Summary
Eine einfache und zuverlässige Technik für die Visualisierung und Quantifizierung Atemwege Zilien Motilität und Zilien erzeugte Strömung mit der Maus Luftröhre beschrieben. Dieses Verfahren kann modifiziert werden, um zu bestimmen, wie eine Vielzahl von Faktoren Zilien Motilität beeinflussen, einschließlich pharmakologischer Wirkstoffe, genetische Faktoren, Umwelteinflüssen und / oder mechanische Faktoren wie Schleim zu laden.
Abstract
Ex-vivo-Imaging-Technik für Maus Atemwegsepithelien für die quantitative Analyse von beweglichen Zilien Funktion wichtig für Einblick in mukoziliäre Clearance-Funktion wurde eingerichtet. Frisch geerntete Maus Luftröhre wird in Längsrichtung durch den trachealis Muskel geschnitten und in einer flachen ummauerten Kammer auf einem Glasboden-Gericht. Die Luftröhre Probe wird entlang seiner Längsachse positioniert, um von der trachealis in Längsrichtung gewellt nehmen. Dies ermöglicht die Abbildung von Flimmerbewegung im Profil entlang der gesamten Länge Luftröhre. Videos mit 200 Bildern / sec werden unter Verwendung von Differential-Interferenz-Kontrast-Mikroskopie und eine Hochgeschwindigkeits-Digitalkamera der quantitativen Analyse der Cilienschlag Frequenz und Wellenform ciliary ermöglichen. Mit dem Zusatz von fluoreszierenden Kügelchen während der Bildgebung, Zilien erzeugten Fluidstroms bestimmt werden kann. Das Protokoll Zeit erstreckt sich über etwa 30 min mit 5 min für Kammer Vorbereitung, 5-10 min für ProbeMontage und 10-15 min für Videomikroskopie.
Introduction
Analyse von beweglichen Zilien Funktion im Atemwegsepithelien ist experimentell wichtig für die Aufklärung der genetischen und umweltbedingten Faktoren, die mukoziliäre Clearance und pulmonale Gesundheit 1 beeinflussen können. Das einfache Protokoll für die Bildgebung der Maus Atemwegsepithelien entwickelt bietet eine effiziente Methode, um Atemwege Zilien Motilität in Mutanten und Knockout Mausmodelle verhören und erfordern nur Grundkenntnisse in Maus Luftröhrengewebe Dissektion und ex-vivo-Bildgebung der Atemwege Zilien Motilität mit hoher Auflösung Videomikroskopie. Dieses Protokoll wurde gegründet und während eines großen Maus Mutagenese Bildschirm verfeinert, um eine schnelle Auswertung der beweglichen Zilien Funktion (Zilien Überlagerungsfrequenz, Cilienschlag Form, Zilien erzeugte Strömung) in Mutanten mit angeborenen Herzfehlern mit Heterotaxie 2-5 ausgesetzt sind.
Aktuelle Techniken zur Atemwege Zilien Motilität studieren kann entweder in der akuten ex vivo-Typ oder lon gruppiert werdenger Begriff in vitro experimentelle Ansätze. Akute Experimente umfassen ex vivo Visualisierung der menschlichen Nase / Atemwege Pinsel Biopsien 6,7 und Analyse einfacher quer Atemwege Abschnitte 8. Die in-vitro-Ansätze nutzen verschiedene Techniken, um Zellkultur Blatt differenzierte Flimmerepithelien wie in Luft Grenzfläche Kulturen oder Atemwege Suspensionskulturen 9-11 erzeugen. Jedoch erfordern diese Atemwegsepithelien reciliation Techniken sehr bedeutende Investition in Zeit und Training, bevor irgendwelche brauchbaren Flimmerepithelzellen zum Experimentieren (4-6 Wochen 9,10) hergestellt werden. Während akute ex vivo Analyse der Atemwegsepithelzellen Pinsel Biopsien häufig für klinische Studien am Menschen verwendet werden, ist diese Methode nicht verwendbar in Mäusestudien aufgrund verschärft mechanische Gewebeschädigung 12.
Die Technik in diesem Protokoll für die Analyse von mous skizziertene tracheal Atemwegsepithelien ist nicht nur einfach auszuführen, aber es erfordert keine speziellen Fähigkeiten Dissektion noch irgendeine spezielle Ausrüstung außer denjenigen Standard für die Bildgebung von Videomikroskopie. Es gibt viele Vorteile dieser einfachen Protokoll. Zunächst wird, wie die Maus Luftröhre Gewebe Ernte ist schnell und einfach durchzuführen, ermöglicht es eine schnelle Beurteilung der Atemwege Cilien-Funktion in einer großen Anzahl von Mäusen. Dazu kann auch scharfsinnige Analyse der kurzfristigen Auswirkungen der verschiedenen in vitro-Behandlungen. Zweitens ist eine Ex-vivo-Technik bleibt die ciliated Atemwegsepithel attached to it zugrunde Stützgewebe und behalten somit verbundenen Zelle Signalwege. Daher im Vergleich zu in vitro reciliated Atemwegsepithelien, ist dieses Präparat eine bessere Darstellung des natürlichen Gewebe in vivo Umgebung. Drittens erlaubt das Protokoll der Erwerb einer Reihe von verschiedenen quantitativen Parameter, die die objektive Beurteilung der beweglichen Zilien f liefern kannSalbung. Schließlich, im Gegensatz zu anderen aktuellen Methoden zur Sicherung der Atemwege Zilien Visualisierung, ermöglicht dieses Protokoll für die Visualisierung der Flimmerhärchen im rechten Winkel zu der Cilienschlag Richtung, so dass Profilansicht der Zilien, die optimal für hochauflösende Bildgebung von Cilienschlag und metachronal Welle Generation .
Dieses Protokoll kann in einer Reihe von Möglichkeiten, um eine breite Palette von experimentellen Anforderungen wie die Rolle von pharmakologischen Mitteln, genetische Faktoren, Umwelteinflüsse und / oder mechanische Faktoren wie Schleim Belastung der Atemwege Cilien-Funktion und Erzeugung / Wartung adressieren geändert werden Atemwege Cilienschlag und metachronal Wellenausbreitung.
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Protocol
1. Reagenzien-Setup
1.1 Dissection und Imaging Medium
Leibovitz L-15-Medium (L15) mit FBS (10%) und Penicillin-Streptomycin (100 Einheiten / ml Penicillin G-Natrium und 100 ug / ml Streptomycin Sulfat) ergänzt wird sowohl während der Ernte und Abbildung Luftröhre Proben verwendet.
2. Shallow Walled Kultur Chamber Assembly
Die Kammer zur Luftröhre Gewebe halten ist in Abbildung 1 dargestellt. Der Boden der Kammer ist der Glasboden 35 mm Kulturschale. Die obere und die Seite der Kammer wird, indem ein kleines Stück 0,3 mm dicken Silikon Folie über die Glasschale generiert. Der Rand der Platte geschnitten wird, um die runde Bodenschale passen und das Zentrum weiter getrimmt, um eine flache zentrale Kammer zu bilden (siehe Schritte 2.1-2.3). Am Anfang dieser Montage wird ein 18 mm runden Deckglas platziert, um eine geschlossene Kammer für Bildgebung erzeugen.
- Komplett decken ein 18 mm runden Deckglas mit einem Quadrat von 0,3 mm dicke Folie Silikon.
- Mit Standard scharfe Sektion Schere überstehendes Silikon Folie aus um den Rand des Deckglases (resultierend in einer kreisförmigen Schicht aus Silikon-Folie).
- Mit einem scharfen Skalpell ausgeschnitten und Entfernen eines zentralen Platz von Silikon-Folie (ca. 10 mm im Quadrat) von der Mitte der überdachten Deckglas (wodurch die Oberseite und die Seiten des bildgebenden Kammer).
3. Luftröhre Ernte und Vorbereitung
- Euthanize Mäusen in Übereinstimmung mit den örtlichen Institutionen Tierpflege und verwenden Ausschuss und / oder staatlichen Richtlinien und entfernen Luftröhre in einem Standard-Kunststoff 35 mm Kulturschale mit genug L15 Medien zu versenken Gewebe (Autoren haben Mäuse kurz vor der Geburt bei Trächtigkeitstag 16.5 verwendet, bis hin zu Neugeborenen, Neugeborenen und erwachsenen Tieren 2).
- Entfernen nicht-Trachea zugehörigen Gewebe an der Außenseite desdie Luftröhre mit stumpfen Dissektion.
- Entfernen Sie den Kehlkopf mit einem Schnitt quer unterhalb des Ringknorpels mit Mikro Schere Dissektion (2A, Zeile 1).
- Entfernen Sie die linke und rechte primäre bronchiale Äste mit einem Schnitt quer oberhalb der Carina mit Mikro Schere Dissektion (2A, Zeile 2).
- Halten Sie das Luftröhre mit feinen Pinzetten und bündig die Lumen 2-3 mal mit ~ 1 ml der Baden L15 Medium mit einem P1000 und P1000 Pipetman Spitze, um Schleim und Blut zu löschen.
- Schneiden Sie einen Ring 3-4 Segment der Luftröhre mit einem Schnitt quer mit Mikrodissektion Schere (2B, Zeile 1).
- Schneiden in Längsrichtung durch die Mitte des trachealis Muskel dieser kurzen Luftröhrensegment mit Mikro Schere Dissektion (2B, Zeile 2).
- Schneiden in Längsrichtung durch die Mitte der Trachealknorpels Ringe mittels Mikrodissektion Schere (2C 2D gezeigt).
4. Cilia Imaging
- Übertragen Luftröhre Gewebe Segmenten Lumen unten, auf der Mitte eines 35 mm Glasboden Kulturschale mit 100-200 ul L-15-Medium.
- Zur Quantifizierung Zilien generierte Strom eine geringe Menge von 0,20 um fluoreszierenden Mikrosphären auf den L-15-Medium baden die Luftröhre Gewebeprobe (~ 1 x 10 11 Partikel / ml oder 20 ul / ml des Fluoresbrite 2,5% wässrige Mikrokugel-Suspension).
- Legen Sie die Imaging-Kammer zuvor (siehe Vorgehensweise 1-3 oben) auf der Oberseite der Luftröhre Probe Silikon-Blatt nach unten vorbereitet, mit der Luftröhre Probe in der Mitte des flachen ummauerten Kammer durch das Fenster in die Silikon-Folie geschnitten gebildeten (Abbildung 1 ).
- Drücken Sie vorsichtig auf dem Deckglas, um im Platz zu sichern und entfernen Sie überschüssiges L-15 Medien aus dem Kanten usinga P1000 und P1000 Pipetman Spitze.
- Montieren Sie das 35 mm Glasboden Kulturschale und Luftröhre Probe auf einem inversen Mikroskop mit 100x-Objektiv und DIC-Optik.
- Mit einem High-Speed-Kamera und Film-Erfassungs-Software sammeln Filme von Zilien Motilität bei 200 + Frames pro Sekunde entlang der Luftröhre ciliated Epithelien der zusammengerollt Rand des trachealis Muskel (Abbildung 2D eingerahmten Feld, E: Beispiel Standbild aus aufgezeichneten Film) (Supplementary Film 1).
- Mit FITC epifluoreszenten Bildgebung und ein wenig Licht CCD-Kamera (siehe Ausstattungsliste oben), sammeln Filme von fluoreszierenden Mikrokügelchen Bewegung über die Oberfläche des ciliated trachealen Epithel später Quantifizierung der Zilien erzeugte Strömung (Ergänzende Movie 2) zu ermöglichen.
5. Quantifizierung von Cilia Motilität
- Legen DIC abgebildeten Filme in der ImageJ Software-Paket und im Anschluss an die Technik, die von I beschriebenain Drummond 13 verwenden Sie die Zeile Werkzeug, um ein Raster-Linie über den Wimpern schlagen zu ziehen. A "reslice" dieser Linie erzeugt eine Art Bild kymograph wo Zilien Bewegung über die Linie erzeugt ein Wellenmuster. Die Anzahl der Pixel zwischen jedem Wellenberg ist sie gemessen (ein Pixel = ein Film-Frame), aus denen die Anzahl der Schläge pro Minute (dh Hz) kann dann berechnet werden.
- Um Zilien erzeugte Strömung Last fluoreszierenden Kügelchen Filme in der ImageJ Software-Paket zu messen, und verwenden Sie das Plugin MTrackJ 14 manuell verfolgen fluoreszierende Kügelchen über die Oberfläche der Luftröhre Epithelien und lassen Sie die Software erzeugen Wulst Geschwindigkeit und Ausrichtung für jede Perle verfolgt.
Es sollte darauf geachtet bei der Verwendung von fluoreszierenden Kügelchen zu fließen wie der Abstand von dem schlagenden Cilien quantifizieren stark beeinflussen können gemessenen Flußbetrags werden. Der Wulst Bewegung in Supplemental Movie 2 ist ein gutes Beispiel dafür. In diesem Beispiel WulstBewegung an der Oberfläche des schlagenden Cilien schnell und deutlich fällt für Perlen weiter weg in den baden-Medien. Um dies zu kontrollieren, sollte Wulst Kurven nur in einem festen Abstand über der Flimmerepithelien in allen Proben gesammelt werden, damit die korrekte Vergleich möglich ist. Schließlich, um repräsentative Daten über Strömung zu erhalten, sollte Perlen für so lange wie möglich verfolgt werden; wir lieber zu Wulst Tracks, 10 + Flimmerzellen decken zur Berechnung Strömung verwenden.
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Representative Results
Steuerung Atemwege Zilien muss deutlich sichtbar sein und gesehen in einer koordinierten Art und Weise (Supplemental Film 1; Filmwiedergabe auf 15% verlangsamt Echtzeit) zu schlagen, mit spürbarer Strömung in Richtung der Zilien schlagen (Supplemental Movie 2; Filmwiedergabe ist 100% real time). Die Quantifizierung der Zilien Filme sollten zu Ergebnissen führen ähnlich wie in Abbildung 3 zu sehen. Sammlung von High-Speed-DIC Filme ermöglicht die Quantifizierung der Cilienschlag Frequenz (3C) und gibt gute Bilder für die qualitative Beurteilung der Cilienschlag Form, während die Verfolgung von fluoreszierenden Kügelchen ermöglicht die Messung der Zilien erzeugte Strömungsgeschwindigkeit (3D) und Richtwirkung (3E).
Wir verwenden Richtwirkung, um einen Index der linearen Strömung geben. Direktionalität wird, indem die gesamte Verschiebung von einem fluoreszierenden Perlen (dh die kürzeste Verhältnis berechnetAbstand zwischen den Start-und Endpunkt des Tracing) durch den Abstand eines fluoreszierenden Kügelchen bewegt sich über die gesamte Kurve. Somit würde eine fluoreszierende Wulst sich in einer geraden Linie über eine Richtwirkung eines während eine fluoreszierende Wulst gewundenen weitgehend von einem geraden Weg eine Richtwirkung viel kleiner als 1 haben.
Wir haben Proben für bebildert bis zu einer Stunde ohne jede spürbare Veränderung in Cilienschlag Funktion.
Abbildung 1. Vergrößerte isometrische Ansicht Kulturschale Setup und Luftröhre Probe Positionierung. NB: das Deckglas und Silikon-Blatt sollte vor der Inbetriebnahme der Luftröhre Probe in der Kulturschale montiert werden.
2. Beispiel einer Maus Luftröhre Präparation dieses Protokoll verwenden, ausgehend von einer intakten Luftröhre (A) auf die endgültige abgebildete Ergebnis (E) (siehe Verfahrensschritte 3,2-3,8 zur Erläuterung der Etiketten). Maßstab Bars in AD darstellen 500 um. Maßstab in E für 25 um.
Abbildung 3. Erwartete Ergebnisse unter Verwendung eines Wildtyp-Maus Luftröhre Probe durch das Protokoll vorbereitet hier beschrieben. (A) Einzelbild aus einem High-Speed-Film DIC (Siehe ergänzende Film 1 für repräsentative DIC-Film). (B) Bewegung Spuren vier fluoreszierende Kügelchen über den surface eines trachealen Epithel Probe (Siehe ergänzende Film 2 für repräsentative fluoreszierenden Film). (C) Cilia Taktfrequenz von High-Speed-DIC Zilien Motilität Filme (n = 41 zufälligen Punkt Messungen von 6 Maus Tracheen) quantifiziert. (D) Strömungsgeschwindigkeit und (E) Durchfluss Direktionalität von Tracking fluoreszierende Wulst Bewegung über die Oberfläche des trachealen Epithel Proben (n = 31 fluoreszierende Wulst Kurven von 6 Maus Luftröhre) quantifiziert. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM verschoben. Maßstab Bars 10 um.
Supplemental Film 1. DIC Film zeigt Cilienschlag Form und Zilien erzeugte Strömung beobachtet mit einer Wildtyp-Maus Luftröhre Probe. Der Film wurde bei 200 fps gesammelt, während die Wiedergabe 30 fps. Klicken Sie hier, um Film anzusehen .
Supplemental Movie 2. Movie of Zilien generated Strömung über einer Wildtyp-Maus Luftröhre Probe mit 0,20 um fluoreszierende Mikrokügelchen und Epifluoreszenzmikroskopie. Film-Sammlung und Wiedergabe ist 15 fps. Klicken Sie hier, um Film anzusehen .
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Discussion
Messung der Zilien Überlagerungsfrequenz (CBF) ist relativ einfach mit hoher Leistung Mikroskop-Objektive und schnelle Bildaufnahme Hardware 13,15, und erklärt, warum CBF-Messungen die Grundlage der meisten Studien untersuchen mukoziliäre Clearance bei Gesundheit und Krankheit bilden. Doch während CBF-Messung ist für das Verständnis mukoziliäre Clearance, Messung der CBF allein wesentlichen ignoriert die zugrunde liegende Bedeutung sowohl ciliary erzeugt Strom und Cilienschlag Wellenform, die beide mehr schwer zu messen, werden oft ignoriert werden, und kann nicht mit CBF korrelieren. Ein Beispiel, wie erhöhte CBF kann nicht mit einem erhöhten ciliary erzeugten Strom entspricht, wird bei einigen Patienten mit Mutationen DNAH11 gesehen. DNAH11 ist ein axonemal dynein schweren Kette Protein, Mutationen, in denen berichtet wurde, dass sowohl hyperkinetischen (schneller) Zilienschlag und abnorme Cilienschlag Wellenform, die voraussichtlich Probleme mit mukoziliäre Clearance 16 verursachen verursachen. Die significant Vorteil unseres Protokolls ist, dass es für eine einfache Visualisierung der Flimmerhärchen im rechten Winkel zu der Cilienschlag Richtung ermöglicht, so dass eine Profilansicht von Zilien, die optimal für hochauflösende Bildgebung von Cilienschlag Form und Zilien ist erzeugten Strömung über die Oberfläche des das pulsierende Zilien, wodurch direkter Vergleich der CBF mit Cilienschlag Wellenform und / oder Zilien erzeugte Strömung innerhalb einer einzigen Probe.
Ein weiterer Vorteil dieser Technik ist, dass Zilien in frisch geernteten Luftröhre behalten ihre Fähigkeit, in einer koordinierten Art und Weise über die gesamte Oberfläche des respiratorischen Epithel zu schlagen, wodurch eine einfache Korrelation zwischen CBF und Zilien erzeugte Strömung. Solche koordinierten Flimmerbewegung nicht in reciliating Maus Trachealepithel Kulturen, die oft schlecht gewimpert und zeigen Cilienschlag in zufällige Richtungen 9,10 beobachtet. Die koordinierte Zilienschlag beobachtet mit der Luftröhre Epithelien hier beschriebene Technik kann die Mittel, um i bietennterrogate die Regulationsmechanismen Zilienschlag Koordination und seine potenzielle Rolle in mukoziliäre Clearance.
Der schwierigste Teil dieses Protokoll für Forschungen wird Luftröhre Vorbereitung, einschließlich Clearing von Fett und Bindegewebe aus der Luftröhre Oberfläche (Abbildung 2a), und in Längsrichtung schneiden durch die Mitte des trachealis Muskel (Abbildung 2b, Zeile 2). Wir finden mit guten Mikrodissektion Schere wesentlich für sowohl Gewebe Clearing und anschließende trachealisotomy. Außerdem finden wir es einfacher, den unteren Teil der Luftröhre knapp vor der Carina, wo die Luftröhre gabelt sich in der linken und rechten primären Bronchien verwenden als die trachealis Muskel hier am breitesten ist. Doch mit genügend Erfahrung, kann eine beliebige Länge der Luftröhre oder in der Tat die primäre Bronchien erfolgreich eingesetzt werden, um qualitativ hochwertige Filme von Zilien Motilität und Zilien erzeugen Strom erzeugen.
Mögliche technischeProbleme mit diesem Protokoll verbunden sind, umfassen die Luftröhre Probe bewegt während der Bildgebung und / oder die Probe nicht in der Lage, in den Mittelpunkt gerückt werden. Beide Probleme können auftreten, wenn zu viel L-15 mit der Probe zugegeben wurde und / oder die Abbildungskammer Deckglas wurde nicht nach unten gedrückt sicher, das bewirkt, dass die Probe innerhalb des Deckglases Kammer wodurch Bewegung der Probe oder der Probe schwimmenden Schwimmer oberhalb der Fokusebene Kerzenschaukel unmöglich. Um dies zu vermeiden, ist es wichtig zu versuchen, verringert sich die Menge der Flüssigkeit verwendet, um jede Luftröhre Probenhalterung.
Eine mögliche Einschränkung dieser Technik ist, dass die Messung der Zilien erzeugte Strömung kann nicht vollständig in vivo mukoziliäre Transport entsprechen. Unsere Feststellung der Zilien generierte Strom von ~ 10 um / sec ist deutlich weniger als die 100 um / sec mukoziliäre Transport berichtet, mit in-vivo-Maus Luftröhre 17. Dieser Unterschied ist wahrscheinlich auf die Flimmerhärchen in Medien als opp untergetauchtosed einfach bewegen eine dünne Schicht von Schleim in der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche. Dennoch hat diese Methode großen Nutzen für relativen Vergleich Zilienmotilitätsstörungen zwischen verschiedenen Proben.
Es sollte angemerkt werden, dass während der experimentellen Technik und hier präsentierten Daten bei Raumtemperatur durchgeführt wurde, die Temperatur selbst eine wichtige Rolle bei der Regulierung Zilienschlag spielt werden. CBF im menschlichen Nase und Luftröhre Proben gesehen linear mit der Temperatur werden zwischen 5-20 ° C korreliert, mit einem leichten Anstieg in CBF zwischen 20-45 ° C 18 zu sehen. Wir sehen eine ähnliche Beziehung zwischen Temperatur und CBF in Maus Atemwege Proben (unveröffentlichte Beobachtungen). So, während wir aufnehmen Zilien Aktivität bei Raumtemperatur für die schnelle Abschätzung möglicher Defekte in Zilien Motilität in neuartigen mutierten Mäusen, haben wir auch einige Proben inkubieren bei 37 ° C für die Bestimmung Zilien Aktivität unter physiologischen Bedingungen. Um diese ein Standard-Mikroskop Inkubation ch erreichenBernstein kann verwendet werden, um Proben, die bei 37 ° C zu halten
Einfache Änderungen an diesem Protokoll wird es ein mächtiges Werkzeug für die Beurteilung der Regulierung der Atemwege Zilien Aktivität durch eine Vielzahl von Faktoren, wie die Rolle von pharmakologischen Mitteln, Temperatur, genetische Faktoren, Umwelteinflüsse und / oder mechanische Faktoren wie Schleim Last auf Atemwege Cilien-Funktion und Erzeugung / Wartung Atemwege Cilienschlag.
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Disclosures
Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Das Projekt wurde vom NIH U01HL098180 vom National Heart, Lung, and Blood Institute unterstützt. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt den offiziellen Standpunkt des National Heart, Lung, and Blood Institute oder die National Institutes of Health
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30088.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x fine forceps | Roboz | RS-4976 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5676 | |
| Micro dissection scissors | Roboz | RS-5620 | |
| Scalpel | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 pipetman | Gilson, Inc | F123602 | |
| P1000 tips | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 mm round glass cover slips | Fisher Scientific | 430588 | |
| Plastic 35 mm culture dishes | Corning | 430588 | |
| Glass bottom 35 mm culture dishes | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
| Silicone sheet 0.012" (0.3 mm) thick | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 09834-10 | |
| Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters | Lecia | DMIRE2 | Brand is not critical. |
| 100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters | Lecia | Brand is not critical. | |
| Microscope stage Incubator | Lecia | 11521749 | Not required if imaging cilia at room temperature |
| High-speed camera bright field | Vision Research | Phantom v4.2 | Brand is not critical. Must be faster than 125 fps |
| High-speed fluorescent camera | Hamamatsu | C9100-12 | Brand is not critical. Must be faster than 10 fps |
| Movie analysis software | National Institutes of Health | ImageJ with MtrackJ plugin |
References
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