Summary
We zien hier de
Abstract
Preklinisch onderzoek in dierlijke modellen van perifeer arterieel vaatlijden speelt een vitale rol bij het testen van de efficiëntie van therapeutische agentia ter microcirculatie stimuleren. De keuze van de werkwijze voor levering van deze middelen is belangrijk omdat de toedieningsweg diepgaande invloed van de biologische activiteit en werkzaamheid van deze middelen 1,2. In dit artikel laten we zien hoe een stof in ischemische hindlimbs lokaal te beheren met behulp van een katheter osmotische pomp. Deze pomp kan een vast volume waterige oplossing continu te leveren voor een toegewezen tijd. Ook presenteren onze muismodel eenzijdige achterpoot ischemie geïnduceerd door ligatie van de a. femoralis proximaal van de oorsprong van profunda femoris en epigastrica slagaders in de linker achterpoot. Tenslotte beschrijven we de in vivo infusen en ligatie van de infrarenale abdominale aorta en perfusie van de achterpoot vasculatuur met Microfil, een silicone radiopaak middel casting. Microfil kan doortrekken en vul het hele vaatbed (arteriële en veneuze), en omdat we de grote vasculaire leiding voor exit zijn geligeerd, kan de agent in het vaatstelsel worden bewaard voor toekomstige ex vivo beeldvorming met het gebruik van kleine monster micro-CT 3 .
Introduction
Perifeer arterieel vaatlijden (PAD) is een atherosclerotische ziekte die onvoldoende bloedtoevoer in de benen 4 veroorzaakt. Het beïnvloedt 8-12000000 Amerikanen, en de huidige medische behandelingen bieden alleen een beperkte aftrek 5,6. Nieuwe therapeutische middelen die de bloedcirculatie in de benen te verbeteren zou niet alleen inhouden progressie van de ziekte, maar ook verbetering van de kwaliteit van leven. De incidentie van PAD is hoger bij mensen boven de leeftijd van 50 jaar, zodat de lokale farmacologische therapie is een meer wenselijke behandelingsvorm, omdat de verminderde nier-en leverfunctie vaak gezien bij oudere patiënten kan het metabolisme verlagen en de bijwerkingen van systemische toediening.
Zo creëerden we een muismodel van PAD te onderzoeken of lokaal toegediende middelen te verlichten achterbeen ischemie door het bevorderen van angiogenese en microvasculaire remodeling. Specifiek, gebruikten we een katheter osmotische pomp het therapeutische middel continu leveren aan deischemische dijspier van muizen. Met behulp van onze levering systeem, waren we in staat om optimale concentraties van het geneesmiddel in het plaatselijke milieu te handhaven; deze aanpak zorgt voor geschikte geneesmiddel bio-activiteit, voorkomt mogelijke systemische bijwerkingen, en overwint het nadeel van de beperkte lokale toegang drugs geassocieerd met systemische toediening. Daarnaast, om te beoordelen of lokaal toegediende middelen te bevorderen revascularisatie, gebruikten we geavanceerde casting en high-definition imaging technieken die kwantificering van veranderingen in de microvasculatuur stellen. Gezamenlijk, de combinatie van methoden die in deze video artikel derhalve in preklinische studies om te helpen bij het begrijpen van farmacologisch geïnduceerde revascularisatie bij PAD patiënten 7-9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Priming de osmotische pomp
- Gebruik steriele technieken (bijv. handschoenen, laminaire stroming kap) bij de voorbereiding van de pompen. Verwijder de pomp en stromingsmoderator uit de verpakking. Het lege pomp en registreer het gewicht (mg).
- Pomp vullen langzaam te voorkomen dat luchtbellen, met een kleine 1 cc spuit en blunt-tipped 27G vulbuis. Als de oplossing de top van de pomp komt, zet vullen.
- Veeg de overtollige oplossing en wegen van de gevulde pomp. Voor de meeste waterige oplossingen, het gewicht in mg is hetzelfde als het volume ul. Het verschil in lege versus gevulde gewicht mag niet meer dan 90% van de opgegeven gemiddelde vulvolume zijn. Zo niet, evacueren de pomp met de spuit en vul. Als u technische problemen ondervindt verwijzen wij u naar het gedeelte over probleemoplossing van de instructies pomp bij http://www.alzet.com/products/guide_to_use/filling.html
- Gebruik een pincet om de witte flens los te maken van de stroom moderatof, wees niet te buigen of plet de buis. Bevestig een P50 katheter naar beide uiteinden van de moderator, die ongeveer 3-4 mm. Met een spuit met de katheter en de bijgevoegde moderator in en laat de spuit aan het distale gedeelte van de katheter.
- Plaats de stromingsmoderator in de pomp totdat de katheter gelijk ligt met het oppervlak pomp. Verwijder vervolgens de spuit uit het distale uiteinde van de katheter. Plaats de pomp in een steriele 0,9% zoutoplossing of PBS-oplossing in een 37 ° C incubator gedurende minimaal 6 uur (bij voorkeur O / N) om de eerste pomp voor het in de muis implanteren. De pomp levering tarief varieert met het modelnummer in (Model 1002 = 0,25 ul / uur gedurende 14 dagen).
2. Creëren Eenzijdige achterbeen ischemie in de muis
- Verdoven de muizen met isofluraan set 2-4% in 100% O2 met een stroomsnelheid van 0,4 L / min en verwijder het haar (bij voorkeur de dag vóór de operatie) op het achterbeen en rug met een depilatory crème.
- Steriliseren alle chirurgische instrumenten voor de operatie. Plaats de muis in de inductie anesthesie kamer. Gebruik dezelfde narcose instellingen in paragraaf 2.1 beschreven.
- Wacht tot de muis is niet-ontvankelijk voor prikkels van buitenaf en plaats deze vervolgens in buikligging op de operatietafel van een ingericht neuskegel dat een continue stroom van isofluraan (1.5-2.0%) levert.
- Injecteer de aanbevolen dosis anestheticum (Bupivacaïne, 0,25% (<1 ml / kg)) en incisie, behandelen de huid met een povidon-joodoplossing gevolgd door 70% ethanol. Voeg een 4-6 mm incisie aan de achterkant (aan de zijde van de wervelkolom in de scapulae regio). Scheid de onderhuidse membraan met fijne tang, draai dan de muis naar de rugligging de behandeling van de huid met een povidonjood-oplossing, gevolgd door 70% ethanol en maak 0,8-1 cm incisie met micro-chirurgische schaar boven de knie naar de mediale dij, volgen van het pad van de arteria femoralis.
- Tunnel van dezijde van de romp met kleine mantel buis (6 French) vanaf het mediale dij de insnijding op de rug.
- Plaats de muis in buikligging. Verwijder het gegronde osmotische pomp / catheter van de PBS-oplossing en begeleiden van de katheter, door de koker leidingen, de dij.
- Plaats de pomp in de rug en sluit de achterkant incisie met 6-0 prolene hechtdraad (de behandeling van de huid met een povidonjood-oplossing, gevolgd door 70% ethanol). Plaats de muis terug in rugligging, verwijder de mantel buis, waardoor de katheter blootgesteld door de incisie op de dij. Beveilig de been met chirurgische tape.
- Scheid het onderhuidse vetweefsel het vaatstelsel tonen. Om het vaatstelsel beter te visualiseren, gebruik dan een oprolmechanisme om de incisie te openen.
- Doorboren de membraneuze femorale schede zachtjes door fine-puntige tang om toegang te krijgen tot de vasculaire bundel. Ontleden en te scheiden van de femorale slagader van de femorale ader en zenuw in de buurt van de lies, zorg niet te veroorzaken exovermatige bloedingen.
- Plaats twee 8-0 Prolene hechtingen naast de femorale slagader onderbreken 2-3 mm proximaal van de femorale vertakking (de oorsprong van de profunda femoris en epigastrica slagaders).
- Snijd de katheter op de juiste lengte en plaats de tip om het anterolaterale gebied van de dij, vastzetten met een 6-0 prolene hechtdraad tot de oppervlakkige fascia om gerichte toediening van de stof te garanderen. Sluit het been incisie met een 6-0 running hechtdraad. Dien een laatste subcutane injectie van pijnstillende (Buprenorphine; 0.1 mg / kg), de behandeling van de huid met een povidonjood-oplossing, gevolgd door 70% ethanol en terug te keren met de muis naar de kooi. Gebruik een warmtelamp tijdens het herstel.
- Na een 30-min herstelperiode, bereiden de muis voor laser Doppler beeldvorming om de creatie van achterbeen ischemie bevestigen.
- Monitor het dier tweemaal daags gedurende 5 dagen na de operatie. Mobiliteit van het dier zal worden waargenomen om de pijn te analyseren; afval in de kooi zal dienen als een indicator van het eten. Ook tijdens de periode beeldscherm bepalen of het dier pijn of ongemak en een subcutane injectie met buprenorfine (0.1mg/kg) tweemaal daags.
3. Imaging Prepareren
- Verdoven van de muis zoals vermeld in paragraaf 2.1. Overdracht van de muis op de operatietafel in rugligging. Injecteer 1000 IE heparine subcutaan stolling in het vaatstelsel te voorkomen. Als de muis aan de neuskegel, maak een insnijding groot genoeg om de borstholte en de onderbuik bloot. Verplaats de buikorganen naar de linkerkant van het dier naar de infrarenale abdominale aorta (IAA) blootstellen. Scheiden van de aorta voorzichtig uit de inferieure cava ader.
- Afbinden van de proximale IAA om het bloeden te verminderen tijdens katheter inbrengen. Maak dan een kleine incisie op de IAA. Plaats een 27 ½ G stompe naald (bevestigd aan een P10 katheter) in de IAA en zet deze vast met een 6-0 hechtdraad.
- Vullen twee20cc spuiten met gehepariniseerde zoutoplossing en 10% neutraal gebufferde formaline (NBF). Vult een 5 cc spuit met een contrast radiopaque siliconen rubber compound. Meng de drie ingrediënten van de MV-verbinding: MV-verdunningsmiddel: MV-verharder in het werken verhoudingen van 1:1.25:0.5. Aangezien het mengsel (Microfil) slechts een werktijd van 20 minuten voor de stof polymeriseert, wordt aanbevolen om de MV-hardingsmiddel toe tot vlak voor injectie in de vasculatuur.
- Maak een snede in de rechterboezem en toedienen van een overdosis van isofluraan om euthanasie te induceren en te zorgen voor de afvoer van overtollig vocht. Bevestig de zoutoplossing gevulde spuit aan de naald en beginnen aan het vaatstelsel spoelen gedurende 5 minuten. Zorg ervoor dat al het bloed wordt gespoeld uit de vaartuigen; zet de isofluraan en ontkoppel de neuskegel zodra het spoelen begint. Vervolgens bevestig de formaline spuit op de katheter hierboven beschreven (3.2) en druk perfuse voor nog eens 5 minuten. Tenslotte perfuseren de laatste spuit, met het contrastmiddel, langzaam in de muis gedurende 5 minuten.
- Optioneel: Foto Microfil in de vasculatuur met een camera zodat alleen de arteriële structuur geperfuseerd.
- Plaats de muis in een container gevuld met 10% NBF en bewaar bij 4 ° CO / N voor contrastmiddel polymerisatie. Na 24 uur werd de huid te verwijderen op de onderste helft van de romp (distaal van de onderste abdominale aorta ligatie) door dissectie-instrumenten, vernieuwt de 10% NBF en plaats de muis terug in de container nog 4 dagen bij kamertemperatuur.
- Ontleden de contralaterale en ischemische achterpoten, en plaats de monsters in een mierenzuur oplossing (Cal-Ex II) voor 48 uur tot ontkalking van de botten te vergemakkelijken. Daarna spoel de monsters onder stromend water gedurende 1 uur en terugkeer tot 10% NBF en doorgaan met Faxitron (x-ray systeem dat wordt gebruikt om ervoor te zorgen het bot wordt ontkalkt) en micro-CT beeldvorming.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De animatie toont de osmotische pomp inbrengen en achterpoot ischemie chirurgie beschreven in het protocol. Figuur 1 toont laser Doppler beelden van perfusie van het achterbeen, bevestigt ischemie. Na vasculaire gieten met Microfil, een 3D micro-CT-beeld van het vasculaire netwerk blijkt dat Microfil de schepen daadwerkelijk kunnen invullen (Figuur 2A), maar dat discontinuïteiten kunnen optreden (figuur 2B) te wijten aan verschillende procedurele factoren (bijv. luchtbellen, gebrek aan druk, viscositeit van de Microfil).
Animatie Legend
- Plaats de muis in buikligging en een insnijding op zijn rug in de zijkant van de ruggengraat.
- Expose de kleine back incisie.
- Plaats de muis in rugligging en maak een kleine incisie boven de knie bij de mediale dij.
- Scheid de huid, bloot het vaatstelsel, en plaats de mantel buis op de zijkant romp van de mouse naar achteren incisie.
- Neem de osmotische pomp en steek de katheter in de schede slang.
- Plaats de muis in rugligging en begeleiden van de katheter naar beneden door de slang aan op de incisie in de dij.
- Plaats de muis in buikligging en plaats de pomp op zijn rug en sluit de incisie.
- Plaats de muis in rugligging en verwijder de mantel buis.
- Trek de huid met een oprolmechanisme en gebruik microchirurgische instrumenten om de ader te scheiden van de slagader. Verdubbel afbinden de dijslagader boven de femorale bifurcatie met hechtdraad.
- Bevestig de katheter aan de oppervlakkige weefsel van de dij.
- Sluit het been incisie met hechtingen.
Figuur 1. Bevestiging van achterbeen ischemie via laser Doppler perfusie imager. De vertegenwoordiger Doppler beelden show de doorbloeding voor en na chirurgische ligatie van dijbeenslagader in de muis achterbeen. Ischemie werd opgericht in het linker achterbeen (zie pijlen).
Figuur 2. 3D Micro-CT beeld van achterbeen vasculatuur. Vasculaire gieten met Microfil onthullen een netwerk van aders en slagaders in de achterpoot (A). Discontinuïteit Microfil kan ook optreden (B), het uitschakelen van de visualisatie van een gedetailleerde vasculair netwerk (zie pijlen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteren we een methode voor osmotische medicijn / stof aflevering in een muismodel van achterbeen ischemie. Verder beschrijven we een giettechniek waarin we Microfil gebruikt om een 3D reconstructie voor analyse van het vasculaire netwerk produceren.
De mate of ernst van ischemie afhankelijk van waar de arteriële ligatie / excisie gemaakt. We hebben een dubbele ligatie in de a. femoralis proximaal van de oorsprong van de profunda femoris en epigastrica slagaders, kan deze benadering een ernstige ischemie geproduceerd in het distale achterbeen. Zorg ervoor dat de dieren volgen na de operatie en zorgen voor pijnvermindering door lokale toediening van analgetica. Bovendien kan de Microfil niet altijd doortrekken ledematen vaatstelsel volledig. Aldus is het belangrijk dat alle bloed gespoeld uit het vaatstelsel na de perfusie van de gehepariniseerde zoutoplossing. Redenen voor onvolledige perfusie van de Microfil in het gebrek aan eenpplied druk of onjuiste viscositeit van de Microfil, die beide dienen zodanig te zijn Microfil de distale gebieden van het achterbeen bereikt en het gehele vaatstelsel vult het. Om deze problemen aan te pakken, gelden consistente druk bij 100 mmHg en experimenteren met de verbinding: verdunningsmiddel's voor de specifieke dierlijke toepassing.
Om arteriogenese (bestaande collaterale arterie groei) bestuderen de Idealiter kan de femorale slagader onmiddellijk distaal van de oorsprong van de diepe femorale tak om de bloedstroom te leiden naar de collaterale vaten ligeren. De respons op deze procedure varieert sterk tussen muizenstammen, en de mate van ischemie kan onvoldoende kunnen zijn muizenstammen (bijvoorbeeld C57BL / 6). Een minder ernstig ischemisch model mogelijk geen een verlengde tijdvenster om therapeutische effecten te onderzoeken in sterk gevasculariseerde muizen stammen zoals C57BL / 6. Om deze problemen te voorkomen, hebben we achterbeen ischemie by ligeren van het proximale femorale slagader, die een ernstigere ischemie beter tonen de lokale geneesmiddelafgifte effecten gemaakt, maar deze benadering sluit analyse van arteriogenese in de proximale diepe tak collaterale vaten. Aldus worden de therapeutische effecten hoofdzakelijk afkomstig uit de distale ischemische gebied, die overeenkomt met de anatomische locatie (anterolaterale dij) wanneer het geneesmiddel / stof vrijkomt is. Tijdens de operatie is het essentieel niet het kwetsbare femoralis letsel omdat de lokale bloeding kan leiden tot ontsteking en oedeem, die zowel arteriogenese en angiogenese beïnvloeden. Wij raden het gebruik van 8-0 prolene hechtingen aan de femorale slagader afbinden met een passende knoop stropdas te rekken, stam, of een breuk van de slagader te voorkomen. Bovendien Microfil moet onmiddellijk na het mengen van de 3 bestanddelen (verbinding, verdunningsmiddel en de katalysator) aangezien het snel polymeriseert, waarbij technische problemen voor injectie creëert gebruikt (binnen 20 minuten). Zoals eerder stated, Microfil niet altijd succesvol perfuseren de kleinere bloedvaten, maar de praktijk en het gebruik van de juiste technieken kunnen helpen overwinnen van deze beperking.
Het volume pomp vulling moet meer dan 90% van het gemiddelde vulvolume zijn, zo niet, kan extra lucht komen te zitten in de pomp. Aanvullende technische informatie ligt aan www.alzet.com . Bovendien moet de Microfil middel op de gewenste viscositeit voor een specifieke toepassing, zodat de verhouding van oplosmiddel tot verbinding moet worden gewijzigd.
Het achterbeen ischemie model is zeer reproduceerbaar en is van toepassing op PAD 10,11. De stabiele afgifte van therapeutische middelen in dit model moet informatief resultaten te verkrijgen 2. Kortom, de 3D-beeldvormende techniek die we gebruikt om de morfologische structuren te visualiseren is een uitstekend hulpmiddel voor de behandeling van de muis vaatstelsel en voorziet in een krachtig systeem voor studying vasculaire pathologieën.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten. Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Richtlijnen voor de Zorg en gebruik van proefdieren en werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC) aan de Universiteit van Texas Health Science Center in Houston.
Acknowledgments
De auteurs willen graag Keith Michel bedanken van het MD Anderson Small Animal Imaging Facility voor zijn technische bijstand met micro-CT-beeldvorming, Edward TH Yeh, MD, voor chirurgische hulp, en Rebecca Bartow, PhD, voor redactionele ondersteuning. Dit werk werd mede ondersteund door de American Heart Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Surgical tools | Fine Science Tools | Type: Tool | |
| Puritan sterile cotton swabs | Fisher Scientific | 22-029-499 | Type: Tool |
| Betadine (povidone-iodine) | Fisher Scientific | 19-065534 | Type: Reagent |
| 70% Alcohol pads | Fisher Scientific | NC9926371 | Type: Reagent |
| Phosphate buffered saline | Lonza | 17-516F | Type: Reagent |
| 6-0 prolene suture | Cardinal Health | 8709 | Type: Tool |
| 8-0 prolene suture | Cardinal Health | 2775 | Type: Tool |
| Depilatory cream | Nair | Type: Tool | |
| Osmotic pump |  ALZET |
1002 | Type: Tool, 14 day release |
| Vinyl catheter | ALZET |
7760 | Type: Tool |
| Heparinized saline (0.9%) | Baxter | 2B0944 | Type: Reagent |
| Neutral buffered formalin | Richard-Allan Scientific | 5705 | Type: Reagent |
| Microfil (silicone rubber contrast agent) | Flowtech | MV-112 | Type Reagent, Microfil White |
| Cal-Ex II (formic acid solution) | Fisher Scientific | CS511-1D | Type: Reagent |
| Buprenex | CIII | 7571 | Type: Analgesic |
| Bupivicaine | Hospira, Inc. | 381 | Type: Analgesic |
| Equipment | |||
| Dissecting microscope | Carl Zeiss Microimaging | Zeiss Stemi 2000-C | Type:Equipment |
| Laser Doppler perfusion imager | Perimed Inc. | Periscan PIM3 | Type:Equipment |
| Micro-CT imaging system | GE Healthcare | Explore Locus SP | Type:Equipment |
References
- Epstein, S. E., Fuchs, S., Zhou, Y. F., Baffour, R., Kornowski, R. Therapeutic interventions for enhancing collateral development by administration of growth factors: basic principles, early results and potential hazards. Cardiovasc. Res. 49, 532-542 (2001).
- Esaki, J., Marui, A., Tabata, Y., Komeda, M. Controlled release systems of angiogenic growth factors for cardiovascular diseases. Expert Opin. Drug Deliv. 4, 635-649 (2007).
- Bentley, M. D., Ortiz, M. C., Ritman, E. L., Romero, J. C. The use of microcomputed tomography to study microvasculature in small rodents. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 282, 1267-1279 (2002).
- Golomb, B. A., Dang, T. T., Criqui, M. H. Peripheral arterial disease: morbidity and mortality implications. Circulation. 114, 688-699 (2006).
- Hiatt, W. R. Pharmacologic therapy for peripheral arterial disease and claudication. J. Vasc. Surg. 36, 1283-1291 (2002).
- Hirsch, A. T., et al. Peripheral arterial disease detection, awareness, and treatment in primary care. JAMA. 286, 1317-1324 (2001).
- McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nat. Med. 9, 713-725 (2003).
- Hirsch, A. T., et al. ACC/AHA Guidelines for the Management of Patients with Peripheral Arterial Disease (lower extremity, renal, mesenteric, and abdominal aortic): a collaborative report from the American Associations for Vascular Surgery/Society for Vascular Surgery, Society for Cardiovascular Angiography and Interventions, Society for Vascular Medicine and Biology, Society of Interventional Radiology, and the ACC/AHA Task Force on Practice Guidelines (writing committee to develop guidelines for the management of patients with peripheral arterial disease)--summary of recommendations. J. Vasc. Interv. Radiol. 17, 1383-1397 (2006).
- Zagorchev, L., Mulligan-Kehoe, M. J. Molecular imaging of vessels in mouse models of disease. Eur. J. Radiol. 70, 305-311 (2009).
- Losordo, D. W., Dimmeler, S. Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines. Circulation. 109, 2487-2491 (2004).
- Waters, R. E., Terjung, R. L., Peters, K. G., Annex, B. H. Preclinical models of human peripheral arterial occlusive disease: implications for investigation of therapeutic agents. J. Appl. Physiol. 97, 773-780 (2004).
