Summary
Se describe una técnica sencilla y fiable para la visualización y cuantificación de las vías respiratorias motilidad de los cilios y los cilios flujo generado a través del ratón tráquea. Esta técnica puede ser modificada para determinar cómo una amplia gama de factores que influyen en la motilidad de los cilios, incluyendo agentes farmacológicos, factores genéticos, exposición ambiental, y / o factores mecánicos, tales como la carga de moco.
Abstract
Se ha establecido una técnica ex vivo para la imagen del ratón vías respiratorias epitelios para el análisis cuantitativo de la función de los cilios inmóviles importante para conocer a fondo la función mucociliar. Recién cosechada ratón tráquea se corta longitudinalmente a través del músculo traqueal y se monta en una cámara de paredes poco profundas en un plato con fondo de cristal. La muestra tráquea se coloca a lo largo de su eje largo para tomar ventaja del músculo traqueal a rizarse longitudinalmente. Esto permite formación de imágenes de movimiento ciliar en la vista de perfil a lo largo de toda la longitud traqueal. Videos en 200 cuadros / seg se obtienen utilizando microscopía de contraste diferencial de interferencia y una cámara digital de alta velocidad para permitir el análisis cuantitativo de la frecuencia de batido ciliar y la forma de onda ciliar. Con la adición de perlas fluorescentes durante la formación de imágenes, los cilios de flujo de fluido generada también se puede determinar. El tiempo de protocolo se extiende por aproximadamente 30 min, con 5 min para la preparación cámara, 5-10 min para la muestramontaje y 10-15 minutos para videomicroscopy.
Introduction
Análisis de la función de cilios móviles en la vía aérea epitelios experimentalmente es importante para dilucidar los factores genéticos y ambientales que pueden afectar a la salud y el aclaramiento mucociliar pulmonar 1. El simple protocolo desarrollado para la formación de imágenes con el ratón vías respiratorias epitelios proporciona un método eficiente para interrogar a las vías respiratorias en la motilidad de los cilios modelos mutantes y ratón knockout y requiere solamente habilidades básicas del ratón en la disección del tejido traqueal y la formación de imágenes ex vivo de las vías respiratorias con la motilidad de los cilios videomicroscopy alta resolución. Este protocolo fue creado y perfeccionado durante una pantalla de mutagénesis ratón a gran escala para permitir una rápida evaluación de la función de los cilios móviles (frecuencia de batido ciliar, la forma de batido ciliar, el flujo generado cilios) en los mutantes con cardiopatía congénita asociada a heterotaxy 2-5.
Las técnicas actuales utilizadas para estudiar las vías respiratorias cilios motilidad se pueden agrupar en ya sea el tipo ex vivo aguda o lonplazo ger en los enfoques experimentales in vitro. Experimentos agudos incluyen la visualización ex vivo de nasales / vías respiratorias humanas biopsias cepillo 6,7 y el análisis de las secciones transversales de las vías respiratorias simples 8. Los enfoques in vitro utilizan varias técnicas de cultivo celular para generar hojas de epitelio ciliado diferenciadas tales como en cultivos líquidos de interfaz de aire o cultivos en suspensión las vías respiratorias 9-11. Sin embargo, estas técnicas reciliation epitelios de las vías respiratorias requieren una inversión muy significativa en el tiempo y la formación antes de que las células epiteliales ciliadas utilizables se producen para la experimentación (4-6 semanas 9,10). Mientras que el análisis ex vivo aguda de las vías respiratorias epiteliales biopsias cepillo se utilizan comúnmente para los estudios clínicos humanos, este método no se puede utilizar en los estudios del ratón exacerbado debido a la lesión tisular mecánico 12.
La técnica descrita en este protocolo para el análisis de los memorandos de entendimientoe las vías respiratorias epitelio traqueal no sólo es sencillo de ejecutar, pero no requiere de habilidades especiales de disección ni cualquier equipo especializado además de los estándar para la formación de imágenes por videomicroscopía. Hay muchas ventajas de este protocolo simple. En primer lugar, como el ratón la cosecha de tejidos tráquea es rápida y fácil de realizar, que permite una evaluación rápida de la función de los cilios las vías respiratorias en un gran número de ratones. Esto puede incluir el análisis aguda de los efectos a corto plazo de diferentes tratamientos en in vitro. En segundo lugar, siendo una técnica ex vivo, el epitelio de las vías respiratorias ciliado permanece unido a él que subyace tejidos de soporte y por lo tanto retener vías de señalización celular asociadas. Por lo tanto, en comparación con las vías respiratorias in vitro reciliated epitelios, esta preparación es una mejor representación de la natural en el entorno de tejido vivo. En tercer lugar, este protocolo permite la adquisición de un número de diferentes parámetros cuantitativos que pueden proporcionar la evaluación objetiva de los cilios móviles función. Por último, en contraste con otros métodos actuales para las vías respiratorias cilios visualización, este protocolo permite la visualización de los cilios en ángulos rectos a la dirección de batido ciliar, permitiendo vista de perfil de los cilios que es óptima para obtener imágenes de alta resolución de batido ciliar y la generación de ondas metachronal .
Este protocolo puede ser modificado en un número de maneras de abordar una amplia gama de necesidades experimentales tales como el papel de los agentes farmacológicos, factores genéticos, exposición ambiental, y / o factores mecánicos, tales como la carga de moco en las vías respiratorias y la función de los cilios generación / mantenimiento de los vías respiratorias batido ciliar y la propagación de ondas metachronal.
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Protocol
1. Reactivos de configuración
1.1 disección y la imagen Mediano
Medio L-15 de Leibovitz (L15) se complementa con FBS (10%) y penicilina-estreptomicina (100 unidades / ml de penicilina G sódica y 100 mg / ml de sulfato de estreptomicina) se utiliza tanto durante la cosecha y la formación de imágenes de muestras de tráquea.
2. Asamblea Cámara Cultura Walled Shallow
La cámara se utiliza para mantener el tejido tráquea se muestra en la Figura 1. El suelo de la cámara es el cristal tocó fondo 35 mm de placa de cultivo. La parte superior y lateral de la cámara se genera mediante la colocación de una pequeña pieza de 0,3 mm de espesor láminas de silicona en el plato de cristal. El borde de la lámina se corta para encajar el plato de fondo redondo y el centro se recorta adicionalmente para formar una cámara central superficial (consulte los pasos 2.1 a 2.3). En la parte superior de este conjunto, un mm ronda cubreobjetos de vidrio 18 se coloca para generar un recinto adecuado para la imagen.
- Cubra completamente a mm ronda cubreobjetos 18 vidrio con un cuadrado de 0,3 mm de espesor láminas de silicona.
- Con tijeras de disección afilados estándar recorte el exceso de láminas de silicona alrededor del borde de la hoja de la cubierta (que resulta en una capa circular de láminas de silicona).
- Con un escalpelo afilado, recortar y eliminar una plaza central de láminas de silicona (aproximadamente 10 mm cuadrados) desde el centro de la hoja de la cubierta cubierta (formando así la parte superior y los lados de la cámara de imágenes).
3. Tráquea Cosecha y preparación
- La eutanasia a los ratones de conformidad con cuidado animal institucional local y utilizar comité y / o directrices gubernamentales y quitar la tráquea en un plástico de 35 mm de placa de cultivo estándar con medios suficientes L15 tejido a sumergir (autores han utilizado ratones justo antes del nacimiento en el día de gestación 16,5, a través animales recién nacidos, neonatal y adulto 2).
- Quitar el tejido asociado no tráquea unida al exterior dela tráquea utilizando disección roma.
- Retire la laringe con un corte transversal justo por debajo del cartílago cricoides con tijeras de disección micro (Figura 2, línea 1).
- Quite las ramas bronquiales principales izquierdo y derecho con un corte transversal justo por encima de la carina con tijeras de disección micro (Figura 2A, línea 2).
- Aplique suavemente la tráquea con unas pinzas finas y lave el lumen 2-3 veces con ~ 1 ml de medio que baña L15 con un Pipetman P1000 y P1000 punta para borrar cualquier moco y sangre.
- Cortar un segmento de anillo de 3 a 4 de la tráquea con un corte transversal con tijeras de disección micro (Figura 2B, línea 1).
- Cortar longitudinalmente a través del centro del músculo traqueal de este segmento de tráquea corta con tijeras de disección micro (Figura 2B, línea 2).
- Cortar longitudinalmente a través del centro de los anillos cartilaginosos traqueales utilizando tijeras de disección micro (Figura 2C la Figura 2D).
4. Imágenes Cilia
- Transferencia de segmentos de tejido de tráquea, secundarios lumen hacia abajo, sobre el medio de un mm de fondo de cristal placa de cultivo de 35 con 100-200 l de medio L-15.
- Para cuantificar el flujo generado por los cilios añadir una pequeña cantidad de microesferas fluorescentes de 0,20 micras para el medio L-15 bañar la muestra de tejido tráquea (~ 1 x 10 11 partículas / ml o 20 l / ml de la suspensión de microesferas 2,5% acuosa Fluoresbrite).
- Coloque la cámara de imágenes preparado previamente (Véase el Procedimiento 1-3 más arriba) en la parte superior de la muestra lado de la lámina de silicona tráquea hacia abajo, con la muestra de tráquea situado en el centro de la cámara de pared poco profunda formada por la ventana de corte en la lámina de silicona (Figura 1 ).
- Empuje suavemente el cubreobjetos para asegurar en su lugar y retire cualquier exceso de L-15 medios de comunicación de la usin bordesga P1000 y P1000 punta Pipetman.
- Monte el 35 mm con fondo de cristal placa de cultivo y muestra la tráquea en un microscopio invertido con la óptica 100X objetivos y DIC.
- Utilizando una cámara de alta velocidad y software de adquisición de película recoge las películas de la motilidad ciliar a 200 + fotogramas por segundo a lo largo del epitelio traqueal ciliadas del ovillo borde del músculo traqueal (cuadro, E Figura 2D Esbozado: Ejemplo de una imagen fija del vídeo grabado) (Película complementario 1).
- Utilizando imágenes de epifluorescencia con FITC y una cámara CCD con poca luz (Ver lista de equipo anterior), recoge películas de movimiento de microesferas fluorescentes en toda la superficie del epitelio traqueal ciliadas para permitir la cuantificación posterior de flujo generado cilios (Película complementaria 2).
5. La cuantificación de la motilidad de los cilios
- Cargar películas con imagen DIC en el paquete de software ImageJ y siguiendo la técnica descrita por Iain Drummond 13 utilice la herramienta de línea para dibujar una línea de trama que cruza el cilios. A "Reslice" de esta línea genera una imagen de tipo quimógrafo donde el movimiento de los cilios a través de la línea genera un patrón de onda. El número de píxeles entre cada pico de onda se les midió (un pixel = un fotograma de la película) de la cual se puede calcular el número de latidos por minuto (es decir Hz).
- Para medir los cilios generado películas de cuentas fluorescentes de carga de flujo en el paquete de software ImageJ, y usar el plugin MTrackJ 14 para realizar un seguimiento de forma manual perlas fluorescentes través de la superficie de la tráquea epitelios y dejar que el software de generar la velocidad del grano y la direccionalidad para cada talón seguimiento.
Se debe tener cuidado cuando se utiliza perlas fluorescentes para cuantificar el flujo como la distancia desde el cilios pueden influir fuertemente en la magnitud de flujo medida. El movimiento del talón en Suplementario Película 2 es un buen ejemplo de esto. En este ejemplo perlasel movimiento es rápido en la superficie de los cilios de latir y se reduce significativamente fuera de los granos más lejos en los medios de comunicación de baño. Para controlar esto, los trazados de talón sólo deben recogerse a una distancia fija por encima del epitelio ciliado en todas las muestras para permitir comparaciones correctas a realizar. Por último, para obtener datos representativos sobre el flujo de fluido, los granos deben ser rastreados por el mayor tiempo posible, preferimos utilizar pistas de talón que cubren las células ciliadas + 10 para el cálculo de flujo de fluido.
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Representative Results
Control de los cilios vía aérea debe ser claramente visible y visto de superar en forma coordinada (Película suplementario 1, la reproducción de películas es más lento que el tiempo real de 15%), con un flujo notable en la dirección del batido ciliar (Película Suplementario 2; reproducción de la película es 100% tiempo real). La cuantificación de las películas cilios debe producir resultados similares a la observada en la Figura 3. Colección de películas DIC de alta velocidad hace posible la cuantificación de la frecuencia de batido ciliar (Figura 3C) y da buenas imágenes para la evaluación cualitativa de la forma de batido ciliar, mientras que el seguimiento de perlas fluorescentes permite la medición de los cilios velocidad de flujo generado (Figura 3D) y la direccionalidad (Figura 3E).
Utilizamos direccionalidad para dar un índice de flujo lineal. Direccionalidad se calcula dividiendo el desplazamiento total recorrida por un fluorescente talón (es decir, el más cortodistancia entre los puntos de inicio y final del trazado) por la distancia a fluorescentes movimientos de cuentas lo largo de todo el trazado. Por lo tanto, una perla fluorescente que se mueve en una línea recta tendría una direccionalidad de uno, mientras que una perla fluorescente meandros ampliamente desde una trayectoria recta tendrá una direccionalidad mucho menor que 1.
Hemos fotografiado muestras durante un máximo de una hora con cualquier alteración notable en la función de batido ciliar.
Figura 1. Vista isométrica ampliada de la cultura de configuración plato y posicionamiento de la muestra tráquea. NB: la hoja de cubreobjetos y de silicona debe ser montado antes de poner la muestra de tráquea en la placa de cultivo.
Figura 2. Ejemplo de un ratón tráquea disección usando este protocolo, a partir de una tráquea intacta (A) a la imagen formada resultado final (E) (véase el procedimiento de los pasos 3.2 a 3.8 para la explicación de las etiquetas). Las barras de escala representan en AD 500 micras. Barra de escala en E representa 25 micras.
Figura 3. Resultados previstos obtuvieron usando un ratón de tipo salvaje como la tráquea muestra preparada por el protocolo descrito aquí. (A) Un solo fotograma de una película DIC alta velocidad (Ver película suplementario 1 para la película DIC representante). (B) sigue el movimiento de cuatro perlas fluorescentes de todo el surface de una muestra de epitelio traqueal (Ver suplementario película 2 para la película fluorescente representante). (C) frecuencia de batido Cilia cuantificó a partir de DIC películas motilidad cilios de alta velocidad (n = 41 mediciones de puntos aleatorios de 6 tráqueas de ratón). (D) Velocidad de Flujo y (E) direccionalidad de flujo cuantificada de seguimiento de movimiento del talón fluorescente través de la superficie de las muestras de epitelios traqueales (n = 31 fluorescentes trazados de talón 6 de tráqueas de ratón). Los datos se desplaza como media ± SEM. Escala de barras de 10 micras.
Suplementario Movie 1. Película DIC mostrando una forma de batido ciliar y cilios flujo generado observó usando un ratón tráquea muestra de tipo salvaje. La película se recogió a 200 fps, mientras que la reproducción es de 30 fps. Haz clic aquí para ver la película .
Suplementario Movie 2. Película de los cilios generated flujo a través de un ratón de tipo salvaje de la muestra tráquea usando 0,20 micras microesferas fluorescentes y microscopía de epifluorescencia. La colección de películas y el juego de vuelta es de 15 fps. Haga clic aquí para ver la película .
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Discussion
Medición de la frecuencia de batido ciliar (CBF) es relativamente fácil de usar objetivos de microscopio de alta potencia y rápida adquisición de imágenes de hardware 13,15, y explica por qué las mediciones CBF forman la base de la mayoría de los estudios de investigación de la depuración mucociliar en la salud y la enfermedad. Sin embargo, mientras que la medición CBF es esencial para la comprensión de la depuración mucociliar, la medición de la CBF solo hace caso omiso de la importancia subyacente de tanto el flujo generado ciliar y la forma de onda de batido ciliar, ambos de los cuales son más difíciles de medir, a menudo son ignorados, y no se puede correlacionar con CBF. Un ejemplo de cómo se incrementó CBF puede no corresponder con el aumento del flujo generado ciliar se ve en algunos pacientes con mutaciones DNAH11. DNAH11 es una proteína de cadena pesada axonemal dineína, las mutaciones en los que se ha informado para causar tanto hipercinético batido ciliar (más rápido) y la forma de onda de batido ciliar anormal que se prevé que cause problemas con aclaramiento mucociliar 16. El significant ventaja de nuestro protocolo es que permite la fácil visualización de los cilios en ángulos rectos a la dirección de batido ciliar, permitiendo una vista de perfil de los cilios que es óptima para obtener imágenes de alta resolución de la forma de batido ciliar y cilios generó un flujo de fluido a través de la superficie de el cilios, permitiendo así una comparación directa de la CBF con forma de onda de batido ciliar y / o cilios genera flujo dentro de una sola muestra.
Otra ventaja de esta técnica es que los cilios de la tráquea recién cosechado retener su capacidad de superar de una manera coordinada a través de toda la superficie del epitelio respiratorio, permitiendo por lo tanto fácil correlación entre CBF y el flujo generado por los cilios. Tal movimiento ciliar coordinado no se observa en reciliating ratón cultivos epiteliales de la tráquea, que a menudo ciliado mal y muestran batido ciliar en direcciones aleatorias 9,10. El batido ciliar coordinado observado utilizando la técnica de epitelio traqueal se describe aquí puede proporcionar los medios para interrogate los mecanismos que regulan la coordinación del movimiento ciliar y su posible papel en el aclaramiento mucociliar.
La parte más difícil de este protocolo para las investigaciones será la preparación de la tráquea, incluyendo la limpieza de grasa y tejido conectivo de la superficie de la tráquea (Figura 2a), y cortando longitudinalmente por el centro del músculo traqueal (Figura 2b, línea 2). Nos encontramos con buenas tijeras de disección micro esenciales tanto para la limpieza de tejidos y la posterior trachealisotomy. Por otra parte, nos resulta más fácil utilizar la porción inferior de la tráquea justo por delante de la quilla donde la tráquea se bifurca en los bronquios primarios izquierdo y derecho cuando parte del músculo traqueal aquí es más amplia. Sin embargo, con la experiencia suficiente, cualquier longitud de la tráquea, o de hecho los bronquios primarios pueden ser utilizados con éxito para generar películas de alta calidad de la motilidad de los cilios y los cilios generar flujo.
Posible técnicaproblemas asociados con este protocolo incluyen la muestra de la tráquea durante la formación de imágenes en movimiento y / o la muestra no ser capaz de ser llevada al enfoque. Ambos de estos problemas pueden surgir si demasiada L-15 se añadió con la muestra y / o la hoja de cubierta de la cámara de formación de imágenes no se ha pulsado de forma segura, lo que provoca que la muestra para flotar dentro de la cámara de hoja de la cubierta que resulta en movimiento de la muestra o la muestra flotando por encima del plano de enfoque haciendo foco imposible. Para evitar esto, es importante para tratar de minimizar la cantidad de líquido que se usa para montar cada muestra tráquea.
Una posible limitación de esta técnica es que la medición de los cilios de flujo de fluido generado puede no coincidir completamente en el transporte mucociliar in vivo. Nuestro hallazgo de los cilios genera flujo de ~ 10 m / seg es significativamente inferior a los 100 m / seg transporte mucociliar reportados utilizando in vivo de ratón tráquea 17. Esta diferencia se debe probablemente a los cilios estar sumergido en los medios de comunicación como del oppOSED simplemente moviendo una capa fina de moco a través de la interfase aire-líquido. Sin embargo, este método tiene una gran utilidad para la comparación relativa de la motilidad ciliar entre diferentes muestras.
Cabe señalar que, si bien la técnica experimental y los datos presentados aquí se llevaron a cabo a temperatura ambiente, en sí temperatura juega un papel importante en la regulación de actividad de los cilios. CBF en nasal humana y muestras traqueales se ve que es linealmente correlacionada con la temperatura entre 5-20 ° C, con un pequeño aumento en el FSC visto entre 20-45 ° C 18. Vemos una relación similar entre la temperatura y la CBF en ratones muestras de las vías respiratorias (observaciones no publicadas). Por lo tanto, mientras que la actividad cilios registro a temperatura ambiente para la rápida evaluación de posibles defectos en la motilidad de los cilios en nuevos ratones mutantes, también Incubamos algunas muestras a 37 ° C para determinar la actividad de los cilios en condiciones fisiológicas. Para lograr esto de una incubación de CH microscopio estándarámbar se puede utilizar para mantener las muestras a 37 ° C.
Simples modificaciones a este protocolo se convierten en un poderoso instrumento para la evaluación de la regulación de la actividad de los cilios vía aérea por una amplia gama de factores, tales como el papel de los agentes farmacológicos, la temperatura, factores genéticos, exposición ambiental, y / o los factores mecánicos, tales como la carga de moco en función de los cilios y la generación de las vías respiratorias / mantenimiento de las vías respiratorias cilios latido.
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Disclosures
Los autores tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El proyecto fue apoyado por el NIH subvención U01HL098180 Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre. El contenido es de exclusiva responsabilidad de sus autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre o de los Institutos Nacionales de la Salud
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Leibovitz’s L-15 Medium | Invitrogen | 21083-027 | No phenol red |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30088.03 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| 2x fine forceps | Roboz | RS-4976 | |
| Dissection scissors | Roboz | RS-5676 | |
| Micro dissection scissors | Roboz | RS-5620 | |
| Scalpel | Roboz | RS-9801-15 | |
| P1000 pipetman | Gilson, Inc | F123602 | |
| P1000 tips | Molecular BioProducts | 2079E | |
| 18 mm round glass cover slips | Fisher Scientific | 430588 | |
| Plastic 35 mm culture dishes | Corning | 430588 | |
| Glass bottom 35 mm culture dishes | Warner Instruments | W3 64-0758 | |
| Silicone sheet 0.012" (0.3 mm) thick | AAA Acme Rubber Co | CASS-.012X36-63908 | |
| 0.20 μm diameter Fluoresbrite YG Carboxylate Microspheres | Polysciences | 09834-10 | |
| Inverted microscope, with 100x oil objective and DIC filters | Lecia | DMIRE2 | Brand is not critical. |
| 100-watt mercury lamp, epifluorescent FITC excitation/emission filters | Lecia | Brand is not critical. | |
| Microscope stage Incubator | Lecia | 11521749 | Not required if imaging cilia at room temperature |
| High-speed camera bright field | Vision Research | Phantom v4.2 | Brand is not critical. Must be faster than 125 fps |
| High-speed fluorescent camera | Hamamatsu | C9100-12 | Brand is not critical. Must be faster than 10 fps |
| Movie analysis software | National Institutes of Health | ImageJ with MtrackJ plugin |
References
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