Summary
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Abstract
末梢動脈疾患の動物モデルにおける前臨床研究では、微小循環を刺激するように設計された治療薬の有効性をテストする上で重要な役割を果たしている。投与経路が深く、これらの薬剤1,2の生物活性と有効性に影響を与えるため、これらの薬剤のための配送方法の選択は重要です。本稿では、局所的にカテーテルを挿入浸透圧ポンプを用いて、虚血性後肢中の物質を管理する方法を示します。このポンプは、時間の割り当てられた期間に連続して水溶液の一定量を供給することができます。また、左後肢に大腿深とepigastrica動脈の起源の近位大腿動脈の結紮により誘発される一方的な後肢虚血の我々のマウスモデルを提示する。最後に、我々はMicrofil、シリコーン放射線不透過性キャスティングエージェントと大動脈腹部大動脈と後肢の血管系の灌流のin vivoカニュレーションとライゲーションで説明。 Microfilは灌流と塗りつぶし全体の血管床（動脈と静脈）を、我々は出口のための主要な血管の導管をライゲーションしているため、エージェントは小標本のマイクロCT 3を利用した将来のex vivoでのイメージングのための血管系内に保持することができますことができます。
Introduction
末梢動脈疾患（PAD）は、脚部4に不十分な血液供給を引き起こすアテローム性動脈硬化症である。それは8から12000000までのアメリカ人に影響を与え、現在の治療法は限られた救済5,6を提供しています。足の血液循環を改善する新規な治療剤は疾患の進行を抑制するだけでなく、生活の質を向上させないだろう。しばしば高齢の患者で見られる減少腎臓や肝臓の機能が薬物代謝を減少させ、全身投与で副作用を増やすことができますので、PADの発生率は50歳以上の人々に高くなっているので、地元の薬理学的療法は、より望ましい治療法である。
したがって、我々は、局所的に投与薬剤が血管新生および血管リモデリングを促進することにより、後肢虚血を軽減するかどうかを調べるために、PADのマウスモデルを作成しました。具体的には、連続的に治療薬を送達するためにカテーテルを挿入浸透圧ポンプを用いマウスの虚血性大腿筋。我々の送達システムを用いて、ローカル環境での薬物の最適な濃度を維持することができたが、このアプローチは、適切な薬剤の生物活性を可能にする可能性全身性副作用を回避する、および全身投与に関連する限られた局所薬物アクセスの欠点を克服する。また、ローカルで管理エージェントは血行再建を促進するかどうかを評価するために、我々は、高度な鋳造と微小血管の変化の定量化を可能にする高精細イメージング技術を使用していました。総称して、このビデオ記事で使用方法の組み合わせは、PAD患者の7-9に薬理学的に誘導された血管再生の理解を助けるための前臨床試験で有用である。
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Protocol
1。プライミング浸透圧ポンプ
- ポンプを準備するとき（ 例えば 、手袋、層流フード）無菌テクニックを使用してください。パッケージングからポンプとフロー司会を削除します。空ポンプを計量し、重量（mg）を記録する。
- 小さな1CCシリンジと鈍ひっくり返さ27G充填チューブを使用することにより、気泡を作成しないように、ゆっくりとポンプを埋める。溶液は、ポンプの上部に達すると、充填停止する。
- 過剰の溶液を拭き取り、いっぱいポンプ重量を量る。ほとんどの水溶液では、mg単位重量はμLのボリュームと同じです。空対充填された重量差は、指定された平均充填容積の90％以上であるべきである。そうでない場合は、シリンジと補充でポンプを避難。あなたが技術的な問題が発生した場合にはhttp://www.alzet.com/products/guide_to_use/filling.htmlでポンプ命令のトラブルシューティングの項を参照してください
- フローmoderatから白フランジを破るためにピンセットを使用してくださいまたは、チューブを曲げたり潰したりしないように注意してください。 3〜4ミリメートル程度カバーし、司会のいずれかの端にP50カテーテルを取り付けます。カテーテルおよび添付司会を埋める、カテーテルの先端部に取り付け、シリンジを残して、シリンジを使用してください。
- カテーテルは、ポンプと面一になるまでポンプに流れ司会を挿入します。その後、カテーテルの先端からシリンジを取り外します。プライムに6時間（好ましくはO / N）マウスにそれを注入する前に、ポンプの最低37℃のインキュベーター中の滅菌0.9％食塩水またはPBS溶液にポンプを配置します。ポンプ吐出速度は、モデル番号（14日間すなわちモデル 1002 = 0.25μL/時）によって異なります。
2。マウスで片側後肢虚血を作成する
- 0.4 L / minの流量で100％O 2で2〜4％の間でイソフルランセットでマウスを麻酔し、depilatoと後肢と背面領域に髪（好ましくは手術前の日）を除去するRYクリーム。
- 手術前に、すべての手術器具を滅菌。誘導麻酔室にマウスを置きます。 2.1節で説明したのと同じ麻酔設定を使用します。
- マウスが外部刺激に応答しないになるまで待ってから、（1.5から2.0パーセント）イソフルランの連続的な流れを実現しフィットノーズコーンと手術台の上に腹臥位に配置します。
- 切開部位で、麻酔薬の推奨用量（0.25％（<1ミリリットル/ kg）のブピバカイン）を、注入し、70％エタノールに続いポビドンヨード液で肌を扱う。背中（脊柱の側で、肩甲骨領域）上の4〜6ミリメートルの切開を行います。細かい鉗子で皮下膜を分離してから、70％エタノールに続いポビドンヨード液で肌を治療し、大腿内側に向かって膝上のマイクロ手術用ハサミで0.8〜1センチメートル切開を行う仰臥位にマウスを回し、大腿動脈の道に続く。
- アップトンネル背面の切開に大腿内側から小さなシースチューブ（6 - フランス語）と胴体の側面。
- 腹臥位でマウスを置きます。 PBS溶液からプライミング浸透圧ポンプ/カテーテルを外し、太ももに、シースチューブを通して、カテーテルを導く。
- 背中内側にポンプを置き、6-0プロレン縫合糸（70％エタノールに続いポビドンヨード液で肌を扱う）で逆切開を閉じます。仰臥位で戻ってマウスを置き、シースチューブを取り除く、太ももに切開を介して公開カテーテルを残して。外科テープで脚を固定します。
- 血管系を明らかにするために皮下脂肪組織を分離する。良い血管系を可視化するために、切開を開くためにトラクターを使用しています。
- ピアース維管束にアクセスするために微尖ったピンセットを使用して優しく膜大腿シース。解剖すると股間近く大腿静脈や神経から大腿動脈を分離し、生じないように注意しながら元cessive出血。
- 大腿分岐（大腿深とepigastrica動脈の起源）の近位大腿動脈2〜3ミリメートルを中断するための場所2 8-0 PROLENE隣接縫合糸を。
- 適切な長さにカテーテルをカットし、物質の標的送達を確保するための浅筋膜へ6-0プロレン縫合でそれを固定し、大腿部の前外側領域にチップを置きます。 6-0実行中の縫合糸で脚切開を閉じます。鎮痛剤の最終的な皮下注射（ブプレノルフィン、0.1 mg / kg体重）を管理、70％エタノールに続いポビドンヨード液で肌を治療し、ケージにマウスを返す。リカバリ中に加熱ランプを使用してください。
- 30分間の回復期間の後、後肢虚血の作成を確認するためにレーザードップラーイメージングのためのマウスを用意しております。
- 手術後5日間1日2回、動物を監視します。動物の移動度は痛みを分析することが観察されます。ケージ内の廃棄物はインド語として機能します食べるator。動物は痛みや不快感を経験している場合にも、モニター期間中に決定し、二回毎日ブプレノルフィン（0.1mg/kg）の皮下注射を与える。
3。イメージング試料作製
- 2.1節で述べたように、マウスを麻酔。仰臥位で手術台の上にマウスを転送します。血管系の凝固を防ぐために、皮下にヘパリン1,000 IUを注入。マウスがノーズコーンに接続されている間、胸腔と下腹部を露出するのに十分な大きさで切開を行います。大動脈腹部大動脈（IAA）を露出するために動物の左側腹部臓器を移動します。下大静脈静脈から大動脈を慎重に分離します。
- カテーテル挿入時の出血を減らすために、近位IAAを連結。その後、IAAに小さな切開を行います。 IAAに½G鈍針（P10カテーテルに接続されている）27を挿入し、6-0縫合糸で固定します。
- 塗りつぶし220ccをヘパリン化生理食塩水注射し、10％中性（NBF）緩衝ホルマリン。コントラストX線不透過性シリコーンゴム化合物と5ccの注射器を埋める。 MV-希釈剤：1:1.25:0.5の作業比率のMV-硬化剤MV-化合物の3成分を混ぜる。エージェントは、重合前に混合物（Microfil）は、わずか20分の作業時間を持っているので、血管系に注入する直前までMV硬化剤を添加しないことをお勧めします。
- 右心房にカットをすると安楽死を誘導すると、余分な水分の排出を可能にするために、イソフルランの過剰摂取を管理します。針先に生理食塩水を充填したシリンジを取り付け、5分間血管系をフラッシュし始める。すべての血液が血管の外にフラッシュされていることを確認し、イソフルランをオフにして、フラッシュが始まるとノーズコーンを外してください。次に、上記で詳述カテーテル（3.2）と、さらに5分間圧力灌流にホルマリンで満たされたシリンジを取り付けます。最後に、コントラストと、最後の注射器を灌流ゆっくり5分間マウスに剤。
- オプション：写真カメラで血管系にMicrofilだけ動脈構造が灌流されていることを確認する。
- 4で10％NBFや店舗°CO /造影剤重合用Nを充填した容器内にマウスを置きます。 24時間後、10％NBFをリフレッシュし、解剖ツールを使用して胴体の下半分（下腹部大動脈結紮に対して遠位）で皮膚を除去し、室温で4日以上のために容器にマウスを後ろに置きます。
- 対側と虚血性後肢を解剖し、骨の脱灰を促進するために48時間ギ酸溶液（カル - 例II）に標本を置きます。その後、1時間と10％NBFへの復帰のために流水で検体をすすぎ、Faxitron（骨が脱灰されていることを確認するために使用されるX線システム）およびマイクロCTイメージングを進める。
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Representative Results
アニメーションは、浸透圧ポンプの挿入とプロトコルに詳述後肢虚血手術を示しています。 図1は、虚血を確認し、後肢の灌流のレーザードップラー画像を示す。 Microfilと血管鋳造後、血管網の3次元マイクロCT画像がMicrofil効果的に血管を埋めることができることを示している（ 図2A）が、その不連続性が発生する可能性があります（ 図2B）により、様々な手続きの要因（ 例えば 、気泡、不足の圧力、Microfilの粘度）。
アニメーション伝説
- 腹臥位でマウスを置き、そのバック脊柱側の上の切開を行います。
- 小さなバック切開を公開します。
- 仰臥位でマウスを置き、大腿内側で膝の上に小さな切開を行います。
- 皮膚を分離、血管系を公開し、覚書の側胴体アップシースチューブを挿入する背面切開に電子。
- 浸透圧ポンプを取り、シース管にカテーテルを挿入します。
- 仰臥位でマウスを置き、太ももの切開にチューブを通してカテーテルを下に導く。
- 腹臥位でマウスを置き、その後ろにポンプを配置し、切開を閉じます。
- 仰臥位でマウスを置き、シースチューブを取り外します。
- トラクターで皮膚を後ろに引いて、動脈から静脈を分離する顕微ツールを使用します。縫合と大腿分岐上記大腿動脈を結紮ダブル。
- 太ももの表面組織にカテーテルを固定します。
- 縫合糸で脚切開を閉じます。
図1。レーザードップラー血流イメージャ経由後肢虚血の確認。代表ドップラー画像翔Wマウスの後肢で大腿動脈の外科結紮前後の血流。虚血（矢印参照）左後肢に作成されています。
図2。 Microfilと後肢血管系の3次元マイクロCT画像。血管鋳造後肢（）を通して静脈と動脈のネットワークを明らかにする。 Microfilの不連続性は、また（B）、（矢印参照）詳細な血管のネットワークの可視化を無効にして発生する可能性があります。
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Discussion
ここでは、後肢虚血のマウスモデルにおける浸透薬物/物質の送達のための方法を提示する。また、我々は血管網の分析のための3次元再構成を生成するためにMicrofilを使用している鋳造技術を説明する。
虚血の程度または重篤度は、動脈結紮/切除がどこで行われるかに応じて異なります。我々は大腿深とepigastrica動脈の起源の近位大腿動脈の二重結紮を作成しましたが、このアプローチは、遠位後肢でより重度の虚血を生成することができます。手術後の動物を監視し、鎮痛薬の局所投与によって痛みの緩和を提供するようにしてください。さらに、Microfilは常に完全に四肢血管系を灌流しない場合があります。したがって、それはすべての血液はヘパリン加生理食塩水の灌流後に血管系の外にすすがれていることを確認することが重要である。 Microfilの不完全な灌流の理由の欠如を含むpplied圧力またはMicrofilの不適切な粘度、Microfilは後肢の最も遠位の領域に達したため、全体の血管系を埋め確保するのに十分でなければなりません、どちらも。特定の動物アプリケーションの希釈比：これらの問題に対処するために、化合物と100 mmHgの、実験で一貫性のある圧力をかける。
動脈（既存の側副動脈の成長）を研究するために、理想的なアプローチは、側副血管への血流をリダイレクトするように大腿深枝の原点に直ぐ遠位大腿動脈を結紮することである。ただし、この工程に応答して、マウス系統間で大きく変化し、虚血の程度（ 例えば 、C57BL / 6）いくつかのマウス系統が不十分であってもよい。それほど深刻虚血モデルは、C57BL / 6などの重く血管新生マウス系統における治療効果を調査するため、長期間窓を提供することはできません。これらの問題を回避するために、我々は後肢虚血bを作成yは良好な局所薬物放出効果を実証するために、より厳しい虚血を作成し、近位大腿動脈を結紮したが、このアプローチは、近位深い分岐側副血管の動脈の分析を妨げる。したがって、治療効果は、薬物/物質が放出される解剖学的部位（太もも前外側）と一致している遠位虚血領域から主に描かれています。地元の出血が動脈形成と血管新生の両方に影響を与える、炎症や浮腫につながることができますので、手術中に、それは壊れやすい大腿静脈を傷つけないように重要です。私たちは、ストレッチ、ひずみ、または動脈の破裂を避けるために適切な結び目のタイとの大腿動脈を結紮するために8-0プロレン縫合糸を使用することをお勧めします。また、Microfilは、注射のための技術的な難しさを作成している、それはすぐに重合しているため3成分（化合物、希釈剤、および硬化剤）を混合した後（20分以内）すぐに使用する必要があります。前述のSTAテッド、Microfilは常に首尾よく小さい血管系の灌流ませんが、適切な技術の実践と使用は、この制限を克服することができます。
ポンプの充填量は平均充填量の90％以上でなければならない、そうでない場合、余分な空気がポンプ内に閉じ込められてしまう可能性があります。追加の技術的な情報は次の場所にありますwww.alzet.com 。また、Microfil剤は、特定の用途に好適な粘度である必要があり、化合物の希釈剤の比率は変更する必要がありそう。
後肢虚血モデルは、高度に再現可能であり、PAD 10,11にも適用可能である。このモデルにおける治療剤の送達は、安定した有益な結果2を入手することが必要である。結論として、我々は、形態学的構造を可視化するために使用される3D撮像技術は、マウスの血管系を調べるための優れたツールとstudyiための強力なシステムを提供するngの血管病態。
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Disclosures
著者らは、利害の対立を宣言しません。全ての動物の手順は、実験動物のケアと使用に関するガイドラインに従って実施され、ヒューストンのテキサス健康科学センターの大学制度アニマルケアと使用委員会（IACUC）によって承認された。
Acknowledgments
著者は編集支援のために、マイクロCT手術支援のためのイメージング、エドワードTH Yehは、MD、そしてレベッカバートー、博士と彼の技術支援のためのMDアンダーソン小動物イメージング施設のキース·ミシェルに感謝したいと思います。この作品は、アメリカ心臓協会によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Surgical tools | Fine Science Tools | Type: Tool | |
| Puritan sterile cotton swabs | Fisher Scientific | 22-029-499 | Type: Tool |
| Betadine (povidone-iodine) | Fisher Scientific | 19-065534 | Type: Reagent |
| 70% Alcohol pads | Fisher Scientific | NC9926371 | Type: Reagent |
| Phosphate buffered saline | Lonza | 17-516F | Type: Reagent |
| 6-0 prolene suture | Cardinal Health | 8709 | Type: Tool |
| 8-0 prolene suture | Cardinal Health | 2775 | Type: Tool |
| Depilatory cream | Nair | Type: Tool | |
| Osmotic pump |  ALZET |
1002 | Type: Tool, 14 day release |
| Vinyl catheter | ALZET |
7760 | Type: Tool |
| Heparinized saline (0.9%) | Baxter | 2B0944 | Type: Reagent |
| Neutral buffered formalin | Richard-Allan Scientific | 5705 | Type: Reagent |
| Microfil (silicone rubber contrast agent) | Flowtech | MV-112 | Type Reagent, Microfil White |
| Cal-Ex II (formic acid solution) | Fisher Scientific | CS511-1D | Type: Reagent |
| Buprenex | CIII | 7571 | Type: Analgesic |
| Bupivicaine | Hospira, Inc. | 381 | Type: Analgesic |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Carl Zeiss Microimaging | Zeiss Stemi 2000-C | Type:Equipment |
| Laser Doppler perfusion imager | Perimed Inc. | Periscan PIM3 | Type:Equipment |
| Micro-CT imaging system | GE Healthcare | Explore Locus SP | Type:Equipment |
References
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