Summary
気道繊毛運動と繊毛生成されたフローをマウス気管を使用して可視化し、定量化するための簡単で信頼性の高い技術が記載されている。この技術は様々な要因が薬理学的薬剤、遺伝的要因、環境曝露、及び/又は粘液負荷などの機械的要因を含む、繊毛運動性にどのように影響するかを決定するために変更することができる。
Abstract
粘膜毛様体クリアランス機能にとって重要な洞察繊毛運動機能を定量的に分析するための撮像マウス気道上皮ためのex vivoでの技術が確立されている。収穫されたばかりのマウス気管気管の筋肉を長手方向にカットしたガラス底皿に浅い薄肉チャンバー内に装着されている。気管サンプルは長手方向にカールする気管筋を活用するために、その長軸に沿って配置されている。これは全体の気管の長さに沿ってプロファイルビューで繊毛運動のイメージングを可能にします。 200フレーム/秒のビデオは繊毛ビート周波数と波形毛様体の定量分析を可能にするために微分干渉顕微鏡と高速デジタルカメラを用いて得られる。撮影時の蛍光ビーズを添加しても、流体の流れを生成繊毛を決定することができる。プロトコル時間は室の準備のために5分で約30分、サンプルの5〜10分間に及ぶ取り付け、およびビデオ顕微鏡のための10-15分。
Introduction
気道上皮における運動性繊毛機能の分析は、粘液線毛クリアランスと肺の健康1に影響を与えることができる遺伝的要因と環境要因を解明するための実験が重要である。イメージングのために開発されたシンプルなプロトコルマウス気道上皮は、変異とノックアウトマウスモデルで気道繊毛運動を尋問するために効率的な方法を提供し、マウス気管組織切開と高解像度ビデオ顕微鏡による気道繊毛運動のex vivoでのイメージングだけで基本的なスキルを必要とする。このプロトコルはheterotaxy 2-5関連付けられた先天性心疾患を持つ変異体では運動性繊毛機能の迅速な評価（繊毛ビート周波数、繊毛ビート形状、繊毛生成されたフロー）を可能にするために大規模マウス突然変異誘発画面中に確立され、洗練された。
気道繊毛運動性を研究するために使用される現在の技術は、急性エクスビボ型またはイオンのいずれかに分類することができ試験管内実験的アプローチでゲル用語。急性実験は人間の鼻/気道ブラシ生検6,7とシンプルな横気道セクション8の分析のex vivoでの可視化が含まれています。 インビトロのアプローチは、空気液界面培養物または気道の懸濁培養物9-11と同様に分化繊毛上皮のシートを生成するために、様々な細胞培養技術を利用する。任意の使用可能な繊毛上皮細胞が実験（4-6週9,10）のために制作される前に、しかし、これらの気道上皮reciliation技術は時間と訓練に非常に多額の投資を必要とする。気道上皮ブラシ生検の急性ex vivoでの分析は、一般的にヒト臨床試験に使用されているが、この方法は、機械的な悪化組織傷害12によるマウスの研究において使用できない。
覚書の分析のために、このプロトコルで概説技術電子気管気道上皮は、実行するだけで簡単ではありませんが、それは特別な解剖のスキルも、ビデオ顕微鏡による撮影のためにそれらの標準以外の任意の特殊な機器を必要としません。この単純なプロトコルには多くの利点がある。マウス気管組織の収穫は、実行するために迅速かつ簡単であるように、まず、それはマウスの大規模な数の気道繊毛機能の迅速な評価が可能になります。これは、in vitroでの治療で別の短期的な影響の急性分析を含めることができます。第二に、ex vivoでの技術であること、繊毛気道上皮は、それがサポートしている組織を根底に接続されたまま、したがって、関連する細胞シグナル伝達経路を保持します。従って、 インビトロ reciliated気道上皮内と比較して、この製剤は、 生体組織環境における自然のより良い表現である。第三に、このプロトコルは繊毛運動fの客観的な評価を与えることができる種々の定量的なパラメータの数の取得を可能にする慰め。最終的に、気道繊毛の可視化のための他の現行の方法とは対照的に、このプロトコルは、繊毛ビートと異時波発生の高分解能イメージングのための最適な繊毛のプロファイルビューを可能にする、繊毛ビート方向に対して直角繊毛の可視化を可能にする。
このプロトコルは、例えば、薬剤、遺伝的要因、環境曝露、および/または気道繊毛機能と生成/維持にかかる粘液負荷等の機械的要因の役割などの実験、幅広いニーズに対処するための多くの方法で変更することができる気道繊毛ビートと異時波動伝播。
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Protocol
1。試薬のセットアップ
1.1解剖とイメージング媒体
リーボビッツのL-15培地（L15）は、FBS（10％）およびペニシリン - ストレプトマイシン（100単位/ mlのペニシリンGナトリウムと硫酸ストレプトマイシン100μgの/ ml）を補足される気管試料の収穫と撮像時の両方で使用されている。
2。浅い城壁文化チャンバアセンブリ
気管組織を保持するために使用される室は、 図1に示されている。室の床は35ミリ培養皿の底ガラスである。チャンバーの上面と側面をガラス皿の上に厚さ0.3mmのシリコーンシートの小片を配置することによって生成される。シートの縁部を丸底ディッシュに合わせてカットされ、中心がさらに（ステップ2.1〜2.3を参照）浅い中央チャンバを形成するようにトリミングされる。このアセンブリの上に18mmの円形のガラスカバースリップを撮像するのに適した密閉チャンバを生成するように配置されている。
- 完全に0.3ミリメートルの厚さのシリコーンシートの二乗は18ミリメートルラウンドガラスカバースリップをカバーしています。
- 標準鋭い解剖ハサミでカバースリップ（シリコーンシートの円形の層になる）のエッジの周りから余分なシリコーンシートを切り落とす。
- 鋭いメスを切り出し、覆われたカバースリップ（したがってイメージングチャンバーの上部と側面を形成する）の中間からシリコーンシート（約10mm角）の中央広場を取り除くと。
3。気管ハーベストと準備
- ローカル機関動物のケアと使用委員会および/または政府のガイドラインに従ってマウスを安楽死させるとまで十分L15メディア水没組織（著者は妊娠の日16.5でちょうど出産前にマウスを使用している、へと標準的なプラスチック35ミリ培養皿に気管を削除、生まれたばかりの新生児、および成体動物2）。
- の外側に取り付け、非気管関連組織を除去鈍的切開を用いた気管。
- ただミクロ解剖ハサミ（ 図2A、1行目）を使用して、輪状軟骨下横カットで喉頭を削除します。
- ミクロ解剖はさみ（ 図2A、2行目）を使用して、ただカリーナ上記横カットで左右の主気管支の分岐を削除します。
- 優しく細かい鉗子で気管を保持し、任意の粘液や血液をクリアするためにP1000とP1000ピペットマンチップ付き入浴L15培地〜1mlでルーメン2〜3回洗い流す。
- ミクロ解剖はさみ（ 図2B、1行目）と横方向のカットを使用した気管の3-4リングセグメントを切り取る。
- ミクロ解剖はさみ（ 図2B、2行目）を使用して、この短い気管セグメントの気管筋の中央を縦にカットします。
- ミクロ解剖はさみ（ 図2Cを使用して気管軟骨輪の中央を縦にカット図2（d）に示すように）残しNG>、線）。
4。繊毛イメージング
- 転送気管組織セグメント、L-15培地100-200μLで35ミリのガラス底培養皿の真ん中の上にダウンルーメン側、。
- 繊毛生成されたフローを定量化するには、気管の組織試料（〜1×10 11個/ ml以下Fluoresbrite 2.5％水溶液の微小球懸濁液を20μL/ ml）を入浴L-15培地に蛍光0.20μmの微小球の少量を追加します。
- シリコーンシートにカットウィンドウによって形成された壁に囲まれた浅い室の真ん中に位置気管サンプルと、イメージングチャンバーダウン気管サンプルシリコーンシート側の上部に（上記1〜3の手順を参照してください）先に調製を置きます（ 図1 ）。
- ゆっくりと所定の位置に固定するためにカバースリップを押し下げとエッジのボイジャーから余分なL-15メディアを取り出すGA P1000チップとピペットマンP1000。
- 100X客観的かつDIC光学系と倒立顕微鏡で35ミリのガラス底培養皿と気管サンプルをマウントします。
- 気管筋の丸まっエッジ（：記録された映画の例では、静止画図2Dアウトラインボックス、E）の繊毛気管上皮に沿って毎秒+フレームは200で繊毛運動の映画を集め高速度カメラやムービー取得ソフトウェアを使用（ 補足ムービー1）。
- FITC落射蛍光イメージングと低照度CCDカメラ（上記の機器リストを参照）を使用して、繊毛生成フロー（ 補足作品2）の後の定量化を可能にするために気管繊毛上皮の表面を横切って蛍光ミクロス運動の映画を収集します。
5。繊毛の運動の定量
- ImageJのソフトウェアパッケージにDIC画像化された映画をロードし、Iで説明する手法を以下AINドラモンド13鼓動繊毛を横断ラスタラインを描画するラインツールを使用します。このラインの "再スライスは"行に亘る繊毛運動が波形パターンを生成カイモグラフ型画像を生成する。分あたりのビート（ すなわちヘルツ）の数は、次に計算することができ、そこから、各波のピークの間のピクセル数、彼らが測定されます（1ピクセル= 1つのムービーフレーム）。
- ImageJのソフトウェアパッケージに繊毛、生成されたフロー負荷蛍光ビーズ映画を測定し、手動で気管上皮の表面を横切って蛍光ビーズを追跡し、ソフトウェアを追跡各ビーズのためのビーズの速度と方向性を生成させるMTrackJプラグ14を使用します。
破っ繊毛からの距離として流れを定量化するために強く測定流量振幅に影響を与えることができる蛍光ビーズを使用している場合は注意が必要です。補足ムービー2でビーズの動きはこの良い例です。この例では、ビーズ動きが鼓動繊毛の表面に高速で、かなり遠く入浴メディアでビーズのためにオフに低下します。これを制御するには、ビーズトレーシングは、唯一の正しい比較を行うことができるように、すべてのサンプルで繊毛上皮上の固定された距離で収集されるべきである。最終的に、流体の流れに代表的なデータを得るために、ビーズをできるだけ長く追跡されるべきであり、我々は、流体の流れを算出するビード10を覆うトラック+繊毛細胞を使用することを好む。
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Representative Results
コントロール気道繊毛がはっきり見えるようにして調整された方法（ 補足ムービー1、ムービーの再生が15％をリアルタイムに減速されています）でビートに見えるはず繊毛ビート（ 補足作品2の方向に顕著な流れに、、ムービーの再生は100％ですリアルタイム）。繊毛映画の定量は、 図3に見られるものと同様の結果が得られるはず。蛍光ビーズの追跡は繊毛生成流速の測定（ 図3D）を可能にしつつ、高速DIC映画のコレクションは、可能な繊毛のビート周波数（ 図3C）の定量化を行い、繊毛ビート形状の定性的な評価のために良好な画像を提供しますと方向（ 図3E）。
私たちは、直線流のインデックスを与える方向性を使用しています。方向性は、蛍光ビーズ（ つまり最短で旅合計変位を割ることによって計算されます距離によってトレースの開始点と終了点）トレース全体にわたって蛍光ビーズが移動の間の距離。ストレートパスから広く蛇行蛍光ビーズが1よりはるかに少ない方向性を持つことになりつつ、直線で蛍光ビーズの移動は、一の方向性を持っているでしょう。
我々は、最大時間まで繊毛ビート機能で任意の顕著な変化を外とのために画像化されたサンプルを持っている。
図1培養皿のセットアップおよび気管サンプルポジショニングの拡大等角図。 NB：カバーガラスとシリコーンシートを培養皿に気管サンプルを置く前に実装してください。
図2（手順を参照してくださいラベルの説明については、3.2から3.8までのステップを）最終的な画像化された結果（E）にそのまま気管（A）から開始し、このプロトコルを使用してマウスの気管切開の例。 ADにおけるスケールバーは500μmのを表しています。 E中のスケールバーは25μmのを表しています。
図3。予想結果はプロトコルによって調製され、野生型マウス気管サンプルを使用して得られた、ここで説明する。高速DIC映画（代表DIC映画の補足映画の1を参照）から（A）シングルフレーム。（B）移動トラックのsurfa渡って4蛍光ビーズ気管上皮サンプルのCE（代表蛍光映画の補足ムービー2を参照）。高速DIC繊毛運動の映画（6マウスの気管からN = 41のランダムポイント測定）から定量化（C）繊毛のビート周波数。（D）流速気管上皮サンプル（6マウスの気管からはn = 31蛍光ビーズトレーシング）の表面を横切って蛍光ビーズの動きを追跡するから定量化し、（E）フローの方向。データは平均±SEMとして変位する。スケールバーは10μmである。
補足ムービー1。繊毛ビート形状と繊毛生成されたフローを示すDIC映画は野生型マウスの気管のサンプルを用いて観察した。再生が30 fpsのある間に映画は、200 fpsで収集した。 ムービーを表示するには、ここをクリック 。
繊毛GEの補足作品2作品0.20程度の蛍光ミクロスフェアと落射蛍光顕微鏡を用いて、野生型マウス気管サンプル横断nerated流れ。ムービーコレクションとプレイバック15 fpsのです。 ムービーを表示するには、ここをクリック 。
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Discussion
繊毛のビート周波数（CBF）の測定は、高電力顕微鏡対物レンズと高速画像集録ハードウェア13,15を使用して比較的容易であり、かつCBF測定は健康と病気の間に粘液線毛クリアランスを調査するほとんどの研究の基礎を形成する理由を説明します。しかし、測定するのがより困難であり、どちらも毛様体、生成されたフローと繊毛ビート波形の両方の基礎と重要性を、無視CBF測定だけでは、粘液線毛クリアランスを理解するためのCBFの測定が不可欠であるが、しばしば無視され、CBFと相関しないことがあります。 CBFが増加繊毛生成流れに対応していない可能性が増加した方法の例は、DNAH11変異を有する患者の一部に見られる。 DNAH11は軸糸ダイニン重鎖タンパク質、粘膜毛様体クリアランス16との問題を引き起こすことが予想される多動（速い）繊毛ビート異常繊毛ビート波形の両方を引き起こすことが報告されているの変異である。 significa我々のプロトコルのNTの利点は、それが表面全体に繊毛ビート形状と繊毛生成流体の流れの高分解能イメージングに最適である繊毛のプロファイルビューを可能にし、繊毛ビート方向に対して直角に繊毛を簡単に可視化できることですこうして繊毛ビート波形および/または繊毛とCBFの直接比較を可能破っ繊毛は、単一のサンプル内のフローを生成しました。
この技術のもう一つの利点は、その新鮮な収穫気管繊毛こうしてCBFと繊毛、生成されたフローの間で簡単に相関関係を可能にする、気道上皮の表面全体に渡って協調してビートする能力を保持しています。このような協調繊毛運動はしばしば不十分繊毛虫とランダムな方向9,10における繊毛ビートを示しreciliatingマウス気管上皮の文化で観察されていません。ここで説明気管上皮技術を用いて観察された協調繊毛のビートiのための手段を提供することができる繊毛ビート調整と粘液線毛クリアランスにおけるその潜在的な役割を調整するメカニズムをnterrogate。
研究のために、このプロトコルの最も難しい部分は、気管の表面（図2a）から、脂肪と結合組織の清算を含めて、気管の準備とし、縦方向に気管筋（図2b、2行目）の中央を切断します。私たちは、組織のクリアとその後trachealisotomy双方にとって不可欠良いミクロ解剖ハサミを使用して見つける。さらに、我々はそれが簡単にここで気管筋肉が幅広くあるので気管は、左右の主気管支に分岐する分岐部にだけ前方気管の下部を使用することを見つける。しかし、十分な経験と、気管の任意の長さ、または実際に一次気管支は繊毛運動性および流を発生さ繊毛の高画質な動画を生成するために首尾よく使用することができる。
技術的な可能性このプロトコルに伴う問題は、撮像および/または試料にフォーカスさせることができない時に移動気管サンプルを含む。これらの問題の両方が多すぎるL-15をサンプルに添加および/または撮像室カバースリップを確実に押下されていないされた場合に起こることができ、これは、試料が試料移動又は浮いて試料を得たカバースリップチャンバ内にフロートさせる上記の焦点面は、フォーカスが不可能。これを避けるために、各気管試料をマウントするために使用される液体の量を最小にしようとすることが重要である。
この技術の可能性の制限は、流体の流れを生成した繊毛の測定は完全に生体内粘液線毛輸送に一致しない場合がある。 〜10ミクロン/秒の繊毛生成流れ私たちの発見は、in vivoでのマウス気管17 に使用して報告さ100μm/秒の粘液線毛輸送よりも大幅に少なくなります。この違いはおそらく、OPPなどのメディアの中に沈めている繊毛によるものです単に気液界面を横切る粘液の薄層を移動するosed。それにもかかわらず、この方法は、異なるサンプル間の繊毛運動の相対的な比較のために偉大なユーティリティを持っています。
なお、実験技術、ここで提示したデータは室温で実施したが、温度自体は繊毛活性の調節に重要な役割を果たしていることに留意すべきである。人間の鼻および気管試料中のCBFが直線20-45°C 18との間に見られるCBFのわずかな増加に伴って、5〜20°Cの間の温度と相関されているのが見える。我々は、マウスの気道サンプル（未発表の観察）の温度とCBFの間同様の関係を参照してください。小説変異マウスにおける繊毛の運動性の可能性の欠陥の迅速な評価のために室温で我々レコード繊毛活動しつつ、我々はまた、生理的条件下で繊毛の活動を決定するために37℃でいくつかのサンプルをインキュベートする。この標準的な顕微鏡インキュベーションチャンネルを達成する琥珀は37でサンプルを維持するために使用することができる℃で
このプロトコルへの簡単な修正は、それ広いような薬剤の役割などの要因の範囲、温度、遺伝的要因、環境曝露、および/またはそのような粘液負荷などの機械的要因によって気道繊毛活性の調節を評価するための強力なツールになります気道繊毛機能と世代/気道繊毛ビートのメンテナンスに。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
プロジェクトは、国立心臓、肺、血液研究所NIH助成U01HL098180によってサポートされていました。内容はもっぱら著者の責任であり、必ずしも国立心臓、肺、血液研究所や国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30088.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x fine forceps | Roboz | RS-4976 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5676 | |
| Micro dissection scissors | Roboz | RS-5620 | |
| Scalpel | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 pipetman | Gilson, Inc | F123602 | |
| P1000 tips | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 mm round glass cover slips | Fisher Scientific | 430588 | |
| Plastic 35 mm culture dishes | Corning | 430588 | |
| Glass bottom 35 mm culture dishes | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
| Silicone sheet 0.012" (0.3 mm) thick | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 09834-10 | |
| Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters | Lecia | DMIRE2 | Brand is not critical. |
| 100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters | Lecia | Brand is not critical. | |
| Microscope stage Incubator | Lecia | 11521749 | Not required if imaging cilia at room temperature |
| High-speed camera bright field | Vision Research | Phantom v4.2 | Brand is not critical. Must be faster than 125 fps |
| High-speed fluorescent camera | Hamamatsu | C9100-12 | Brand is not critical. Must be faster than 10 fps |
| Movie analysis software | National Institutes of Health | ImageJ with MtrackJ plugin |
References
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