Summary
Une technique simple et fiable pour la visualisation et quantification des voies respiratoires motilité des cils et cils de flux générés en utilisant la souris trachée est décrite. Cette technique peut être modifiée pour déterminer comment un grand nombre de facteurs influencent la motilité des cils, y compris les agents pharmacologiques, des facteurs génétiques, expositions environnementales, et / ou des facteurs mécaniques tels que la charge de mucus.
Abstract
Une technique ex vivo pour l'imagerie souris épithélium des voies respiratoires pour l'analyse quantitative de la fonction de cils mobiles importante pour comprendre la fonction de la clairance mucociliaire a été établi. Fraîchement récoltées souris trachée est coupé longitudinalement à travers le muscle trachéal et monté dans une chambre fortifiée peu profonde sur un plat à fond de verre. L'échantillon trachée est positionné le long de son axe pour tirer profit du muscle trachéal à se recourber longitudinalement. Cela permet à l'imagerie du mouvement ciliaire dans la vue de profil sur toute la longueur trachéale. Vidéos à 200 images / sec sont obtenus en utilisant l'interférence différentiel microscopie en contraste et une caméra numérique à haute vitesse pour permettre une analyse quantitative de la fréquence de battement des cils et forme d'onde ciliaire. Avec l'ajout de billes fluorescentes lors de l'imagerie, les cils écoulement de fluide générée peut également être déterminé. Le temps de protocole couvre environ 30 min, à 5 min de préparation chambre, 5-10 min pour l'échantillonmontage et 10-15 min pour vidéomicroscopie.
Introduction
Analyse de la fonction de cils mobiles dans l'épithélium des voies respiratoires est expérimentalement importantes pour comprendre les facteurs génétiques et environnementaux qui peuvent affecter la clairance muco-ciliaire et la santé pulmonaire 1. Le protocole simple mis au point pour l'imagerie de la souris épithélium des voies respiratoires constitue une méthode efficace pour interroger voies cils motilité des modèles mutants et KO souris et ne nécessitent que des compétences de base chez la souris dissection du tissu trachéal et l'imagerie ex vivo des voies respiratoires cils motilité avec vidéo-microscopie à haute résolution. Ce protocole a été établi et perfectionné au cours d'un écran de mutagenèse souris à grande échelle pour permettre une évaluation rapide de la fonction de cils mobiles (fréquence de battement de cils, la forme de battement de cils, cils flow généré) dans des mutants présentant une cardiopathie congénitale associée à hétérotaxie 2-5.
Les techniques actuelles utilisées pour étudier la motilité des cils des voies aériennes peuvent être regroupées en deux l'ancien type vivo ou lon aiguëger terme dans les approches expérimentales in vitro. Expériences aigus comprennent visualisation ex vivo de nasales / voies aériennes biopsies humaines brosse 6,7 et une analyse des sections transversales des voies respiratoires simples 8. Les approches in vitro utilisent diverses techniques de culture cellulaire pour générer des feuilles de l'épithélium cilié différenciée comme dans les cultures de l'interface air liquide ou respiratoires cultures de suspension 9-11. Cependant, ces techniques de reciliation épithélium des voies respiratoires nécessitent des investissements très importants en temps et en formation avant les cellules épithéliales ciliées utilisables sont produites pour l'expérimentation (4-6 semaines 9,10). Bien que l'analyse ex vivo aiguë des voies respiratoires biopsies de pinceau épithéliales sont couramment utilisées pour les études cliniques chez l'homme, cette méthode n'est pas utilisable dans les études de souris dues à une lésion tissulaire mécanique exacerbée 12.
La technique décrite dans ce protocole pour l'analyse des protocoles d'ententee trachéale épithélium des voies respiratoires n'est pas seulement simple à réaliser, mais il ne nécessite pas de compétences particulières de dissection, ni aucun équipement spécialisé en dehors de celles norme d'imagerie par vidéo-microscopie. Il ya de nombreux avantages à ce protocole très simple. Tout d'abord, comme la récolte de tissus trachée de la souris est rapide et facile à réaliser, il permet une évaluation rapide de la fonction des cils des voies aériennes dans un grand nombre de souris. Cela peut inclure une analyse aiguë des effets à court terme des différents traitements in vitro. D'autre part, étant une technique ex vivo, l'épithélium respiratoire cilié reste attaché à elle sous-jacent tissus de soutien et de conserver ainsi les voies de signalisation cellulaire associées. Par conséquent, en comparaison avec in vitro reciliated épithélium des voies respiratoires, cette préparation est une meilleure représentation de la nature dans un environnement de tissus in vivo. Troisièmement, ce protocole permet l'acquisition d'un certain nombre de paramètres quantitatifs qui peuvent fournir une évaluation objective de la motilité ciliaire fonction. Enfin, contrairement à d'autres méthodes actuelles de voies cils visualisation, ce protocole permet de visualiser des cils perpendiculairement à la direction de battement de cils, ce qui permet la vue de profil des cils qui est optimale pour l'imagerie à haute résolution de battement de cils et de génération d'ondes metachronal .
Ce protocole peut être modifié dans un certain nombre de façons d'aborder un large éventail de besoins expérimentaux tels que le rôle des agents pharmacologiques, des facteurs génétiques, expositions environnementales, et / ou des facteurs mécaniques tels que la charge de mucus sur la fonction des cils des voies respiratoires et de la production / maintenance de voies respiratoires battement de cils et de la propagation des ondes metachronal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Réactifs Setup
1.1 Dissection et l'imagerie moyen
L-15 du milieu de Leibovitz (L15) est complété avec du FBS (10%) et pénicilline-streptomycine (100 unités / ml de pénicilline G sodique et 100 pg / ml de sulfate de streptomycine) est utilisé à la fois pendant la récolte et de l'imagerie d'échantillons trachée.
2. Shallow fortifiée hémicycle de la culture
La chambre utilisée pour maintenir le tissu trachée est illustré à la figure 1. Le sol de la chambre est le fond de verre 35 mm boîte de culture. Le haut et le côté de la chambre est généré en plaçant un petit morceau de 0,3 mm feuilles de silicone épaisse sur le plat en verre. Le bord de la feuille est coupée pour s'adapter à la coupelle à fond rond et le centre est en outre découpé pour former une chambre centrale peu profonde (voir les étapes 2.1 à 2.3). Au sommet de cette assemblée, une lamelle de verre ronde de 18 mm est placé à générer une enceinte appropriée pour l'imagerie.
- Recouvrir complètement un mm en verre ronde glissement 18 de couverture avec un carré de 0,3 mm feuilles de silicone épais.
- Avec des ciseaux de dissection standards couper les feuilles de silicone excès de partout dans le bord de la lamelle (résultant en une couche circulaire de feuilles de silicone).
- Avec un scalpel découper et enlever une place centrale de feuilles de silicone (environ 10 mm de côté) à partir du milieu de la lamelle couvert (formant ainsi le dessus et les côtés de la chambre d'imagerie).
3. Trachée récolte et préparation
- Euthanasier les souris en conformité avec les soins aux animaux institutionnelles locales et utiliser comité et / ou les directives gouvernementales et enlever la trachée en plastique 35 mm boîte de culture standard avec suffisamment L15 médias au tissu de plonger (auteurs ont utilisé des souris juste avant la naissance au jour de gestation 16.5, par le biais de animaux nouveau-nés, néonatale et adulte 2).
- Enlever le tissu non associé trachée fixé à l'extérieur dela trachée en utilisant dissection.
- Retirez le larynx avec une coupe transversale juste au-dessous du cartilage cricoïde l'aide de micro ciseaux de dissection (figure 2A, ligne 1).
- Retirez les branches bronchiques primaires à gauche et à droite avec une coupe transversale juste au-dessus de la carène avec des micro ciseaux de dissection (figure 2A, ligne 2).
- Tenir délicatement la trachée avec une pince fine et rincer la lumière 2-3 fois avec environ 1 ml du milieu L15 de bain avec un P1000 et P1000 Pipteman pointe pour dégager le mucus et du sang.
- Découpez un segment d'anneau 3-4 de la trachée avec une coupe transversale avec micro ciseaux de dissection (figure 2B, ligne 1).
- Couper longitudinalement à travers le milieu du muscle trachéal de ce segment trachée court l'aide de micro ciseaux de dissection (figure 2B, ligne 2).
- Couper longitudinalement au milieu des anneaux de cartilage trachéal l'aide de micro ciseaux de dissection (figure 2C la figure 2D).
4. Imagerie par Cilia
- Transfert segments de tissu trachée, côté lumière vers le bas, sur le milieu d'un mm à fond de verre plat 35 de culture avec 100-200 pi de milieu L-15.
- Pour quantifier les cils flux généré ajouter une petite quantité de fluorescence 0,20 um microsphères dans le milieu L-15 baignant l'échantillon de tissu trachée (~ 1 x 10 11 particules / ml ou de 20 ul / ml de la suspension à 2,5% de microsphères aqueuse Fluoresbrite).
- Placer la chambre d'imagerie préparé précédemment (voir procédure 3.1 ci-dessus) au-dessus de l'échantillon côté de la feuille de silicone trachée vers le bas, avec l'échantillon trachée située au milieu de la chambre à paroi peu profonde formée par la fenêtre découpée dans la feuille de silicone (Figure 1 ).
- Appuyez doucement sur la lamelle pour sécuriser en place et enlever l'excédent L-15 médias de l'usin bordsga P1000 et P1000 pointe Pipetman.
- Monter le fond de verre plat de culture de 35 mm et un échantillon de trachée sur un microscope inversé avec optique 100X objectifs et DIC.
- En utilisant une caméra à haute vitesse et le logiciel d'acquisition de film recueillir films de la motilité des cils à 200 + images par seconde le long de l'épithélium trachéal ciliées de l'recroquevillés bord du muscle trachéal (figure 2D Décrit boîte, E: par exemple image fixe de vidéo enregistrée) (Film supplémentaire 1).
- En utilisant l'imagerie à fluorescence FITC et une caméra CCD bas de lumière (voir la liste des équipements ci-dessus), rassembler films de mouvement de microsphères fluorescentes à travers la surface de l'épithélium trachéal ciliée pour permettre la quantification des cils plus tard flux généré (Movie supplémentaire 2).
5. La quantification de la motilité Cilia
- Chargez films imagés DIC dans le logiciel ImageJ et suivant la technique décrite par Iain Drummond 13 utiliser l'outil Ligne pour tracer une ligne de trame traversant les cils battant. Un "retrancher" de cette ligne génère une image du type à kymographe où le mouvement des cils sur la ligne génère un motif d'onde. Le nombre de pixels entre chaque crête de l'onde est leur mesurés (un pixel = une séquence vidéo) à partir de laquelle le nombre de battements par minute (soit Hz) peut alors être calculée.
- Pour mesurer les cils ont généré des flux de charge films perles fluorescentes dans le logiciel ImageJ, et utiliser le plugin MTrackJ 14 pour suivre manuellement billes fluorescentes sur la surface de l'épithélium de la trachée et de laisser le logiciel génère vitesse perle et la directivité pour chaque perle suivi.
Des précautions doivent être prises lors de l'utilisation des billes fluorescentes pour quantifier le débit comme la distance entre les cils battant peut fortement influencer l'ampleur du débit mesuré. Le mouvement bourrelet supplémentaire Movie 2 est un bon exemple de cela. Dans cet exemple perlele mouvement est rapide à la surface des cils battant et diminue considérablement hors de perles plus loin dans les médias de bain. Pour contrôler cela, tracés de perles ne devraient être collectées à une distance fixe au-dessus de l'épithélium cilié dans tous les échantillons pour permettre des comparaisons appropriées à prendre. Enfin, pour obtenir des données représentatives sur l'écoulement du fluide, perles devraient être suivis aussi longtemps que possible, nous préférons utiliser des pistes de perles qui couvrent les cellules ciliées 10 + pour le calcul de l'écoulement du fluide.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Contrôle des voies aériennes cils doit être clairement visible et vu à battre de manière coordonnée (Film 1 supplémentaire; la lecture du film est ralentie à 15% en temps réel), avec un débit notable dans le sens du battement de cils (Film complémentaire 2; la lecture du film est de 100% temps réel). La quantification des films de cils devrait donner des résultats similaires à ceux observés dans la figure 3. Collection de films DIC à grande vitesse permet la quantification de la fréquence de battement des cils (figure 3C) et donne de bonnes images pour l'évaluation qualitative de la forme de battement des cils, tandis que la poursuite de billes fluorescentes permet de mesurer des cils vitesse d'écoulement généré (figure 3D) et la directivité (figure 3F).
Nous utilisons la directivité de donner un indice de flux linéaire. Directionnalité est calculé en divisant le déplacement totale parcourue par une bille fluorescente (le plus courtdistance entre les points de début et de fin du tracé) par la distance d'une lampe fluorescente se déplace bourrelet par-dessus tout trace. Ainsi, une bille fluorescente se déplaçant en ligne droite, aurait une directivité de l'un tandis qu'une bille fluorescente méandres abondamment à partir d'un trajet rectiligne aura une directivité très inférieur à 1.
Nous avons imager des échantillons jusqu'à une heure sans aucune altération notable de la fonction de battement de cils.
Figure 1. Vue isométrique agrandie de la culture de l'antenne parabolique et le positionnement de l'échantillon trachée. NB: la feuille de lamelle et silicone doit être assemblé avant de mettre l'échantillon trachée dans la boîte de culture.
Figure 2. Exemple d'une trachée dissection de la souris en utilisant ce protocole, à partir d'une trachée intact (A) pour le résultat final imagé (E) (voir Étapes de la procédure 3,2-3,8 pour l'explication des étiquettes). Barres d'échelle dans AD représentent 500 um. La barre d'échelle en E représente 25 um.
Figure 3. Résultats escomptés obtenus à l'aide d'une souris de type échantillon trachée sauvage tel que préparé par le protocole décrit ici. (A) une seule image à partir d'un film de DIC à grande vitesse (Voir la vidéo 1 supplémentaire pour le film DIC représentant). (B) voies de circulation de la quatre billes fluorescentes dans la surfaCE d'un échantillon épithélium trachéal (Voir la vidéo supplémentaire 2 pour le film fluorescent représentant). (C) la fréquence de battement de cils quantifié à partir de films à haute vitesse motilité cils DIC (n = 41 mesures ponctuelles aléatoires de 6 trachées de souris). (D) Vitesse d'écoulement et (E) directionnalité du flux quantifié de suivre les mouvements bille fluorescente sur la surface de l'épithélium trachéal échantillons (n = 31 tracés perles fluorescentes de 6 trachées de souris). Les données sont déplacées en moyenne ± SEM. barres d'échelle 10 um.
Supplemental Film 1. Du film DIC montrant forme de battement de cils et cils de flux généré observée à l'aide d'une souris de type sauvage échantillon trachée. Le film a été recueilli à 200 fps, alors que la lecture est de 30 images par seconde. Cliquez ici pour voir le film .
Supplemental Movie 2. Film de cils geflux transporteur est également exonéré de l'autre côté d'une souris de type sauvage en utilisant échantillon trachée 0,20 um microsphères fluorescentes et la microscopie à fluorescence. Collection de films et de lire est de 15 fps. Cliquez ici pour voir le film .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mesure de la fréquence de battement des cils (CBF) est relativement facile en utilisant objectifs de microscope haute puissance et l'image matériel d'acquisition rapide 13,15, et explique pourquoi les mesures CBF forment la base de la plupart des études portant sur la clairance mucociliaire pendant la santé et la maladie. Cependant, alors que la mesure CBF est essentielle pour comprendre clairance muco-ciliaire, la mesure de CBF seul ignore l'importance fondamentale des deux flux générés ciliaire et la forme d'onde de battement de cils, qui sont tous deux plus difficiles à mesurer, sont souvent ignorés, et peut ne pas corréler avec CBF. Un exemple de la façon dont a augmenté CBF peut ne pas correspondre à l'augmentation du flux généré ciliaire est perçue chez certains patients atteints DNAH11 mutations. DNAH11 est une protéine de la chaîne lourde de dynéine axonémale, mutations dans lesquelles ont été signalés à provoquer à la fois hyperkinétique (plus rapide) battements ciliaires et onde de battement de cils anormaux qui est prévu pour causer des problèmes dont la clairance muco-ciliaire 16. La significant avantage de notre protocole est qu'il permet une visualisation facile des cils perpendiculairement à la direction de battement de cils, permettant une vue de profil de cils qui est optimale pour l'imagerie à haute résolution de la forme de battement de cils et cils généré un flux de fluide à travers la surface de les cils battant, permettant ainsi une comparaison directe des CBF avec forme d'onde de battement de cils et / ou des cils a généré des flux au sein d'un seul échantillon.
Un autre avantage de cette technique est que les cils dans fraîchement récolté trachée conservent leur capacité à battre de manière coordonnée sur toute la surface de l'épithélium respiratoire, permettant ainsi une corrélation facile entre CBF et les cils flow généré. Un tel mouvement ciliaire coordonnée n'est pas observé chez la souris cultures épithéliales de la trachée reciliating, qui ciliées souvent mal et montrent battement de cils dans des directions aléatoires 9,10. Le battement ciliaire coordonnée observé en utilisant la technique de l'épithélium trachéal décrit ici peut fournir les moyens de interrogate les mécanismes de régulation de la coordination des battements ciliaires et son rôle potentiel de la clairance muco-ciliaire.
La partie la plus difficile de ce protocole pour les recherches sera la préparation trachée, y compris la compensation du tissu adipeux et conjonctif de la surface de la trachée (Figure 2a), et coupant longitudinalement à travers le milieu du muscle trachéal (Figure 2b, ligne 2). Nous trouvons en utilisant de bonnes micro ciseaux de dissection essentiels à la fois pour la compensation des tissus et trachealisotomy ultérieure. En outre, nous trouvons qu'il est plus facile d'utiliser la partie inférieure de la trachée juste en avant de la carène où la trachée bifurque dans les bronches primaires à gauche et à droite comme le muscle trachéal ici est plus large. Cependant, avec une expérience suffisante, toute la longueur de la trachée, voire la principale bronches peuvent être utilisés avec succès pour produire des films de haute qualité de la motilité des cils et cils générer des flux.
Possible techniqueles problèmes liés à ce protocole comprennent l'échantillon trachée déplaçant lors de l'imagerie et / ou de l'échantillon ne pouvant être amené dans le foyer. Ces deux problèmes peuvent survenir si trop de L-15 a été ajouté à l'échantillon et / ou la lamelle de chambre d'imagerie n'a pas été enfoncé en toute sécurité, ce qui provoque l'échantillon de flotter à l'intérieur de la chambre de lamelle entraînant le déplacement de l'échantillon ou de l'échantillon flottant au-dessus du plan de mise au point faisant impossible principale. Pour éviter cela, il est important d'essayer de réduire la quantité de liquide utilisé pour monter chaque échantillon trachée.
Une éventuelle limitation de cette technique est que la mesure de cils flux de fluide généré peut ne pas correspondre totalement au transport muco vivo. Notre conclusion des cils flux généré de ~ 10 um / s est nettement moins que les 100 um / sec transports mucociliary rapportés en utilisant in vivo souris trachée 17. Cette différence est probablement due à des cils étant immergé dans les médias comme oppOSED à déplaçant simplement une mince couche de mucus à travers l'interface air-liquide. Néanmoins, cette méthode présente une grande utilité pour la comparaison relative de la motilité ciliaire entre les différents échantillons.
Il convient de noter que, bien que la technique expérimentale et les données présentées ici ont été réalisées à la température ambiante, la température elle-même joue un rôle important dans la régulation de l'activité ciliaire. CBF dans nasale humaine et échantillons de trachée est vu pour être corrélée linéairement avec la température entre 5-20 ° C, avec une légère augmentation du CBF vu entre 20-45 ° C 18. Nous voyons une relation similaire entre la température et CBF dans les échantillons respiratoires souris (observations non publiées). Ainsi, alors que nous l'activité ciliaire de l'enregistrement à la température ambiante pour une évaluation rapide des défauts éventuels de la motilité des cils dans de nouvelles souris mutantes, nous incubons également quelques échantillons à 37 ° C pour déterminer l'activité des cils dans des conditions physiologiques. Pour ce faire une incubation ch de microscope standardambre peut être utilisé pour maintenir des échantillons à 37 ° C.
De simples modifications à ce protocole, il sera un outil puissant pour évaluer la régulation de l'activité des cils des voies aériennes par un large éventail de facteurs tels que le rôle des agents pharmacologiques, la température, les facteurs génétiques, expositions environnementales, et / ou des facteurs mécaniques tels que la charge de mucus sur la fonction des cils des voies respiratoires et de la production / maintenance des voies respiratoires battement de cils.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Le projet a été soutenu par le NIH subvention U01HL098180 du National Heart, Lung, and Blood Institute. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de la National Heart, Lung, and Blood Institute ou le National Institutes of Health
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30088.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x fine forceps | Roboz | RS-4976 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5676 | |
| Micro dissection scissors | Roboz | RS-5620 | |
| Scalpel | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 pipetman | Gilson, Inc | F123602 | |
| P1000 tips | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 mm round glass cover slips | Fisher Scientific | 430588 | |
| Plastic 35 mm culture dishes | Corning | 430588 | |
| Glass bottom 35 mm culture dishes | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
| Silicone sheet 0.012" (0.3 mm) thick | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 09834-10 | |
| Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters | Lecia | DMIRE2 | Brand is not critical. |
| 100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters | Lecia | Brand is not critical. | |
| Microscope stage Incubator | Lecia | 11521749 | Not required if imaging cilia at room temperature |
| High-speed camera bright field | Vision Research | Phantom v4.2 | Brand is not critical. Must be faster than 125 fps |
| High-speed fluorescent camera | Hamamatsu | C9100-12 | Brand is not critical. Must be faster than 10 fps |
| Movie analysis software | National Institutes of Health | ImageJ with MtrackJ plugin |
References
- Stannard, W., O'Callaghan, C. Ciliary function and the role of cilia in clearance. J. Aerosol. Med. 19, 110-115 (2006).
- Francis, R. J., et al. The initiation and maturation of cilia generated flow in the newborn and postnatal mouse airway. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, 1067-1075 (2009).
- Aune, C. N., et al. Mouse model of heterotaxy with single ventricle spectrum of cardiac anomalies. Pediatric Research. 63, 9-14 (2008).
- Tan, S. Y., et al. Heterotaxy and complex structural heart defects in a mutant mouse model of primary ciliary dyskinesia. J. Clin. Invest. 117, 3742-3752 (2007).
- Zhang, Z., et al. Massively parallel sequencing identifies the gene Megf8 with ENU-induced mutation causing heterotaxy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3219-3224 (2009).
- Caruso, G., Gelardi, M., Passali, G. C., de Santi, M. M. Nasal scraping in diagnosing ciliary dyskinesia. Am. J. Rhinol. 21, 702-705 (2007).
- Leigh, M. W., Zariwala, M. A., Knowles, M. R. Primary ciliary dyskinesia: improving the diagnostic approach. Curr. Opin. Pediatr. 21, 320-325 (2009).
- Delmotte, P., Sanderson, M. J. Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 35, 110-117 (2006).
- Choe, M. M., Tomei, A. A., Swartz, M. A. Physiological 3D tissue model of the airway wall and mucosa. Nat. Protoc. 1, 357-362 (2006).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol. Med. 107, 183-206 (2005).
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 1315-1321 (2002).
- Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. Eur. Respir. J. 34, 401-404 (2009).
- Drummond, I.
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
- Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. J. Microsc. 211, 103-111 (2003).
- Schwabe, G. C., et al. Primary ciliary dyskinesia associated with normal axoneme ultrastructure is caused by DNAH11 mutations. Hum. Mutat. 29, 289-298 (2008).
- Shah, A. S., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome proteins alters the morphology and function of motile cilia in airway epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3380-3385 (2008).
- Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 76, 335-338 (1992).
