Summary
Una tecnica semplice e affidabile per la visualizzazione e la quantificazione delle vie aeree ciglia motilità e ciglia flusso generato usando il mouse trachea è descritto. Questa tecnica può essere modificato per determinare come una vasta gamma di fattori influenza cilia motilità, compresi agenti farmacologici, fattori genetici, esposizioni ambientali, e / o fattori meccanici come carico muco.
Abstract
È stata stabilita una tecnica ex vivo per l'imaging del mouse epiteli delle vie respiratorie per l'analisi quantitativa della funzione ciglia motile importante per la comprensione funzione della clearance mucociliare. Appena raccolto il mouse trachea è tagliato longitudinalmente attraverso il muscolo trachealis e montato in una camera murata bassa su un piatto fondo di vetro. Il campione trachea è posizionato lungo il suo asse lungo di approfittare del muscolo trachealis ad arricciarsi longitudinalmente. Questo permette l'imaging di movimento ciliare nella vista profilo lungo l'intera lunghezza tracheale. I video a 200 frame / sec si ottengono utilizzando interferenza differenziale microscopia a contrasto e una fotocamera digitale ad alta velocità per consentire l'analisi quantitativa delle ciglia frequenza del battito ciliare e forma d'onda. Con l'aggiunta di perline fluorescenti durante l'imaging, cilia flusso di fluido generato anche può essere determinato. Il tempo di protocollo si estende a circa 30 minuti, con 5 minuti per la preparazione della camera, 5-10 min per campionemontaggio, e 10-15 minuti per videomicroscopia.
Introduction
Analisi della funzione di cilia motili nella epiteli delle vie aeree è sperimentalmente importanti per la comprensione dei fattori genetici e ambientali che possono influenzare la clearance mucociliare e la salute polmonare 1. La semplice protocollo sviluppato per l'imaging del mouse epiteli delle vie aeree fornisce un metodo efficiente per interrogare vie respiratorie ciglia motilità nei modelli mutanti e knockout topo e richiedono solo competenze di base in topo tracheale dissezione dei tessuti ed ex imaging in vivo di vie ciglia motilità con videomicroscopia alta risoluzione. Questo protocollo è stato istituito e perfezionato nel corso di una schermata di mutagenesi del mouse su larga scala per consentire una rapida valutazione della funzione delle ciglia mobili (cilia frequenza del battito, forma battito delle ciglia, ciglia flusso generato) in mutanti con cardiopatia congenita associata a heterotaxy 2-5.
Le attuali tecniche utilizzate per lo studio delle vie respiratorie ciglia motilità possono essere raggruppati in due l'ex vivo tipo acuto o lontermine ger in approcci sperimentali in vitro. Esperimenti acuti includono ex vivo di visualizzazione nasali / vie aeree biopsie spazzola umani 6,7 e analisi di semplici sezioni trasversali 8 vie respiratorie. Gli approcci in vitro utilizzano varie tecniche di coltura cellulare per produrre fogli di differenziata epiteli ciliato, come nelle culture di interfaccia Liquid Air o respiratori sospensione culture 9-11. Tuttavia, queste vie respiratorie epiteli tecniche reciliation richiedono investimenti molto significativo nel tempo e la formazione prima di tutte le cellule epiteliali ciliate utilizzabili sono prodotte per la sperimentazione (4-6 settimane 9,10). Mentre acuta analisi ex vivo delle vie respiratorie epiteliali biopsie pennello sono comunemente utilizzati per gli studi clinici umani, questo metodo non è utilizzabile in studi del mouse a causa di lesioni aggravate tessuto meccanico 12.
La tecnica descritta in questo protocollo per l'analisi del moustracheale e vie aeree epiteli non è solo semplice da eseguire, ma non richiede particolari doti dissezione né le attrezzature specializzate, oltre a quelli standard per l'imaging da videomicroscopia. Ci sono molti vantaggi a questo semplice protocollo. Prima, come mouse trachea raccolta dei tessuti è rapida e facile da eseguire, esso consente la rapida valutazione della funzione cilia vie aeree in un gran numero di topi. Questo può includere analisi acuta degli effetti a breve termine diversi trattamenti in vitro. Secondo, essendo una tecnica ex vivo, l'epitelio ciliato vie respiratorie rimane attaccata ad esso sottostanti tessuti di sostegno e conservano quindi associate percorsi di segnalazione cellulare. Quindi in confronto a in vitro reciliated epiteli delle vie aeree, questa preparazione è una migliore rappresentazione del naturale in ambiente tessuto vivo. Terzo, questo protocollo permette l'acquisizione di una serie di parametri quantitativi differenti che possono fornire la valutazione oggettiva motile cilia funzione. Infine, a differenza di altri metodi attuali per via aerea visualizzazione cilia, questo protocollo permette la visualizzazione delle ciglia perpendicolarmente alla direzione battito ciglia, permettendo vista di profilo delle ciglia che è ottimale per l'imaging ad alta risoluzione del battito ciglia e generazione di onda metacronale .
Questo protocollo può essere modificato in vari modi per affrontare una vasta gamma di esigenze sperimentali come il ruolo di agenti farmacologici, fattori genetici, esposizioni ambientali, e / o fattori meccanici come carico sulla funzione cilia muco delle vie aeree e la generazione / manutenzione di vie respiratorie battito delle ciglia e propagazione delle onde metacronale.
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Protocol
1. Setup Reagenti
1.1 Dissezione e immagini Media
L-15 Leibovitz (L15) è completato con FBS (10%) e penicillina-streptomicina (100 unità / ml di penicillina G sodica e 100 pg / ml di streptomicina solfato) è usato sia durante il raccolto e di imaging di campioni trachea.
2. Shallow Walled Cultura della Camera dell'Assemblea
La camera utilizzato per contenere trachea tessuto è mostrato in Figura 1. Il pavimento della camera è il fondo di vetro 35 millimetri capsula di Petri. La parte superiore e laterale della camera è generato mettendo un piccolo pezzo di 0,3 mm di spessore fogli silicone sopra il piatto di vetro. Il bordo del foglio è tagliato per adattarsi al piatto fondo rotondo ed il centro è ulteriormente tagliato per formare una camera centrale poco profonda (vedere i punti 2.1-2.3). In cima a questa assemblea, un vetrino di vetro 18 millimetri rotonda è posto per generare un ambiente avente adatto per l'imaging.
- Coprire completamente il vetrino in vetro mm 18 round con un quadrato di 0,3 mm di spessore rivestimento di silicone.
- Con forbici normali dissezione netta tagliare il telone di silicone in eccesso intorno al bordo del vetrino (risultante in uno strato circolare di fogli di silicone).
- Con un bisturi affilato tagliare e rimuovere una piazza centrale di fogli di silicone (circa 10 mm quadrati) dal centro del vetrino coperto (formando così la parte superiore e sui lati della camera di imaging).
3. Trachea Raccolta e Preparazione
- Euthanize topi secondo locale la cura degli animali istituzionale e utilizzare comitato e / o linee guida governative e rimuovere trachea in plastica 35 millimetri capsula di Petri standard abbastanza L15 supporto al tessuto sommergere (autori hanno usato topi appena prima della nascita al giorno di gestazione 16.5, fino alla appena nati, neonatale e adulto animali 2).
- Rimuovere non trachea corrispondente tessuto applicata all'esterno dila trachea utilizzando dissezione smussa.
- Rimuovere la laringe con un taglio trasversale appena sotto la cartilagine cricoide usando forbici micro dissezione (Figura 2A, linea 1).
- Rimuovere i rami bronchiali principali destro e sinistro con un taglio trasversale appena sopra la carena usando forbici micro dissezione (Figura 2A, linea 2).
- Premere delicatamente la trachea con una pinza sottile e lavare il lume 2-3 volte con circa 1 ml di balneazione L15 mezzo con un P1000 e P1000 Pipetman punta a cancellare qualsiasi muco e sangue.
- Tagliare un segmento di anello 3-4 di trachea utilizzando un taglio trasversale con micro forbici dissezione (Figura 2B, linea 1).
- Tagliare longitudinalmente attraverso il centro del muscolo trachealis di questo breve segmento trachea usando forbici micro dissezione (Figura 2B, linea 2).
- Tagliare longitudinalmente attraverso il centro degli anelli di cartilagine tracheale con micro forbici dissezione (Figura 2C Figura 2D).
4. Cilia Imaging
- Trasferimento segmenti di tessuto trachea, lato lumen giù, sul centro di un mm con fondo di vetro piatto 35 cultura con 100-200 ml di L-15.
- Per quantificare cilia flusso generato aggiungere una piccola quantità di microsfere fluorescenti 0,20 ìm alla L-15 bagnando il campione di tessuto trachea (~ 1 x 10 11 particelle / ml o 20 microlitri / ml della Fluoresbrite 2,5% sospensione acquosa microsfere).
- Posizionare la camera di imaging preparato precedentemente (vedere Procedura di 1-3 sopra) in cima alla trachea campione silicone lato del foglio in basso, con il campione trachea situato nel centro della camera murato superficiale formata dal taglio finestra nella lastra di silicone (figura 1 ).
- Premere delicatamente sul vetrino per fissare in posizione e rimuovere qualsiasi eccesso di L-15 supporti dai bordi usinga P1000 e P1000 punta Pipetman.
- Montare il fondo di vetro cultura piatto 35 millimetri e il campione trachea su un microscopio invertito con ottica 100X oggettivi e DIC.
- Utilizzando una macchina fotografica ad alta velocità e il software di acquisizione filmato raccoglie i film di ciglia motilità a + 200 fotogrammi al secondo lungo il ciliato epiteli tracheale del raggomitolati bordo del muscolo trachealis (box, e figura 2D Delineato: esempio ancora immagine da filmato registrato) (Movie supplementare 1).
- Utilizzando FITC immagini epifluorescente e una luce CCD basso (Vedi elenco delle attrezzature di cui sopra), raccogliere i film di movimento microsfere fluorescenti sulla superficie degli epiteli tracheale ciliato per consentire successivamente la quantificazione delle ciglia flow generato (Movie integrativa 2).
5. Quantificazione di Cilia Motilità
- Caricare DIC film imaged nel pacchetto software ImageJ e seguendo la tecnica descritta da Iain Drummond 13 utilizzare lo strumento linea per tracciare una linea di trama che attraversa le ciglia battere. A "reslice" di questa linea genera un immagine tipo chimografo dove il movimento delle ciglia tutta la linea genera un modello di onda. Il numero di pixel tra ogni picco dell'onda è li misurati (un pixel = un fotogramma filmato) da cui è possibile calcolare il numero di battiti al minuto (cioè Hz).
- Per misurare ciglia generato flussi di carico fluorescenti film tallone nel pacchetto software ImageJ, e usare il plugin MTrackJ 14 per tenere traccia manualmente perline fluorescenti sulla superficie della trachea epiteli e lasciare che il software genera velocità di perline e direzionalità per ciascuna sfera rintracciato.
Si deve prestare attenzione quando si utilizza perline fluorescenti per quantificare il flusso come la distanza tra le ciglia battere può influenzare fortemente il flusso misurato grandezza. Il movimento del tallone in Supplemental Movie 2 è un buon esempio di questo. In questo esempio beadmovimento è veloce alla superficie delle ciglia battere e riduce notevolmente spento per perline più lontano nei media balneazione. Per controllare per questo, perline tracciati dovrebbero essere raccolti solo ad una distanza fissa sopra la epiteli ciliato in tutti i campioni per permettere una comparazione corretta da fare. Infine, per ottenere dati rappresentativi sul flusso del fluido, sfere dovrebbero essere monitorati a lungo possibile, preferiamo usare tracce tallone che coprono 10 + cellule ciliate per calcolare il flusso del fluido.
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Representative Results
Controllo ciglia delle vie aeree deve essere chiaramente visibile e visto da battere in modo coordinato (Movie Supplemental 1; la riproduzione del filmato è rallentato a tempo reale 15%), con un flusso notevole nella direzione di battito delle ciglia (Movie Supplemental 2; la riproduzione di film è al 100% tempo reale). Quantificazione dei film ciglia dovrebbe produrre risultati simili a quello visto in Figura 3. Raccolta di film DIC alta velocità rende possibile la quantificazione delle ciglia frequenza di battimento (Figura 3C) e fornisce buone immagini per valutazione qualitativa forma battito ciglia, mentre l'inseguimento di perline fluorescenti consente la misura della velocità del flusso generato ciglia (Figura 3D) e direzionalità (Figura 3E).
Usiamo direzionalità dare un indice di flusso lineare. Direzionalità è calcolato dividendo la cilindrata totale percorsa da un cordone fluorescente (cioè più brevedistanza tra i punti di inizio e di fine del tracciato) per la distanza di un fluorescenti muove tallone sopra l'intera traccia. Così, una perlina fluorescente muove in linea retta avrebbe una direzionalità di uno mentre una perlina fluorescente meandri ampiamente da un percorso rettilineo avrà una direzionalità molto minore di 1.
Abbiamo ripreso i campioni per un massimo di un'ora con qualsiasi alterazione notevole in funzione di battito delle ciglia.
Figura 1. Ingrandita vista isometrica della cultura piatto configurazione e posizionamento del campione trachea. NB: il foglio coprioggetto e silicone deve essere montato prima di mettere il campione di trachea nel piatto cultura.
Figura 2. Esempio di topo trachea dissezione utilizzando questo protocollo, partendo da una trachea intatta (A) al risultato finale con immagine (E) (vedi procedura passi 3,2-3,8 per la spiegazione di etichette). Barre di scala in AD rappresentano 500 micron. Barra di scala in E è di 25 micron.
Figura 3. Risultati attesi ottenuti utilizzando un tipo selvatico topo trachea campione come preparato dal protocollo qui descritto. (A) Fotogramma singolo da un filmato DIC ad alta velocità (Vedi filmato supplementare 1 per film rappresentativo DIC). (B) le tracce del movimento di quattro perline fluorescenti in tutto il surface di un campione epiteli tracheale (Vedi supplementare film 2 per il film fluorescente rappresentante). (C) Cilia frequenza di battimento quantificato da alta velocità DIC ciglia film motilità (n = 41 misurazioni di punti casuali da 6 tracheas del mouse). (D) velocità di flusso e (E) la direzionalità del flusso quantificato dal tracciamento fluorescente movimento tallone sulla superficie dei campioni epiteliali tracheali (n = 31 fluorescenti tracciati di perline da 6 tracheas del mouse). I dati vengono spostati come media ± SEM. Barre di scala 10 micron.
Supplemental Movie 1. DIC film che mostra la forma battito delle ciglia e ciglia flusso generato osservato utilizzando un tipo selvatico topo trachea campione. Il film è stato raccolto a 200 fps, mentre la riproduzione è di 30 fps. Clicca qui per vedere film .
Supplemental Movie 2. Film di cilia geflusso nerated attraverso un mouse campione di trachea tipo selvatico con 0,20 micron microsfere fluorescenti e microscopia epifluorescente. Collezione di film e la riproduzione è di 15 fps. Clicca qui per vedere film .
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Discussion
Misura della frequenza del battito delle ciglia (CBF) è relativamente facile usando obiettivi del microscopio ad alta potenza e le immagini veloce acquisizione hardware 13,15, e spiega perché le misure CBF sono alla base della maggior parte degli studi indagano clearance mucociliare durante la salute e la malattia. Tuttavia, mentre la misurazione CBF è essenziale per comprendere la clearance mucociliare, la misurazione della CBF solo ignora l'importanza di fondo di entrambi i flussi generati ciliare e ciglia battere forma d'onda, entrambi i quali sono più difficili da misurare, sono spesso ignorati, e non può correlare con CBF. Un esempio di come è aumentato CBF potrebbe non corrispondere con l'aumento del flusso generato ciliare è visto in alcuni pazienti con DNAH11 mutazioni. DNAH11 è una proteina dineina catena pesante axonemal, mutazioni in cui sono stati segnalati per causare sia ipercinetica (più veloce) battito ciliare e anormali ciglia battere forma d'onda che si prevede di causare problemi con clearance mucociliare 16. La significazionent vantaggio del nostro protocollo è che permette una facile visualizzazione delle ciglia perpendicolarmente alla direzione battito ciglia, permettendo una vista di profilo di ciglia che è ottimale per l'imaging ad alta risoluzione di forma battito ciglia e ciglia generato il flusso di fluido attraverso la superficie di battendo le ciglia, permettendo così di confronto diretto con CBF cilia battito forma d'onda e / o ciglia generato il flusso all'interno di un singolo campione.
Un altro vantaggio di questa tecnica è che cilia in appena prelevato trachea mantengono la loro capacità di battere in modo coordinato su tutta la superficie dell'epitelio respiratorio, permettendo così un facile correlazione tra CBF e ciglia flusso generato. Tale movimento ciliare coordinata non è osservata in reciliating topo tracheali culture epiteliali, che spesso ciliato male e mostrano battito delle ciglia in direzioni casuali 9,10. Il battito ciliare coordinata osservata utilizzando la tecnica qui descritta epiteli tracheale può fornire i mezzi per interrogate i meccanismi che regolano il coordinamento battito ciliare e il suo potenziale ruolo nella clearance mucociliare.
La parte più impegnativa di questo protocollo per ricerche sarà preparato trachea, compresa compensazione di grassi e tessuto connettivo dalla superficie trachea (Figura 2a), e tagliando longitudinalmente attraverso il centro del muscolo trachealis (Figura 2b, linea 2). Troviamo utilizzando buone forbici micro dissezione essenziali sia per la compensazione dei tessuti e la successiva trachealisotomy. Inoltre, troviamo più facile utilizzare la parte inferiore della trachea appena anteriormente alla carena dove la trachea si biforca nei bronchi principale destro e sinistro come il muscolo trachealis qui è più ampia. Tuttavia, con sufficiente esperienza, qualsiasi lunghezza della trachea, dei bronchi o addirittura primario può essere utilizzato con successo per generare filmati di alta qualità di ciglia motilità e ciglia generare flussi.
Possibile tecnicoproblemi associati a questo protocollo includono il campione trachea movimento durante l'imaging e / o il campione non poter essere messe a fuoco. Entrambi questi problemi possono sorgere se troppa L-15 è stato aggiunto con il campione e / o il vetrino camera di imaging non è stato premuto in modo sicuro, questo fa sì che il campione di galleggiare all'interno del coperchio della camera slittamento conseguente movimento campione o il campione galleggianti rendendo impossibile fuoco sopra il piano fuoco. Per evitare ciò, è importante cercare di minimizzare la quantità di liquido utilizzato per montare ogni campione trachea.
Una possibile limitazione di questa tecnica è che la misurazione delle ciglia flusso del fluido generato potrebbe non corrispondere completamente nel trasporto mucociliare vivo. La nostra scoperta di ciglia flusso generato di ~ 10 micron / sec è significativamente inferiore ai 100 micron / sec di trasporto mucociliare segnalati usando in vivo del mouse trachea 17. Questa differenza è probabilmente dovuto alle ciglia essere sommerso in media come opposed semplicemente muovendo un sottile strato di muco attraverso l'interfaccia aria-liquido. Tuttavia, questo metodo ha grande utilità per il confronto relativo di motilità ciliare tra campioni diversi.
Va notato che, mentre la tecnica sperimentale e dati qui presentato è stato condotto a temperatura ambiente, temperatura stessa gioca un ruolo significativo nella regolazione dell'attività ciglia. CBF umano in campioni nasale e tracheale è visto essere correlata linearmente con la temperatura tra 5-20 ° C, con un piccolo aumento CBF visto tra 20-45 ° C 18. Vediamo un rapporto simile tra temperatura e CBF nei campioni del mouse vie aeree (osservazioni non pubblicate). Così, mentre si registrano l'attività delle ciglia a temperatura ambiente per una rapida valutazione di eventuali difetti di cilia motilità nel romanzo topi mutanti, abbiamo anche alcuni campioni incubare a 37 ° C per la determinazione di attività cilia in condizioni fisiologiche. Per fare questo un microscopio incubazione ch di serieambra può essere utilizzato per mantenere i campioni a 37 ° C.
Semplici modifiche al presente Protocollo lo renderanno uno strumento potente per valutare la regolamentazione delle attività di ciglia delle vie aeree da parte di un'ampia gamma di fattori quali il ruolo di agenti farmacologici, temperatura, fattori genetici, esposizioni ambientali, e / o di fattori meccanici come il carico di muco sulla funzione delle ciglia delle vie aeree e la generazione / manutenzione delle vie aeree battere ciglia.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il progetto è stato sostenuto da NIH concedere U01HL098180 dal National Heart, Lung, and Blood Institute. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Heart, Lung, and Blood Institute e il National Institutes of Health
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30088.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x fine forceps | Roboz | RS-4976 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5676 | |
| Micro dissection scissors | Roboz | RS-5620 | |
| Scalpel | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 pipetman | Gilson, Inc | F123602 | |
| P1000 tips | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 mm round glass cover slips | Fisher Scientific | 430588 | |
| Plastic 35 mm culture dishes | Corning | 430588 | |
| Glass bottom 35 mm culture dishes | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
| Silicone sheet 0.012" (0.3 mm) thick | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 09834-10 | |
| Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters | Lecia | DMIRE2 | Brand is not critical. |
| 100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters | Lecia | Brand is not critical. | |
| Microscope stage Incubator | Lecia | 11521749 | Not required if imaging cilia at room temperature |
| High-speed camera bright field | Vision Research | Phantom v4.2 | Brand is not critical. Must be faster than 125 fps |
| High-speed fluorescent camera | Hamamatsu | C9100-12 | Brand is not critical. Must be faster than 10 fps |
| Movie analysis software | National Institutes of Health | ImageJ with MtrackJ plugin |
References
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