Abstract
En ex vivo teknik til billeddannelse mus luftvejsepiteler til kvantitativ analyse af motile cilier funktion vigtig for indsigt i mucociliary clearance-funktion er blevet etableret. Friskhøstede mus luftrøret skæres på langs gennem trachealis muskel og monteret i en lavvandet walled kammer på en glas-bund fad. Luftrøret Prøven er placeret langs sin længdeakse for at drage fordel af den trachealis musklen til at krølle langs. Dette muliggør billeddannelse af ciliær bevægelse i profilbilledet langs hele luftrør længden. Videoer på 200 billeder / sek opnås ved anvendelse af differentiel interferens kontrast mikroskopi og en højhastigheds digitalt kamera til at tillade kvantitativ analyse af cilier slagfrekvens og ciliær bølgeform. Med tilføjelsen af fluorescerende perler under billedbehandling, også cilier genereret fluidstrøm kan bestemmes. Protokollen tidsintervallerne omkring 30 minutter, med 5 min til kammeret forberedelse, 5-10 min for prøvemontering, og 10-15 min for videomicroscopy.
Introduction
Analyse af motile cilier funktion i luftvejsepiteler er eksperimentelt vigtig for at belyse de genetiske og miljømæssige faktorer, der kan påvirke mucociliary clearance og pulmonal sundhed 1.. Den enkle protokol udviklet til billeddannelse musen luftvejsepiteler giver en effektiv metode til at afhøre luftvejene cilia motilitet i mutant-og knockout musemodeller og kræver kun grundlæggende færdigheder i muse luftrør væv dissektion og ex vivo billeddannelse af luftvejs cilier motilitet med høj opløsning videomicroscopy. Denne protokol blev etableret og raffineret i en storstilet mus mutagenese skærmen for at give mulighed for hurtig evaluering af motile cilier funktion (cilier slagfrekvens, cilier slog form, cilier genererede flow) i mutanter med medfødt hjertesygdom er forbundet med heterotaxy 2-5.
Aktuelle teknikker, der anvendes til at studere luftvejene cilier motilitet kan grupperes i enten akut ex vivo type eller longer sigt in vitro eksperimentelle tilgange. Akutte eksperimenter omfatter ex vivo visualisering af menneskelige næse / luftveje børste biopsier 6,7 og analyse af simple tværgående luftvejs § § 8. De in vitro metoder udnytter de forskellige cellekulturteknikker at generere ark differentieret cilieret epitheler såsom i luften væskegrænsefladen kulturer eller luftvejs suspension kulturer 9-11. Men disse luftvejsepiteler reciliation teknikker kræver meget betydelige investeringer i tid og uddannelse, før eventuelle brugbare cilierede epitelceller er produceret til eksperimenter (4-6 uger 9,10). Mens akut ex vivo analyse af luftvejs epithelial børste biopsier er almindeligt anvendt til kliniske undersøgelser i mennesker, er denne fremgangsmåde ikke anvendelig i musestudier grund forværret mekanisk vævsskade 12..
Teknikken er beskrevet i denne protokol til analyse af mouse trakeal luftvejsepiteler er ikke kun simpelt at udføre, men det kræver ingen særlige dissektion færdigheder eller nogen specialudstyr udover dem standard for billeddannelse ved videomicroscopy. Der er mange fordele ved denne enkle protokol. Først, når musen luftrør væv høst er hurtig og let at udføre, det giver mulighed for hurtig vurdering af luftvejs cilier funktion i et stort antal mus. Dette kan omfatte akut analyse af de kortsigtede effekter af forskellig in vitro-behandlinger. For det andet, er en ex vivo-teknik, den cilierede luftvejsepitel forbliver knyttet til det underliggende understøttende væv og dermed opretholde tilhørende celle signalveje. Derfor vil der i forhold til in vitro reciliated luftvejsepiteler er dette præparat en bedre repræsentation af det naturlige in vivo væv miljø. For det tredje, denne protokol giver mulighed for erhvervelse af en række forskellige kvantitative parametre, der kan give den objektive vurdering af motile cilier function. Endelig, i modsætning til andre nuværende metoder til luftvejs cilier visualisering, giver denne protokol til visualisering af cilier vinkelret på cilia slå retninger, så profil visning af cilier, som er optimalt for høj opløsning billeddannelse af cilier beat og metachronal frembringelse .
Denne protokol kan ændres på en række måder at løse en bred vifte af eksperimentelle behov, såsom den rolle farmakologiske midler, genetiske faktorer, miljømæssige eksponeringer, og / eller mekaniske faktorer såsom slim belastning på luftvejs cilier funktion og produktion / vedligeholdelse af luftvejs cilier beat og metachronal bølgeudbredelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Reagenser Setup
1.1 Dissektion and Imaging Medium
Leibovitz L-15 medium (L15) er suppleret med FBS (10%) og penicillin-streptomycin (100 enheder / ml penicillin G natrium og 100 ug / ml streptomycin-sulfat) anvendes både under høst og billeddannelse af trachea prøver.
2.. Shallow Walled Culture Chamber Assembly
Kammeret bruges til at holde luftrøret væv er vist i figur 1.. Gulvet i kammeret er glasset bunden 35 mm dyrkningsskål. Toppen og siden af kammeret er genereret ved at placere et lille stykke af 0,3 mm tyk silikone presenningen over glasset skålen. Kanten af arket skåret til at passe den rundbundede skålen og centrum er yderligere trimmet til at danne en lavvandet central afdeling (se trin 2.1-2.3). Oven i denne samling, er et 18 mm runde glas dækglas placeret til at generere et lukket kammer egnet til billeddannelse.
- Helt dækker en 18 mm rund dækglas med et kvadrat på 0,3 mm tyk silikone presenningen.
- Med standard skarp dissektion saks trimme det overskydende silikone presenningen fra omkring kanten af dækglasset (hvilket resulterer i en cirkulær lag silikone presenningen).
- Med en skarp skalpel skåret ud og fjerne en central firkant af silikone presenningen (ca. 10 mm kvadratiske) fra midten af dækket dækglasset (som danner toppen og siderne af billeddannelse kammer).
3.. Luftrør Harvest og klargøring
- Afliv mus i overensstemmelse med lokal institutionel dyrepleje og bruge udvalg og / eller statslige retningslinjer og fjerne luftrøret ind i en standard plast 35 mm dyrkningsskål med nok L15 medier kan dykke væv (forfattere har brugt mus lige før fødslen drægtighed dag 16,5, igennem til nyfødte, neonatal, og voksne dyr 2).
- Fjern ikke-luftrøret associeret væv fastgjort til ydersiden afluftrøret med stump dissektion.
- Fjern strubehovedet med en tværgående snit lige under cricoid brusk ved hjælp af mikro dissektion saks (figur 2A, linie 1).
- Fjern venstre og højre primære bronchiale grene med en tværgående snit lige over carina hjælp af mikro dissektion saks (figur 2A, linje 2).
- Hold forsigtigt luftrøret med fine pincet og skyl lumen 2-3 gange med ~ 1 ml af badning L15 medium med en P1000 Pipetman og P1000 tip til at fjerne eventuelle slim og blod.
- Skær en 3-4 ring segment af luftrøret med en tværgående snit med mikro dissektion saks (figur 2B, linie 1).
- Skære på langs gennem midten af trachealis muskel af denne korte luftrøret segment ved hjælp af mikro dissektion saks (figur 2B, linie 2).
- Skær langs gennem midten af trakeale bruskringene hjælp af mikro dissektion saks (figur 2C figur 2D).
4.. Cilia Imaging
- Overførsel luftrøret vævssegmenter, lumen side nedad på midten af en 35 mm glasbund dyrkningsskål med 100-200 ml L-15 medium.
- At kvantificere cilier genereret strøm tilføje en lille mængde af fluorescerende 0,20 um mikrosfærer til L-15 medium badning luftrøret vævsprøve (~ 1 x 10 11 partikler / ml eller 20 gl / ml af Fluoresbrite 2,5% vandig suspension af mikrokugler).
- Placer billedtromlen kammer forberedt tidligere (Se procedure 1-3 ovenfor) på toppen af luftrøret prøve silikone ark nedad, med luftrøret prøve placeret i midten af den lille walled kammer dannet ved vinduet skåret i silikone presenningen (figur 1 ).
- Tryk forsigtigt ned på dækglasset til at sikre på plads, og fjern eventuelle overskydende L-15 medier fra kanterne usinga P1000 tip og P1000 Pipetman.
- Monter 35 mm glasbund dyrkningsskål og luftrør prøven på et omvendt mikroskop med 100X objektive og DIC optik.
- Ved hjælp af en high-speed kamera og film erhvervelse software indsamle film af cilier motilitet ved 200 + frames per sekund langs cilierede trakeal epiteler af krøllet op kant trachealis musklen (figur 2D Skitseret boks, E: F.eks stillbillede fra optagne film) (Supplerende Movie 1).
- Brug FITC epifluorescerende billeddannelse og en lav lys CCD kamera (se udstyr listen ovenfor), film af fluorescerende mikrosfærer bevægelse indsamler hen over overfladen af den cilierede epitel luftrør for at tillade senere kvantificering af cilier genererede strøm (supplerende Movie 2).
5.. Kvantificering af Cilia Motilitet
- Load DIC afbildede film i ImageJ softwarepakken og efter teknikken beskrevet af jegain Drummond 13 bruge den linje værktøj til at tegne en rasterlinie krydser bankende cilier. A "reslice" for denne linje genererer et kymograph typen billedet, hvor cilia bevægelser over linjen genererer en bølge mønster. Antallet af pixels mellem hver bølge top er dem måles (én pixel = en film ramme), hvorfra antallet af slag i minuttet (dvs. Hz) kan derefter beregnes.
- For at måle cilia genereret flow belastning fluorescerende perle film i ImageJ softwarepakke, og bruge MTrackJ plugin 14 til manuelt at spore fluorescerende perler hen over overfladen af luftrøret epiteler og lad softwaren generere perle hastighed og retningsbestemmelse for hver perle spores.
Der bør udvises forsigtighed ved brug af fluorescerende perler at kvantificere flow som afstanden fra det bankende cilier kan få stor indflydelse på målte flow størrelsesorden. Perlen bevægelse i Supplerende Movie 2 er et godt eksempel på dette. I dette eksempel vulstbevægelse er hurtigt på overfladen af det bankende cilier og signifikant falder ud til perler længere væk i badning medier. Til at styre for dette, bør perle tracings kun indsamles ved en fast afstand over ciliumbærende epiteler i alle prøver at give korrekte sammenligninger skal foretages. Endelig, for at opnå repræsentative data for fluidstrømning, bør perlerne spores så længe som muligt, foretrækker vi at bruge perle spor, der dækker 10 + cilierede celler til beregning fluidstrøm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kontrol luftveje cilia skal være klart synlig og set at slå på en koordineret måde (Supplerende Movie 1, filmafspilning er faldet til 15% realtid) med mærkbar strøm i retning af cilia beat (Supplerende Movie 2, filmafspilning er 100% realtid). Kvantificering af cilia film bør give resultater, der ligner den, der ses i figur 3.. Indsamling af high-speed DIC film gør det muligt at kvantificere cilia slå frekvens (figur 3C), og giver gode billeder til kvalitativ vurdering af cilier slog form, mens sporing af fluorescerende perler giver mulighed for måling af cilier genereret strømningshastighed (Figur 3D) og retningsbestemt (Figur 3E).
Vi bruger retningsvirkning for at give et indeks for lineær strømning. Direktionalitet beregnes ved at dividere den samlede forskydning tilbagelagt af en fluorescerende vulst (dvs. den kortesteafstanden mellem start-og slutpunkter opsporing) ved den afstand, en fluorescerende perle bevæger sig over hele spor. Således vil en fluorescerende vulst bevæger sig i en lige linje have en retningen af en, mens en fluorescerende vulst bugtet udstrakt fra en lige bane, vil have en retningsbestemmelse meget mindre end 1.
Vi har afbildet prøver i op til en time uden nogen mærkbar ændring i cilier slog funktion.
Figur 1.. Forstørret isometrisk billede af kultur fad opsætning og luftrør prøve positionering. NB: dækglasset og silikone arket skal samles forud for gennemførelsen af luftrøret prøven i dyrkningsskålen.
Figur 2. Eksempel på en mus luftrøret dissektion benytter denne protokol, startende fra en intakt luftrøret (A) til den endelige afbildede resultat (E) (se fremgangsmådetrinnene 3,2-3,8 til forklaring af etiketter). Skalapanelerne i AD repræsenterer 500 um. Målestokken i E repræsenterer 25 um.
Figur 3.. Forventede resultater opnås ved en vildtype mus luftrøret prøve som er udarbejdet af den protokol, der er beskrevet her. (A) enkelt billede fra en high-speed DIC film (se supplerende film 1 for repræsentativ DIC film). (B) bevægelse spor af fire fluorescerende perler hele Surface for en trakeal epiteler prøve (se supplerende filmen 2 for repræsentative fluorescerende film). (C) Cilia slagfrekvens kvantificeret fra high-speed DIC cilia motilitet film (n = 41 tilfældige punktmålinger fra 6 mus luftrørene). (D) Flow hastighed og (E) Flow retningsbestemmelse kvantificeret fra sporing fluorescerende vulst bevægelse hen over overfladen af luftrøret epiteler prøver (n = 31 fluorescerende perle optagelserne fra 6 mus luftrørene). Data er forskudt som middelværdi ± SEM. Skalapanelerne 10 um.
Supplerende film 1.. DIC film viser cilier slog form og cilier genereret strøm observeret ved hjælp en vildtype mus luftrør prøve. Filmen blev indsamlet ved 200 fps, mens afspilningen er 30 fps. Klik her for at se filmen .
Supplerende Movie 2. Movie af cilier genereres strøm på tværs af en vildtype mus luftrøret prøve med 0,20 um fluorescerende mikrosfærer og epifluorescerende mikroskopi. Film samling og afspille er 15 fps. Klik her for at se filmen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30088.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x fine forceps | Roboz | RS-4976 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5676 | |
| Micro dissection scissors | Roboz | RS-5620 | |
| Scalpel | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 pipetman | Gilson, Inc | F123602 | |
| P1000 tips | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 mm round glass cover slips | Fisher Scientific | 430588 | |
| Plastic 35 mm culture dishes | Corning | 430588 | |
| Glass bottom 35 mm culture dishes | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
| Silicone sheet 0.012" (0.3 mm) thick | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 09834-10 | |
| Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters | Lecia | DMIRE2 | Brand is not critical. |
| 100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters | Lecia | Brand is not critical. | |
| Microscope stage Incubator | Lecia | 11521749 | Not required if imaging cilia at room temperature |
| High-speed camera bright field | Vision Research | Phantom v4.2 | Brand is not critical. Must be faster than 125 fps |
| High-speed fluorescent camera | Hamamatsu | C9100-12 | Brand is not critical. Must be faster than 10 fps |
| Movie analysis software | National Institutes of Health | ImageJ with MtrackJ plugin |
References
- Stannard, W., O'Callaghan, C. Ciliary function and the role of cilia in clearance. J. Aerosol. Med. 19, 110-115 (2006).
- Francis, R. J., et al. The initiation and maturation of cilia generated flow in the newborn and postnatal mouse airway. American Journal of Physiology: Lung Cellular and Molecular Physiology. 296, 1067-1075 (2009).
- Aune, C. N., et al. Mouse model of heterotaxy with single ventricle spectrum of cardiac anomalies. Pediatric Research. 63, 9-14 (2008).
- Tan, S. Y., et al. Heterotaxy and complex structural heart defects in a mutant mouse model of primary ciliary dyskinesia. J. Clin. Invest. 117, 3742-3752 (2007).
- Zhang, Z., et al. Massively parallel sequencing identifies the gene Megf8 with ENU-induced mutation causing heterotaxy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3219-3224 (2009).
- Caruso, G., Gelardi, M., Passali, G. C., de Santi, M. M. Nasal scraping in diagnosing ciliary dyskinesia. Am. J. Rhinol. 21, 702-705 (2007).
- Leigh, M. W., Zariwala, M. A., Knowles, M. R. Primary ciliary dyskinesia: improving the diagnostic approach. Curr. Opin. Pediatr. 21, 320-325 (2009).
- Delmotte, P., Sanderson, M. J. Ciliary beat frequency is maintained at a maximal rate in the small airways of mouse lung slices. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 35, 110-117 (2006).
- Choe, M. M., Tomei, A. A., Swartz, M. A. Physiological 3D tissue model of the airway wall and mucosa. Nat. Protoc. 1, 357-362 (2006).
- Fulcher, M. L., Gabriel, S., Burns, K. A., Yankaskas, J. R., Randell, S. H. Well-differentiated human airway epithelial cell cultures. Methods Mol. Med. 107, 183-206 (2005).
- You, Y., Richer, E. J., Huang, T., Brody, S. L. Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells: selection of a proliferative population. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 283, 1315-1321 (2002).
- Thomas, B., Rutman, A., O'Callaghan, C. Disrupted ciliated epithelium shows slower ciliary beat frequency and increased dyskinesia. Eur. Respir. J. 34, 401-404 (2009).
- Drummond, I. Studying cilia in zebrafish. Methods Cell Biol. 93 (08), 197-217 (2009).
- Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods Enzymol. 504, 183-200 (2012).
- Sisson, J. H., Stoner, J. A., Ammons, B. A., Wyatt, T. A. All-digital image capture and whole-field analysis of ciliary beat frequency. J. Microsc. 211, 103-111 (2003).
- Schwabe, G. C., et al. Primary ciliary dyskinesia associated with normal axoneme ultrastructure is caused by DNAH11 mutations. Hum. Mutat. 29, 289-298 (2008).
- Shah, A. S., et al. Loss of Bardet-Biedl syndrome proteins alters the morphology and function of motile cilia in airway epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3380-3385 (2008).
- Clary-Meinesz, C. F., Cosson, J., Huitorel, P., Blaive, B. Temperature effect on the ciliary beat frequency of human nasal and tracheal ciliated cells. Biology of the Cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 76, 335-338 (1992).
