Summary
भूखे कोशिकाओं (डीपीएस) से डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन बैक्टीरियल तनाव का मुकाबला करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है. इस लेख की शुद्धि की चर्चा
Abstract
ऑक्सिडेटिव तनाव एरोबिक जीवन का एक अनिवार्य प्रतिफल है. आण्विक ऑक्सीजन स्थलीय चयापचय के लिए आवश्यक है, लेकिन यह भी रहने वाले जीवों के भीतर कई हानिकारक प्रतिक्रियाओं में भाग लेता है. जीवन के लिए एक और महत्वपूर्ण यौगिक है जो एरोबिक चयापचय और लोहा, के संयोजन Fenton के रसायन शास्त्र के माध्यम से कण का उत्पादन और सेलुलर घटकों नीचा करने के लिए पर्याप्त है. डीएनए की मरम्मत अब तक तुच्छ से है के रूप में डीएनए गिरावट, यकीनन इंट्रासेल्युलर कण को शामिल सबसे विनाशकारी प्रक्रिया है. इस लेख में प्रस्तुत परख कट्टरपंथी की मध्यस्थता डीएनए की क्षति पर अणुओं और एंजाइमों के प्रभाव को मापने के लिए और कल्पना करने के लिए एक मात्रात्मक तकनीक प्रदान करता है.
डीएनए संरक्षण परख प्रोटीन या रसायनों के सुरक्षात्मक गुणों के इन विट्रो लक्षण वर्णन के लिए एक सरल, त्वरित, और मजबूत उपकरण है. यह एक खतरनाक ऑक्सीडेटिव प्रतिक्रिया करने के लिए डीएनए को प्रकाश में लाने और ब्याज के परिसर के अलग सांद्रता जोड़ने शामिल. यौगिक एकाग्रता के एक समारोह के रूप में डीएनए की क्षति की कमी या वृद्धि तो जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग कल्पना है. इस लेख में हम भूखे कोशिकाओं (डीपीएस) से डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन की सुरक्षात्मक गुणों को मापने के द्वारा डीएनए संरक्षण परख की तकनीक का प्रदर्शन. डीपीएस शक्तिशाली पर्यावरण तनाव से निपटने के लिए 300 से अधिक प्रजातियों के जीवाणु द्वारा उपयोग किया जाता है कि एक मिनी ferritin है. यहाँ हम डीपीएस शुद्धि प्रोटोकॉल और डीपीएस से डीएनए सुरक्षा के मूल्यांकन के लिए अनुकूलित परख की स्थिति प्रस्तुत करते हैं.
Introduction
एरोबिक जीवों लगातार उनके डीएनए के साथ ही अन्य महत्वपूर्ण जैविक अणुओं को नुकसान पहुंचा सकता है कि प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के साथ संघर्ष करना होगा. Oxidative क्षति के जहरीले प्रभाव प्रतिक्रिया करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण भूखे कोशिकाओं (डीपीएस) से डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन है. भूखे ई. से 1992 में इसकी खोज के बाद से कोली संस्कृति 1, डीपीएस बैक्टीरिया और archaebacteria 2 के 300 से अधिक प्रजातियों में पहचान की गई है. स्थिर चरण के दौरान डीपीएस का असीम upregulation यह ई. के सबसे उच्च व्यक्त nucleoid जुड़े प्रोटीन बनाता है भुखमरी की स्थिति 3, 4 के तहत कोलाई. इसके अतिरिक्त, डीपीएस भुखमरी, उच्च लोहे एकाग्रता, यूवी प्रकाश जोखिम, गर्मी झटका, और oxidative तनाव 5, 6 सहित कई विभिन्न तनावों के दौरान बैक्टीरियल व्यवहार्यता और डीएनए अखंडता दोनों की रक्षा करने के लिए दिखाया गया है.
12 मोनोमर्स, w की एक स्थिर होमोसेक्सुअल oligomeric परिसर में संरचनात्मक रूप डीपीएस स्वयं सहयोगियोंhich एक गोलाकार खोखले खोल में इकट्ठा. ~ 4.5 एनएम चौड़ा आंतरिक गुहा छोटे अणुओं 7 के पारित होने की अनुमति देते हैं कि pores के माध्यम से विलायक बाहरी के लिए सुलभ है, और यह एक ऐसी लोहे के रूप में 8 खनिज धातुओं पृथक कर सकते हैं. डीपीएस की सुरक्षात्मक प्रभाव गैर विशिष्ट डीएनए बाध्यकारी 1, ferroxidase गतिविधि, और लोहे भंडारण 8 में शामिल हैं जो अपने कई जैव रासायनिक गतिविधियों, से निकला है.
डीपीएस की लाभकारी जैव रासायनिक गतिविधियों का विस्तृत अध्ययन पहले इसकी शुद्धि की आवश्यकता है. डीपीएस न केवल अन्य प्रोटीन से अलग कर दिया, लेकिन यह भी किसी भी बाध्य डीएनए 7 से किया जाना चाहिए के रूप में डीपीएस शुद्धि, एक व्यापक प्रक्रिया है. हमारे अनुकूलित शोधन प्रक्रिया दो आयन एक्सचेंज कॉलम और एक अमोनियम सल्फेट वर्षा कदम से मिलकर, कई आम तकनीकों का उपयोग करता है. अत्यधिक ध्यान केंद्रित डीपीएस कम नमक की स्थिति में समाधान से बाहर तेज़ कर सकते हैं के रूप में कई बफर एक्सचेंजों की जरूरत है. एक बार जब डीपीएस प्रोटीन शुद्ध कर दिया गया है, यह सीधे अपने ferroxidase गतिविधि 8, डीएनए बाध्यकारी stoichiometry 9, और लोहे के बंधन 10 के तंत्र उपाय है कि assays के लिए लागू किया जा सकता है. शुद्ध डीपीएस भी अन्य संभावित आवेदन किया है. डीपीएस की स्थिर खोखला गोलाकार संरचना प्रोटीन गुहा 11 के अंदर हाइड्रोफोबिक कणों के भंडारण के लिए मचान के रूप में इस्तेमाल किया गया है और एक प्रतिक्रिया कक्ष उपन्यास चुंबकीय नैनोकणों 12 synthesize करने के रूप में भी.
प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों की वजह से नुकसान मध्यस्थता डीपीएस की रक्षात्मक क्षमता स्पष्ट रूप से हो सकता है और सीधे डीएनए संरक्षण परख 13, 14 का उपयोग करते हुए प्रदर्शन कर सकते हैं. लोहे Fenton के रसायन शास्त्र के माध्यम से एच 2 2 हे गिरावट catalyzes जब इन विट्रो प्रक्रिया में इस में, कट्टरपंथी प्रजातियों का उत्पादन कर रहे हैं. ये कण सीधे प्रतिक्रिया में डीएनए वर्तमान को नुकसान पहुंचा है और पूरी तरह से उच्च सांद्रता में यह नीचा कर सकते हैं. दो प्रमुख डीपीएस गतिविधियों सीधे Fent के प्रभाव प्रतिक्रिया कर सकते हैं दोनोंपर की मध्यस्थता कट्टरपंथी उत्पादन. डीपीएस प्रक्रिया में उपलब्ध हाइड्रोजन पेरोक्साइड, उपभोक्ता खनिज के माध्यम से उत्प्रेरक लोहे की एकाग्रता को कम करती है. इसके अतिरिक्त, डीएनए के लिए बाध्य डीपीएस संभवतः कट्टरपंथी नुकसान से शारीरिक रूप से यह ढाल और कम प्रतिक्रियाशील सतह क्षेत्र के साथ एक छोटी मात्रा में संघनित हो सकता है. इन दो गुणों का संयोजन अच्छी तरह से रक्षात्मक डीपीएस गतिविधि को मापने के उद्देश्य के लिए अनुकूल डीएनए संरक्षण परख करता है.
डीएनए संरक्षण परख काफी बहुमुखी है और डीपीएस लक्षण वर्णन से परे आवेदनों की एक किस्म के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. रेडिकल क्षति कोशिकाओं में तनाव का एक आम रूप है, और कई अलग अलग प्रोटीन और रसायनों यह प्रतिक्रिया करने के लिए उपयोग किया जाता है. कट्टरपंथी क्षति के लिए एक मार्कर के रूप में डीएनए अखंडता का उपयोग कर परख के सामान्य सिद्धांत, लगभग किसी भी कट्टरपंथी उत्पादक प्रतिक्रिया या प्रतिकार एजेंट के साथ संयोजन में उपयोग किया जा सकता है. दूसरों के अलावा, परख सफलतापूर्वक विरोधी ऑक्सीडेटिव गुण निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैकश्मीर की हाइड्रॉक्सिल क्षति मध्यस्थता 16 यूरिक एसिड के प्रभाव को चिह्नित करने के लिए, और फर ट्रांसक्रिप्शनल नियामक प्रोटीन 17 के समारोह में नए अंतर्दृष्टि हासिल करने के लिए खाद्य उद्योग के 15, में उपयोग के लिए paniculata निकाल सकते हैं.
प्रकाशित पत्र में परख की कई उपयोगों के बावजूद, हम पहली बार कई शोधकर्ताओं के लिए एक अनावश्यक रूप से थका देने वाली प्रक्रिया के लिए परख की स्थापना करता है, जो कई अनुकूलन और समस्या निवारण चरणों आवश्यक थे. हम इस लेख में मौजूद प्रोटोकॉल प्रवेश के लिए इस बाधा को दूर करना है.
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Protocol
1. डीपीएस अभिव्यक्ति और शोधन
उच्च शुद्धता के प्रोटीन प्राप्त डीएनए संरक्षण परख के लिए एक आवश्यक पहला कदम है. डीपीएस प्रोटीन का शुद्धीकरण 4 से 5 दिनों में किया जा सकता है.
- ई. की एक प्रोटीज की कमी तनाव रूपांतरण डीपीएस प्रोटीन एन्कोडिंग अनुक्रम क्लोन किया गया है जिसमें एक पालतू वेक्टर (जैसे pET17 के रूप में) के साथ कोलाई (जैसे BL21 (DE3) pLysS के रूप में).
- स्ट्रीक उचित एंटीबायोटिक दवाओं (जैसे 1.1 में दिए गए उदाहरणों के लिए एम्पीसिलीन और chloramphenicol के रूप में) युक्त Luria शोरबा (पौंड) अगर प्लेटों पर कोशिकाओं को बाहर बदल दिया. 37 पर रातोंरात प्लेटें सेते डिग्री सेल्सियस
- उचित एंटीबायोटिक दवाओं युक्त लेग माध्यम के 30 मिलीलीटर में थाली से एक ही कॉलोनी टीका लगाना. 37 पर रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस 200-250 rpm पर मिलाते हुए.
- 10 मिलीलीटर रातोंरात संस्कृति से प्रत्येक के साथ उपयुक्त एंटीबायोटिक दवाओं युक्त 2 एक्स 1 एल लेग मध्यम टीका लगाना. आयुध डिपो के 600, मिलाते हुए, जबकि 37 डिग्री सेल्सियस पर आगे बढ़ें
- 15 मिनट के लिए 6000 XG पर centrifugation द्वारा हार्वेस्ट कोशिकाओं. प्रेरित सेल संस्कृति के एल प्रति DEAE बफर (50 मिमी HEPES-KOH, 7.5 पीएच, 100 मिमी NaCl, 0.1 मिमी EDTA) के 7.5 मिलीलीटर में सेल छर्रों Resuspend. नमूने तरल नाइट्रोजन में जमे हुए हैं और अगर वांछित, -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है. प्रक्रिया फिर 4 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में नमूने विगलन द्वारा जारी रखा जा सकता है
- Overexpressed डीपीएस की गिरावट को रोकने के लिए सेल निलंबन के लिए प्रोटीज अवरोधकों (जैसे Calbiochem सेट तृतीय protease inhibitors के रूप में, सेल निलंबन के मिलीलीटर प्रति 0.167 μl में) के मिश्रण जोड़ें.
- एक फ्रांसीसी प्रेस का उपयोग सेल मुक्त निकालने की तैयारी. 20 मिलीलीटर DEAE बफर (एक सतत प्रवाह मॉडल का उपयोग कर रहा है), तो disrup साथ प्रधानमंत्री फ्रेंच प्रेसटी 20 KPSI में दो बार नमूना. अघुलनशील कणों को स्पष्ट करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 35 मिनट के लिए 30,000 XG पर lysate अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला बचाने. अगर वांछित तैरनेवाला तो, तरल नाइट्रोजन का उपयोग जमे हुए और -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
- एक FPLC उपयोग कर DEAE बफर एक साथ एक 30 मिलीलीटर DEAE Sepharose सीएल 6B स्तंभ, संतुलित. पृष्ठभूमि पर 0.2 MPa की एक अधिकतम दबाव के साथ 1-2 मिलीग्राम / मिनट में स्तंभ के माध्यम से बफर चलाएँ. स्तंभ पर सेल मुक्त निकालने लोड, और प्रवाह के माध्यम से आयुध डिपो के 280 संकेत आधारभूत ऊपर बढ़ाने के लिए शुरू होता है एक बार इकट्ठा करने के लिए शुरू करते हैं. DEAE बफर के साथ स्तंभ धो एक लगातार प्रवाह के माध्यम से इकट्ठा आयुध डिपो के 280 मूल्य, आधारभूत के लिए देता है जब तक. प्रवाह के माध्यम से बाध्य डीएनए से मुक्त डीपीएस प्रोटीन का बहुमत है, को शामिल करना चाहिए. 100% बफर बी (50 मिमी HEPES-KOH, पीएच 7.5, 1 एम NaCl, 0.1 मिमी EDTA) के साथ स्तंभ धो लें. इस eluate डीपीएस डीएनए परिसरों के साथ ही अन्य प्रोटीन होता है और खारिज किया जा सकता है.
- विज्ञापन निकालेंअमोनियम सल्फेट वर्षा के माध्यम से प्रोटीन पारंपरिक contaminating. जमा के माध्यम से प्रवाह की मात्रा का निर्धारण करते हैं. धीरे धीरे (10-20 मिनट की अवधि में) 4 में 62% संतृप्ति (समाधान के मिलीग्राम प्रति 390 मिलीग्राम) डिग्री सेल्सियस तक अच्छी तरह से सरगर्मी जबकि सूखी छोटे अनाज अमोनियम सल्फेट जोड़ें. पूरा संतुलन सुनिश्चित करने के लिए अमोनियम सल्फेट के पिछले हिस्से को जोड़ने के बाद एक अतिरिक्त 20-30 मिनट के लिए मिश्रण हिलाओ. Contaminating प्रोटीन समाधान के बाहर वेग होगा जबकि डीपीएस, घुलनशील रहेगा.
- 4 में 30 मिनट के लिए 20,000 XG पर centrifugation द्वारा उपजी प्रोटीन निकालें डिग्री सेल्सियस और सतह पर तैरनेवाला बचाने.
- धीरे धीरे 94% संतृप्ति तक पहुँचने और पूरा संतुलन सुनिश्चित करने के लिए 20-30 मिनट के लिए हलचल करने के लिए सतह पर तैरनेवाला के मिलीलीटर प्रति एक अतिरिक्त 227 मिलीग्राम अमोनियम सल्फेट जोड़ें. डीपीएस इस उच्च नमक एकाग्रता में precipitates और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 20,000 XG पर centrifugation द्वारा एकत्र किया जा सकता है डीपीएस गोली में होगा, सतह पर तैरनेवाला खारिज किया जा सकता है. गोली -80 पर संग्रहीत किया जा सकता डिग्री सेल्सियस अगर देसired.
- मेजबान बफर में डीपी युक्त गोली (50 मिमी HEPES-KOH, 7.5 पीएच, 150 मिमी NaCl, 0.1 मिमी EDTA) Resuspend. 2.5 मिलीलीटर के लिए नमूना मात्रा समायोजित करें.
- बफर विनिमय एक पीडी-10 जेल निस्पंदन स्तंभ का उपयोग करके अमोनियम सल्फेट को हटाने के लिए. 25 मिलीलीटर मेजबान बफर के साथ जेल बिस्तर संतुलित. पीडी-10 स्तंभ के शीर्ष पर डीपीएस नमूना के 2.5 मिलीलीटर लागू करें और यह प्रवाह के माध्यम से त्यागें अंदर सोख करने के लिए अनुमति देते हैं. 3.5 मिलीलीटर मेजबान बफर के साथ eluting द्वारा डीपीएस लीजिए.
- 4 में 10 मिनट के लिए 16,000 XG पर बफर विमर्श नमूना अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस किसी भी अघुलनशील घटकों को हटाने, और 6-10 मिलीलीटर कमजोर पड़ने बफर (50 मिमी HEPES-KOH, पीएच 7.5, 0.1 मिमी EDTA) के साथ इसे कमजोर करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए कि नमक एकाग्रता डीपीएस सपा Sepharose स्तंभ के लिए बाध्य करने के लिए काफी कम है. डीपीएस की विशेष रूप से केंद्रित नमूने के रूप में तरल के बादल छाए हुए हैं इसका सबूत एक कम नमक बफर में कमजोर पड़ने पर कम घुलनशील बन सकता है, लेकिन पूरी तरह से एक छोटे amou के अलावा द्वारा resolubilized किया जा सकता है5 एम NaCl समाधान के NT के (एक अतिरिक्त 10-20 मिमी).
- सपा बफर (50 मिमी HEPES-KOH, 7.5 पीएच, 50 मिमी NaCl, 0.1 मिमी EDTA) के साथ एक 30 मिलीलीटर सपा Sepharose फास्ट फ्लो स्तंभ संतुलित करना. 1.5-2 मिलीग्राम / पृष्ठभूमि पर 0.3 MPa की एक दबाव की सीमा के साथ मिनट में स्तंभ के माध्यम से बफर चलाएँ. स्तंभ पर नमूना लोड. आयुध डिपो के 280 ट्रेस देता है जब तक आधारभूत सपा बफर एक साथ धोएं, और प्रवाह के माध्यम से त्यागें. 2 मिलीलीटर अंशों का संग्रह है, जबकि 0 से 100% बफर बी से एक 150 मिलीलीटर रैखिक ढाल चलाएँ. 10% की भिन्नता संभव है, हालांकि डीपीएस, चारों ओर 50% बी पर एक तेज शिखर में elute जाएगा.
- एक 15% एसडीएस पृष्ठ जेल पर क्षालन भिन्न भागो, और एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग आयुध डिपो 260 / आयुध डिपो के 280 अनुपात को मापने के द्वारा डीएनए संदूषण के लिए जाँच करें. जेल केवल 19 केडीए के चारों ओर एक बैंड दिखाने चाहिए, और आयुध डिपो 260 / आयुध डिपो 280 0.7 के आसपास आम तौर पर है. शुद्ध डीपीएस भिन्न तरणताल. एक साथ एक केन्द्रापसारक फिल्टर यूनिट (जैसे Amicon अल्ट्रा निस्पंदन यूनिट के रूप में) का उपयोग करें10K आणविक वजन कट ऑफ डीपीएस ध्यान केंद्रित करने और एक भंडारण बफर (50 मिमी HEPES-KOH, 7.5 पीएच, 50 मिमी NaCl) में विनिमय करने के लिए. -80 में भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन में अशेष शुद्ध डीपीएस, और फ्रीज डिग्री सेल्सियस
2. डीएनए संरक्षण परख
परख कई समय के प्रति संवेदनशील कदम शामिल है और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए दूसरे के लिए समय दिया जाना चाहिए. कई सामग्री और pipetting कदम शामिल कर रहे हैं, एक pipetting तालिका (1 टेबल देखें) कदम और संस्करणों का ट्रैक रखने की सलाह दी जाती है. परख के लिए आवश्यक कुल समय कोई अधिक से अधिक 3 घंटा है.
- एक airtight शीशी में 30 मिलीलीटर पानी को मापने, समाधान से ऑक्सीजन को दूर करने के लिए 10 मिनट (दो सिरिंज सुई, द्रव में से एक है, यह ऊपर से एक का उपयोग) के लिए 2 एन के साथ पानी फ्लश. एक 2 मिमी शेयर समाधान प्राप्त करने के लिए पानी के लिए 0.0168 ग्राम FeSO 4 • 7 2 हे जोड़ें. शीशी सील और मिश्रण तो, अधिक 5 मिनट के लिए नाइट्रोजन के साथ फ्लश. समाधान होना चाहिएस्पष्ट, पीले रंग के किसी भी संकेत detectable है, तो एक नया लोहा समाधान तैयार करते हैं.
- बर्फ पर रखने और एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटकर द्वारा प्रकाश से परिरक्षित, एच 2 2 हे समाधान (1 मिलीलीटर पानी में 9.2MH 2 2 हे के 10.87 μl) एक 100 मिमी करें. सहज क्षय के कारण तैयारी के बाद के बारे में 1-2 घंटे के लिए ही प्रयोग करें. हाइड्रोजन पेरोक्साइड स्टॉक आंशिक रूप से उचित भंडारण (अंधेरे में, 4 डिग्री सेल्सियस) से ameliorated जा सकता है जो टूटने के लिए इसी तरह का विषय है. आयुध डिपो के 240 मापने के द्वारा शेयर एकाग्रता की नियमित जांच की सिफारिश की है.
- एक कमरे के तापमान नहाने के पानी में तेजी से डीपीएस शुद्ध के एक विभाज्य पिघलना, और बर्फ पर रख. वेग समुच्चय को एक तालिका के शीर्ष picocentrifuge में 4,000 XG पर 10 सेकंड के लिए अपकेंद्रित्र. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (आयुध डिपो 280 = 1.547 100 माइक्रोन मोनोमर डीपीएस की एकाग्रता इंगित करता है) का उपयोग centrifuging के बाद एकाग्रता उपाय.
- 12x प्रतिक्रिया बफर (1 का उपयोग उच्च एकाग्रता स्टॉक से रैखिक डीएनए पतलाΜl / एनजी 100 का एक एकाग्रता के लिए एम MOPS-KOH के पीएच 7.0, 1 एम NaCl). रैखिक डीएनए मात्रा का ठहराव आसान बनाने के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन प्लाज्मिड डीएनए अच्छी तरह के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
- एक पीसीआर ट्यूब में डीएनए बफर मिश्रण के पिपेट 1 μl. अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा (शून्य से एसडीएस) 12 μl होगा कि प्रतिक्रिया में पर्याप्त पानी जोड़ें. यह राशि pipetting तालिका का उपयोग अग्रिम में गणना की जानी चाहिए. 3 सुक्ष्ममापी के अंतिम dodecamer एकाग्रता के लिए डीपीएस जोड़ें. डीपीएस डीएनए के लिए बाध्य करने के लिए अनुमति देने के लिए कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं.
- वांछित एकाग्रता तक पहुँचने के लिए पर्याप्त 2 मिमी FeSO 4 समाधान जोड़ें. एक ठेठ प्रयोग 0 से 1 मिमी FeSO 4 से सांद्रता की एक सीमा का उपयोग करता है. उच्च सांद्रता अधिक व्यापक डीएनए गिरावट का कारण होगा, लेकिन यह भी फेरिक प्रतिक्रिया मिश्रण में precipitates के गठन के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. जल्दी 100 मिमी एच 2 2 हे समाधान (10 मिमी अंतिम एकाग्रता) की 1 μl जोड़ने, और Fenton अनुमति देने के लिए 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेतेजगह लेने के लिए की मध्यस्थता गिरावट प्रतिक्रिया.
- 20% एसडीएस (सोडियम dodecyl सल्फेट) के 0.8 μl जोड़ें. मिक्स और डीपीएस डीएनए परिसरों को बाधित करने के लिए 5 मिनट के लिए 85 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. एसडीएस डीपीएस डीएनए जटिल destabilizes और मात्रा का ठहराव के आराम को बेहतर बनाता है जो डीएनए के लिए अवांछित जेल पारियों से बचाता है. एक वैकल्पिक कदम गैर विषैले उत्पादों में catalytically अपमानजनक हाइड्रोजन पेरोक्साइड द्वारा प्रतिक्रिया को रोकने के लिए है. इस प्रोटोकॉल में वर्णित शर्तों के लिए, इस कदम डीएनए गिरावट की एक विस्तृत रेंज को प्राप्त करने की जरूरत नहीं है.
- डाई लोड हो रहा है जोड़ने के लिए, 1 मिनट के लिए बर्फ पर सेते हैं, और एक agarose जेल पर लोड. जेल भागो, और ethidium ब्रोमाइड का उपयोग डीएनए के लिए दाग. जेल जेल में ethidium ब्रोमाइड वितरण के साथ हस्तक्षेप से एसडीएस को रोकने के लिए, के बाद वैद्युतकणसंचलन दाग बजाय वैद्युतकणसंचलन से पहले होना चाहिए.
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Representative Results
यहाँ वर्णित डीपीएस के शुद्धिकरण की प्रक्रिया बहुत प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है. वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार डीपीएस शुद्धि, ई. के 2 एल का उपयोग कर एक प्रारंभिक बिंदु के रूप कोलाई संस्कृति, आम तौर पर 5 से 12 माइक्रोन के बीच सांद्रता में 12 डीपी युक्त प्रोटीन के 2.5 मिलीलीटर निकलेगा. लंबे समय तक प्रेरण बार (4 घंटे) इस परिवर्तनशीलता को कम करने लगते हैं. प्रोटीन शुद्धता के रूप में एसडीएस पृष्ठ जैल (चित्रा 1) इसका सबूत है, 99% से ऊपर लगातार है. डीएनए संदूषण के स्तर के रूप में दोनों के डीएनए और आयुध डिपो 260 / आयुध डिपो के 280 अनुपात के लिए दाग agarose जैल इसका सबूत है, लगातार नगण्य है. यह मान भिन्न हो सकते हैं, लेकिन मूल्यों डीएनए संदूषण का स्तर अच्छी तरह से 5% के नीचे रहना यह दर्शाता है कि 0.9 से ऊपर कभी नहीं रहे हैं.
डीएनए संरक्षण परख के परिणामों के reproducibility निष्पादन पर निर्भर करेगा. सभी सामग्री की सांद्रता ठीक मापा रहे हैं (विशेष रूप से प्रोटीन एकाग्रता के बाद centrनमूने के लिए ifugation), और ऊष्मायन बार लगातार कर रहे हैं, परिणाम लगातार चित्रा 2 में दिखाया गया है उन लोगों के समान होगा. शर्तों कम आदर्श हैं, तो बढ़ती लोहा एकाग्रता के साथ डीएनए गिरावट में एक समग्र वृद्धि अभी भी स्पष्ट हो जाएगा, हालांकि assays के बीच मामूली परिवर्तनशीलता, दिखाई जाएगी. डीएनए संरक्षण परख के माध्यम से प्राप्त परिणामों ऐसे ImageLab रूप इमेज प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर के उपयोग के माध्यम से मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. चित्रा 3 इस मात्रा का ठहराव के परिणाम से पता चलता है, तीन assays के अधिक औसत. त्रुटि सलाखों प्राप्त reproducibility के समग्र उच्च स्तर का संकेत मिलता है.
चित्रा 1. . एसडीएस पृष्ठ (1) सेल मुक्त निकालने से विश्लेषण डीपीएस शुद्धि के मध्यवर्ती कदम,, (2) के माध्यम से प्रवाह DEAE Sepharose स्तंभ की; DEAE स्तंभ की (3) eluate, (4) 60% अमोनियम डो सुल की सतह पर तैरनेवाला भाग्य वर्षा, (5) पीडी-10 स्तंभ द्वारा 90% अमोनियम सल्फेट वर्षा और बफर विनिमय निम्नलिखित डीपीएस नमूना, (6) सपा Sepharose स्तंभ के बाद शुद्ध डीपीएस भिन्न जमा, (7) प्रोटीन आणविक वजन मार्करों. छवि मात्रा का ठहराव सॉफ्टवेयर (ImageQuant टीएल) द्वारा निर्धारित के रूप में प्रत्येक लेन के तल पर प्रतिशत डीपीएस पवित्रता निरूपित.
चित्रा 2. Oxidative गिरावट से डीएनए के डीपीएस की मध्यस्थता संरक्षण. सभी गलियों रेखीय 5 केबी डीएनए के 100 एनजी होते हैं. (1) डीएनए केवल, (2) डीएनए 1 मिमी से एच 2 ओ 2, 1 मिमी एच 2 2 हे और 166 माइक्रोन FeSO 4 के साथ (3) डीएनए, (4) से (8) डीएनए 3 माइक्रोन डीपीएस 12, 1 के साथ मिमी एच 2 2 हे, और सही करने के लिए बाएँ से बढ़ रही लोहे की एकाग्रता (0 माइक्रोन, 166 माइक्रोन, 333 माइक्रोन, 666 माइक्रोन और 1000 माइक्रोन).
चित्रा 3. लोहे की एकाग्रता के एक समारोह के रूप में undamaged डीएनए के अंश का डीएनए संरक्षण परख की तीन पुनरावृत्ति पर औसतन. त्रुटि सलाखों मतलब की मानक विचलन निरूपित. स्थितियां: 5 केबी रैखिक डीएनए के 100 एनजी, 1 मिमी 2 एच ओ 2, 3 माइक्रोन डीपीएस 1 एक्स प्रतिक्रिया बफर (83 मिमी HEPES-KOH 7.0 पीएच, 83 मिमी NaCl) में 12. प्रोटीन नियंत्रण नहीं 0 माइक्रोन से एक डीपीएस 12 एकाग्रता के साथ छोड़कर ही स्थितियों का उपयोग किया गया था.
तालिका 1. एक बुनियादी pipetting तालिका का उदाहरण है. बाएं से दाएं अनुक्रमिक क्रम में, एक समय में प्रत्येक स्तंभ के लिए pipetting प्रदर्शन करना. प्रत्येक pipetting कदम के बाद ऊष्मायन समय संकेत दिया हैअंतिम पंक्ति में. सामग्री की पूलिंग डीएनए और प्रोटीन दोनों अवयवों से युक्त एक आम ट्यूब से pipetted किया जाना चाहिए कि यह दर्शाता है, कॉलम 3 और 4 में कोशिकाओं के बीच धन चिह्न द्वारा इंगित किया जाता है.
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Discussion
इस अनुच्छेद में वर्णित के रूप में डीपीएस के शुद्धिकरण की प्रक्रिया बहुत मजबूत है. पवित्रता लगातार (> 99%) उच्च किया गया है और न कोई अन्य प्रोटीन दिखाई बैंड के रूप में एसडीएस पृष्ठ जैल पर दिखाई देते हैं. डीपीएस की उच्च सांद्रता के साथ incubated जब आंशिक डीएनए गिरावट इसका सबूत के रूप में इस के बावजूद, शुद्ध डीपीएस के कुछ बैचों, nuclease गतिविधि दिखाई देते हैं. यह हम शोधन के माध्यम से दूर करने में असमर्थ थे कि कम एकाग्रता में अत्यधिक सक्रिय DNases की उपस्थिति का संकेत हो सकता है. हालांकि, इस डीएनए गिरावट ही आम तौर पर इन विट्रो assays में के लिए इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं कि सांद्रता में मनाया जाता है, तो यह आमतौर पर एक समस्या मौजूद नहीं है.
इस अनुच्छेद के रूप में प्रस्तुत डीपीएस शुद्धि प्रोटोकॉल कई मजबूत अंक हैं. प्रोटीन आत्मीयता टैग होना जरूरी नहीं है, समारोह के साथ हस्तक्षेप की कोई संभावना मौजूद है. शुद्ध प्रोटीन डीएनए से मुक्त है, इसलिए इन विट्रो assays में डीएनए बाध्यकारी गुण नहीं भुगतना होगा को शामिलसंभव संदूषण कलाकृतियों से. अन्त में, शुद्ध डीपीएस लोहे की मात्रा का ठहराव 18, 19 के ferene विधि के माध्यम से प्रोटीन गुहा के अंदर संग्रहित लगभग कोई लोहा (<1 लोहे परमाणुओं / डीपीएस dodecamer), शामिल हैं. इस सुविधा के लिए यह संभव ठीक डीपीएस गुहा के अंदर भरी हुई है क्या नियंत्रित करने के लिए या हस्तक्षेप के बारे में चिंता किए बिना एक सूक्ष्म रिएक्टर के रूप में जटिल खोखला डीपीएस उपयोग करने के लिए बनाता है.
डीएनए संरक्षण परख इन विट्रो में डीपीएस के चिकित्सीय गुणों को चिह्नित करने के लिए एक त्वरित और विश्वसनीय तरीका है. तकनीक शारीरिक सेलुलर व्यवहार्यता पर डीपीएस अभिव्यक्ति की सुरक्षात्मक प्रभाव को प्रदर्शित करने के लिए एक सरल तरीका प्रदान करता है. परख oxidative क्षति प्रतिक्रिया है कि डीपीएस या अन्य एंजाइमों द्वारा प्रदान की डीएनए संरक्षण की डिग्री के बारे में मात्रात्मक डेटा प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और कई कदम अपने reproducibility में सुधार करने के लिए लिया जा सकता है.
अभिकर्मक तैयारी सही concentratio के रूप में, एक महत्वपूर्ण चरण हैएन मापन के लिए आवश्यक हैं. यह डीएनए एकाग्रता माप के बीच उतार चढ़ाव नहीं है यह सुनिश्चित करने के लिए सभी प्रयोगों के लिए एक ही डीएनए स्टॉक का उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा है. हमारे मामले में हम एक Maxiprep किट (Promega) का उपयोग प्लास्मिड डीएनए के कई मिलीग्राम निकाला और एक एकल कटर प्रतिबंध एंजाइम का उपयोग कर रैखिक टुकड़ों में यह पच. इसके अतिरिक्त, विगलन के बाद डीपीएस प्रोटीन refreeze नहीं है, ठंड और गतिविधि कम हो सकती है विगलन दोहराया के रूप में हमेशा एक ताजा विभाज्य के साथ काम करते हैं. प्रयोग प्रोटीन की अत्यधिक बर्बादी रोकने जाएगा की आवश्यकता के रूप में डीपीएस की तैयारी लगभग उसी मात्रा में शुद्धि के समय पर aliquots. मापने एकाग्रता महत्वपूर्ण है इससे पहले कि जल्दी से प्रोटीन centrifuging, के रूप में अन्यथा प्रोटीन समुच्चय सक्रिय प्रोटीन एकाग्रता की overestimations पैदा होती हैं. अन्त में, अभिकर्मकों एच 2 2 हे और FeSO साथ एच 2 2 हे, डीएनए के साथ, अकेले उम्मीद (जैसे डीएनए के रूप में डीएनए काम कर रहे हैं पर नजर रखने के लिए कई नमूने लगा डीएनए संरक्षण परख ऊष्मायन समय के लिए काफी संवेदनशील है, हर कदम सही रूप में संभव के रूप में समय पर किया जाना चाहिए. कई प्रयोग कर रही है, यह ऊष्मायन अवधि के नमूनों के बीच लगातार रहने को सुनिश्चित करने के लिए नमूने डगमगाते की सलाह दी जाती है. कई प्रयोगों से अधिक औसत असंगत ऊष्मायन समय के माध्यम से पेश किसी भी त्रुटि को हटाने में मदद करता है, लेकिन कुल मिलाकर त्रुटि सटीक समय तक कम किया जा सकता है. कई सुझाव डीपीएस के अलावा अन्य प्रोटीन (या रसायन) के लिए डीएनए संरक्षण परख के अनुकूलन के लिए शोधकर्ताओं ने सुझाव दिया जा सकता है. अनुकूलन करने के लिए सबसे महत्वपूर्ण पहलू डीएनए मात्रा, कट्टरपंथी उत्पादन दर, और जांच की जा रही है कि सुरक्षात्मक प्रभाव की भयावहता के बीच अनुपात है. एक इष्टतम अनुपात पाया गया था, जब तक डीपीएस का उपयोग कर कई assays के डीएनए की कुल विनाश या एंजाइम का कोई स्पष्ट सुरक्षात्मक प्रभाव या तो पता चला. पे करने के हमारे अनुभव में, एक कारगर तरीकाइस अनुकूलन rform प्रोटीन का एक यथोचित उच्च एकाग्रता का चयन करने के लिए है, oversaturating इसके बिना जेल पर स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा होगा कि एक डीएनए राशि का चयन, और उपलब्ध डीएनए के सभी नष्ट हो जाता है, जिस पर 2 एच 2 हे और FeSO 4 की विशिष्ट सांद्रता निर्धारित करते हैं. इसके बाद, शून्य और निर्धारित मूल्य के बीच FeSO 4 सांद्रता की एक सीमा का उपयोग कर मापन की एक श्रृंखला डीएनए संरक्षण की एक गतिशील रेंज खोलेगा.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हम Michela डे मार्टिनो, विल्फ्रेड आर हेगन, और उपयोगी विचार विमर्श के लिए Kourosh Honarmand Ebrahimi के लिए आभारी हैं. इस काम डेल्फ़्ट प्रौद्योगिकी विश्वविद्यालय से धन को शुरू से समर्थन किया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BL21(DE3)pLysS competent cells | Promega | L1195 | |
| pET-17b DNA | EMD-Millipore | 69663-3 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| HEPES | BDH | 441476L | |
| Potassium hydroxide | Merck | 105033 | |
| Sodium chloride | VWR | 443824T | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Set III | EMD-Millipore | 539134 | |
| DEAE-Sepharose | Sigma-Aldrich | DFF100 | |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare LS | 17-0851-01 | |
| SP-Sepharose | Sigma-Aldrich | S1799 | |
| Amicon Ultra Centr. Filter (10K MWCO) | Millipore | UFC901024 | |
| Ferrous Sulphate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8048 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| MOPS | Calbiochem | 475898 | |
| SDS solution | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Static incubator | Hettich | INE500 | |
| Shaking Incubator | New Brunswick Sc. | Inova 44 | |
| Cooled centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-E | |
| Table-top centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Cell disrupter | Constant Systems Ltd. | TS2/40/AA/AA | |
| FPLC Purifier | General Electric | AKTA | |
| Airtight vials | Cole-Parmer | EW-08918-85 | |
| Syringe needles | BD | 305128 | |
| Pipettes | Eppendorf | Z683779-1EA, Z683795-1EA |
References
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