыхательных путей в большом количестве мышей. Это может включать острое анализ краткосрочных эффектов различных в пробирке лечения. Второй, будучи бывшим технику естественных условиях, мерцательного эпителия дыхательных путей остается прикрепленным к нему, лежащих в основе опорных тканей и, следовательно, вести соответствующие клеточных сигнальных путей. Поэтому по сравнению с в пробирке reciliated эпителия дыхательных путей, этот препарат является лучшим представлением естественной среды в ткани естественных условиях. В-третьих, этот протокол позволяет приобретение целого ряда различных количественных параметров, которые могут обеспечить объективную оценку подвижные реснички Fпомазание. Наконец, в отличие от других современных методов для визуализации ресничками дыхательных путей, этот протокол позволяет выводить реснички под прямым углом к направлению удара реснички, позволяющий вид профиля реснички, оптимальные для получения изображения с высоким разрешением реснички избили и метахрональная поколения волны .
Этот протокол может быть модифицирован различными способами для решения широкого круга экспериментальных потребностей, таких как роли фармакологических агентов, генетические факторы, воздействия окружающей среды и / или механических факторов, таких как слизь нагрузки на функции дыхательных путей реснички и генерации / поддержание дыхательных путей бить ресничек и метахрональная распространения волны.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Реагенты установки
1.1 Вскрытие и визуализирующей среды
L-15 Лейбовица среды (L15) дополняется с FBS (10%) и пенициллин-стрептомицин (100 единиц / мл пенициллина G натрия и 100 мкг / мл стрептомицина сульфата) используется как во время сбора урожая и обработки изображений образцов трахеи.
2. Неглубокой стеной палаты Ассамблеи культуры
В камере используется для хранения трахеи ткани показано на рисунке 1. Пол камеры является стеклянным дном 35 мм культуры блюдо. Верхние и боковые палаты формируется путем размещения небольшой кусочек толщиной 0,3 мм пленка силиконовая над стеклянной посуде. Край лист разрезают по размеру круглый блюдо дно и центром далее зачищается, чтобы сформировать мелкие центральной камеры (см. шаги 2.1-2.3). На вершине этой Ассамблеи, 18 мм круглые стекла покровного стекла помещают для создания закрытой камере подходят для визуализации.
- Полностью покройте 18 мм круглые стекла покровного стекла с квадратным 0,3 мм листа толщиной от силикона.
- Со стандартными острыми ножницами рассечение обрезать избыток силиконовой пленкой с краев покровного стекла (в результате кругового слоем силиконовой пленкой).
- Острым скальпелем вырезать и удалить центральную площадь силиконовой пленкой (примерно 10 квадратных мм) с середины покрытый покровного стекла (образуя верхнюю и боковые камеры Imaging).
3. Трахеи Harvest и подготовка
- Усыпить мышей в соответствии с местными институциональными уходу и использованию животных комитета и / или правительственных руководящих принципов и удалить трахею в стандартный пластиковый 35 мм культуры блюдо с достаточным L15 средств массовой информации, чтобы погрузить ткань (авторы использовали мышей непосредственно перед родами на сроке 16,5 день, вплоть до новорожденных, неонатальный и взрослых животных 2).
- Удалить, не связанного трахеи ткани прикреплены к внешнейтрахеи использованием тупым.
- Снимите с гортанью поперечный разрез чуть ниже перстневидного хряща с использованием микро рассечение ножницами (рис. 2А, линия 1).
- Удалить левой и правой основной бронхиальной ветви с поперечный разрез чуть выше киля с использованием микро ножницы рассечение (Фигура 2А, строка 2).
- Придерживая трахеи с тонким пинцетом и промыть полость 2-3 раза с ~ 1 мл купание среде L15 с Pipetman P1000 и P1000 наконечник, чтобы устранить слизи и крови.
- Вырежьте 3-4 сегмента кольца трахеи использованием поперечный разрез с микро-рассечение ножницами (рис. 2В, линия 1).
- Cut в продольном направлении через середину trachealis мышц этого короткого сегмента трахеи с использованием микро ножницы рассечение (Фиг.2В, строка 2).
- Cut в продольном направлении через середину кольца трахеи хряща с использованием микро ножницы рассечение (фиг.2С рисунке 2D).
4. Реснички изображений
- Передача трахеи ткани сегментов, просвет стороной вниз на середину 35 мм со стеклянным дном чашки для культивирования с 100-200 мкл L-15 среды.
- Для количественной оценки реснички генерируется поток добавляют небольшое количество флуоресцентных 0,20 мкм микросферы с L-15 среда купание образца трахеи ткани (~ 1 × 10 11 частиц / мл или 20 мкл / мл Fluoresbrite 2,5% водной суспензии микросфер).
- Поместите изображения камеры подготовлены заранее (см. процедуру 1-3 выше) в верхней части трахеи силиконовые образец лист стороной вниз, образца трахеи расположен в середине мелкий стенами камеры, образованной окно разрезать на силиконовой пленки (рис. 1 ).
- Аккуратно нажмите на покровное установить на месте и удалите излишки L-15 средств массовой информации из Усин краяGA P1000 P1000 наконечник и Pipetman.
- Установите 35 мм блюдо со стеклянным дном культуры и трахеи образца на инвертированный микроскоп 100X с объективными и DIC оптики.
- С помощью высокоскоростной камеры и программное обеспечение фильм приобретение собирать фильмы ресничек подвижность при 200 кадров в секунду вдоль ресничного трахеи из изогнутого вверх краем мышцы trachealis (рис. 2D прямоугольнике, E: Пример неподвижное изображение из записанных видео) (Дополнительные Фильм 1).
- Использование FITC epifluorescent изображений и низкой освещенности ПЗС (см. список оборудования выше), собирают фильмы флуоресцентных микросфер движение по поверхности мерцательного трахеи, чтобы позже количественного ресничек генерируется поток (дополнительные фильма 2).
5. Количественный подвижность ресничек
- Загрузите DIC отображаемого фильмов в пакет программного обеспечения ImageJ и следуя методике, описанной ЯАйн Драммонд 13 использовать линию инструмент для рисования растровых линии, пересекающей избиении ресничками. "Изменить конфигурацию" этой линии генерирует изображение кимографа типа, где реснички движение по всей линии генерирует волновой картины. Количество пикселей между каждой волны пика их измерены (один пиксель = один фильм кадр), из которых количество ударов в минуту (т.е. Гц) может быть вычислена.
- Для измерения реснички генерируется поток нагрузки флуоресцентного шарик фильмов в пакет программного обеспечения ImageJ и использовать плагин MTrackJ 14 вручную отслеживать флуоресцентные шарики по всей поверхности эпителии трахеи и позволить программному обеспечению генерировать шарик скорости и направленности для каждого шарика отслеживаются.
Следует проявлять осторожность при использовании люминесцентные бусины для количественного потока по мере удаления от избиения ресничек может сильно повлиять измеренной величины потока. Шарик в движении Справочная Фильм 2 является хорошим примером этого. В этом примере шарикДвижение быстро на поверхности ресничек избиения и существенно падает для бисера дальше купания в средствах массовой информации. Чтобы контролировать это, шарик обводка должна быть собраны только на фиксированном расстоянии выше мерцательного эпителия во всех образцах, чтобы позволить правильное проводить сравнения. И, наконец, чтобы получить репрезентативные данные о жидкости, шарики должны быть найдены для как можно дольше, мы предпочитаем использовать шарик треков, которые охватывают 10 + ресничных клеток для расчета потока жидкости.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Управление ресничками дыхательных путей должно быть хорошо виден и видел биться на скоординированной основе (Справочная Movie 1; воспроизведения видео замедлился до 15% в реальном времени), с заметными поток в направлении удара ресничек (Справочная Фильм 2; воспроизведение фильма на 100% реальном времени). Количественный ресничек фильмы должны дать результаты, аналогичные тому, которое наблюдалось на рисунке 3. Коллекция высокоскоростных DIC кино делает возможным количественное реснички частота биений (фиг.3С), и дает хорошие изображения для качественной оценки реснички форма бит, в то время как отслеживание флуоресцентные шарики позволяет измерять ресничек генерируется скорость потока (рис. 3D) и направленности (рис. 3Е).
Мы используем направленности дать индекс линейного потока. Направленность рассчитывается путем деления полного смещения пройденное флуоресцентный слой (т.е. кратчайшееРасстояние между начальной и конечной точками трассировки) на расстояние флуоресцентного шарик перемещается по всей трассы. Таким образом, флуоресцентный шарик перемещения по прямой линии будет иметь направленности в то время как один флуоресцентный шарик извилистые широко от прямого пути будет иметь направленность намного меньше, чем 1.
Мы отображаемого образцов до часа без каких-либо существенных изменений относительно функции ресничек бить.
Рисунок 1. Расширенное изометрической проекции культуры настройка блюдо и трахеи позиционирования образца. NB: покровного листа и силиконовые должны быть собраны до ввода образца трахее в культуре блюдо.
Рисунок 2. Пример вскрытие мышей трахеи с использованием этого протокола, начиная с интактным трахеи (А) до конечного отображаемого результате (E) (см. процедуру шаги 3.2-3.8 для объяснения метки). Шкала бары в AD представляют 500 мкм. Шкала бар в E составляет 25 мкм.
Рисунок 3. Ожидаемые результаты получены с использованием мыши дикого типа трахеи образец, подготовленный Протокол, описанный здесь. () Одного кадра из высокоскоростного фильма DIC (См. дополнительный фильм для 1 представителя DIC фильма). (B) Движение треков четыре люминесцентные бусины через SurfAСЕ эпителий трахеи образца (См. дополнительный фильм 2 представителя для флуоресцентных фильма). (C) частота реснички бить количественно от высокоскоростных DIC подвижность ресничек фильмы (N = 41 случайных точечных измерений от 6 трахеи мыши). (D) Скорость и (Е) направленность потока количественно от отслеживания движения люминесцентные шарик по поверхности трахеи образцы эпителия (N = 31 флуоресцентного шарик обводка с 6 трахеи мыши). Данные смещается как среднее ± SEM. Масштабные линейки 10 мкм.
Справочная Фильм 1. DIC фильм, показывающий форму реснички избили и реснички создан поток наблюдался с помощью мыши дикого типа трахеи образца. Фильм собрал в 200 кадров в секунду, в то время воспроизведения 30 кадров в секунду. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм .
Справочная Фильм 2. Фильм ресничек GEnerated поток через мыши дикого типа трахеи образца с использованием 0,20 мкм флуоресцентные микросферы и epifluorescent микроскопии. Коллекция фильмов и воспроизведения составляет 15 кадров в секунду. Нажмите здесь, чтобы посмотреть фильм .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Измерение частота биений ресничек (CBF) относительно легко Использование мощных микроскопа цели и быстро аппаратного захвата изображений 13,15, и объясняет, почему CBF измерений основой Большинство исследований с целью мукоцилиарный клиренс во здоровья и болезни. Тем не менее, в то время как CBF измерений необходимо для понимания мукоцилиарный клиренс, измерение CBF только игнорирует основные важность как цилиарной создан поток и ресничек бить сигнал, оба из которых являются более трудно измерить, часто игнорируются, и может не коррелировать с CBF. Примером того, как увеличилось CBF могут не соответствовать увеличился цилиарной создан поток наблюдается в некоторых пациентов с DNAH11 мутаций. DNAH11 является аксонемных динеин тяжелой белковой цепи, мутации в которых, как сообщается, вызывают как гиперкинетический (быстрее) цилиарного бить и аномальные формы волны бить ресничками, которые, по прогнозам, вызвать проблемы с мукоцилиарный клиренс 16. SignificaNT преимущество нашего протокола является то, что она позволяет легко визуализировать реснички под прямым углом к направлению удара реснички, позволяющий вид профиля ресничек, что является оптимальным для высокого разрешения ресничек форме избили и реснички генерируется поток жидкости по всей поверхности избиение реснички, что позволяет прямое сравнение CBF с ресничками сигнала бить и / или реснички создан поток в пределах одного образца.
Еще одним преимуществом этого метода является то, что реснички в свежесобранных трахеи сохраняют способность биться на скоординированной основе по всей поверхности эпителия дыхательных путей, что позволяет легко корреляция между МК и реснички создан поток. Такие скоординированные цилиарного движения не наблюдается в reciliating мыши трахеи эпителиальных культур, которые часто плохо ресничками и показать реснички бить в случайных направлениях 9,10. Скоординированных цилиарной бить наблюдать с помощью техники эпителий трахеи описанные здесь, могут предоставить средства для яnterrogate механизмы, регулирующие координацию цилиарного бить и его потенциальную роль в мукоцилиарный клиренс.
Наиболее сложной частью этого протокола для исследований будет трахеи препарат, в том числе очистки жира и соединительной ткани с поверхности трахеи (рис. 2), и в продольном направлении, проходящем через середину мышц trachealis (Рис. 2b, строка 2). Мы находим хорошее использованием микро ножницы рассечение необходимым как для очистки тканей и последующей trachealisotomy. Кроме того, мы обнаружили, что проще в использовании нижней части трахеи просто впереди килем трахеи, где разветвляется на левой и правой основной бронхов как trachealis мышцы здесь широком. Тем не менее, с достаточным опытом, любой длины трахеи или даже первичные бронхи могут быть успешно использованы для создания высококачественного видео подвижности ресничек и реснички генерировать поток.
Возможные техническиеПроблемы, связанные с этим протоколом включают образца трахеи перемещения во время съемки и / или образца не в состоянии попадает в фокус. Обе эти проблемы могут возникнуть, если слишком много L-15 был добавлен с образцом и / или крышка изображения камеры скольжения не была нажата вниз надежно, это вызывает образца плавать в камере покровным стеклом в результате перемещения образца или образца плавающий выше фокальной плоскости фокуса делает невозможной. Чтобы избежать этого, важно, чтобы попытаться свести к минимуму количество жидкости, используемой для монтирования каждого образца трахеи.
Возможное ограничение этого метода является то, что измерения ресничек генерируется поток жидкости может не полностью соответствовать в естественных условиях мукоцилиарного транспорта. Наш вывод ресничек создан поток ~ 10 мкм / сек значительно меньше, чем 100 мкм / сек мукоцилиарного транспорта сообщили об использовании в естественных условиях мыши трахеи 17. Эта разница, вероятно, из-за ресничек погружения в СМИ как OPPosed для простого перемещения тонкого слоя слизи через воздух-жидкость. Тем не менее, у этого метода есть отличная утилита для относительного сравнения цилиарной подвижности между различными образцами.
Следует отметить, что в то время как методика эксперимента и данные, представленные здесь проводили при комнатной температуре, температура сама играет значительную роль в регуляции активности ресничек. CBF в носа человека и трахеи образцы Видно, что линейно коррелирует с температурой 5-20 ° С, с небольшим увеличением CBF видно между 20-45 ° C 18. Мы видим подобное отношение между температурой и CBF в мышь образцы дыхательных путях (неопубликованные наблюдения). Таким образом, в то время как мы записывали активность ресничек при комнатной температуре для быстрой оценки возможных дефектов в подвижности ресничек в романе мутантных мышей, мы также некоторые образцы инкубировать при 37 ° С для определения активности ресничек в физиологических условиях. Для достижения этой цели стандартный CH инкубации микроскопомянтарные может быть использована для поддержания образцов при 37 ° С.
Простые изменения настоящего Протокола сделает его мощным инструментом для оценки дыхательных путей регулирования деятельности ресничек на целый ряд факторов, таких как роль фармакологических агентов, температура, генетические факторы, воздействия окружающей среды, и / или механических факторов, таких как слизь нагрузки на функции дыхательных путей и ресничек поколения / обслуживание дыхательных путей бить ресничками.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Проект был поддержан грантом NIH U01HL098180 от Национального сердца, легких и крови институт. Материал предназначен исключительно ответственности авторов и не обязательно отражают официальную точку зрения Национального сердца, легких и крови институт или Национального института здоровья
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30088.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x fine forceps | Roboz | RS-4976 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5676 | |
| Micro dissection scissors | Roboz | RS-5620 | |
| Scalpel | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 pipetman | Gilson, Inc | F123602 | |
| P1000 tips | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 mm round glass cover slips | Fisher Scientific | 430588 | |
| Plastic 35 mm culture dishes | Corning | 430588 | |
| Glass bottom 35 mm culture dishes | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
| Silicone sheet 0.012" (0.3 mm) thick | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 09834-10 | |
| Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters | Lecia | DMIRE2 | Brand is not critical. |
| 100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters | Lecia | Brand is not critical. | |
| Microscope stage Incubator | Lecia | 11521749 | Not required if imaging cilia at room temperature |
| High-speed camera bright field | Vision Research | Phantom v4.2 | Brand is not critical. Must be faster than 125 fps |
| High-speed fluorescent camera | Hamamatsu | C9100-12 | Brand is not critical. Must be faster than 10 fps |
| Movie analysis software | National Institutes of Health | ImageJ with MtrackJ plugin |
References
- Stannard, W., O'Callaghan, C. Ciliary function and the role of cilia in clearance. J. Aerosol. Med. 19, 110-115 (2006).
- Francis, R. J., et al. The initiation and maturation of cilia generated flow in the newborn and postnatal mouse airway. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, 1067-1075 (2009).
- Aune, C. N., et al. Mouse model of heterotaxy with single ventricle spectrum of cardiac anomalies. Pediatric Research. 63, 9-14 (2008).
- Tan, S. Y., et al. Heterotaxy and complex structural heart defects in a mutant mouse model of primary ciliary dyskinesia. J. Clin. Invest. 117, 3742-3752 (2007).
- Zhang, Z., et al. Massively parallel sequencing identifies the gene Megf8 with ENU-induced mutation causing heterotaxy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3219-3224 (2009).
- Caruso, G., Gelardi, M., Passali, G. C., de Santi, M. M. Nasal scraping in diagnosing ciliary dyskinesia. Am. J. Rhinol. 21, 702-705 (2007).
- Leigh, M. W., Zariwala, M. A., Knowles, M. R. Primary ciliary dyskinesia: improving the diagnostic approach. Curr. Opin. Pediatr. 21, 320-325 (2009).
- Delmotte, P., Sanderson, M. J. Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 35, 110-117 (2006).
- Choe, M. M., Tomei, A. A., Swartz, M. A. Physiological 3D tissue model of the airway wall and mucosa. Nat. Protoc. 1, 357-362 (2006).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol. Med. 107, 183-206 (2005).
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 1315-1321 (2002).
- Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. Eur. Respir. J. 34, 401-404 (2009).
- Drummond, I.
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
- Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. J. Microsc. 211, 103-111 (2003).
- Schwabe, G. C., et al. Primary ciliary dyskinesia associated with normal axoneme ultrastructure is caused by DNAH11 mutations. Hum. Mutat. 29, 289-298 (2008).
- Shah, A. S., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome proteins alters the morphology and function of motile cilia in airway epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3380-3385 (2008).
- Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 76, 335-338 (1992).
