Summary
Den DNA-bindande protein från svultna celler (DPS) spelar en avgörande roll i kampen mot bakteriell stress. Denna artikel diskuterar rening av
Abstract
Oxidativ stress är en oundviklig biprodukt av aerob liv. Molekylärt syre är avgörande för marksänd metabolism, men det tar också del i många skadliga reaktioner i levande organismer. Kombinationen av aerob metabolism och järn, vilket är en annan viktig förening för livet, är tillräckligt för att producera radikaler genom Fenton kemi och försämra cellulära komponenter. DNA nedbrytning är utan tvekan den mest skadliga process där intracellulära radikaler, såsom DNA-reparation är långt ifrån trivialt. Analysen som presenteras i denna artikel erbjuder en kvantitativ teknik för att mäta och visualisera effekten av molekyler och enzymer på radikal-medierad DNA-skada.
Den DNA-skydd analysen är en enkel, snabb och robust verktyg för in vitro-karakterisering av de skyddande egenskaperna hos proteiner eller kemikalier. Det handlar om att exponera DNA till en skadlig oxidativ reaktion och tillsats av varierande koncentrationer av föreningen av intresse. Minskningen eller ökning av DNA-skada som en funktion av föreningens koncentration därefter visualiseras med gelelektrofores. I denna artikel kommer vi demonstrera tekniken för DNA-skydd analysen genom att mäta de skyddande egenskaperna hos det DNA-bindande protein från svultna celler (DPS). Dps är en mini-ferritin som används av mer än 300 bakteriearter att kraftfullt bekämpa miljöpåverkande faktorer. Här presenterar vi de Dps reningsprotokollet och de optimerade betingelser analys för att utvärdera DNA skydd av UP.
Introduction
Aeroba organismer måste ständigt brottas med reaktiva syreradikaler som kan skada deras DNA samt andra viktiga biologiska makromolekyler. Ett kraftfullt verktyg för att motverka de toxiska effekterna av oxidativ skada är den DNA-bindande protein från svultna celler (DPS). Sedan upptäckten 1992 från svultna E. coli kultur 1, har Dps identifierats i mer än 300 arter av bakterier och Archaebacteria 2. Massiva uppreglering av Dps under stationär fas gör det mest kraftigt uttryckt nucleoid-associerat protein av E. coli under svält förhållanden 3, 4. Dessutom har Dps visats bevara både bakterie livskraft och DNA integritet under många olika påfrestningar, bland annat svält, höga järn koncentration, UV-ljus exponering, värmechock, och oxidativ stress 5, 6.
Strukturellt Dps själv-associerar till en stabil homo-oligomera komplex av 12 monomerer, which montera in ett sfäriskt ihåligt skal. Den ~ 4,5 nm-omfattande inre hålighet är tillgänglig till det yttre lösningsmedlet via porer som tillåter passage av små molekyler 7, och det kan sekvestrera mineraliserade metaller såsom järn 8. Den skyddande effekten av Dps härrör från dess flera biokemiska aktiviteter, som inkluderar icke-specifik DNA-bindning 1, ferroxidase aktivitet, och järn lagring 8.
Detaljerad studie av de positiva biokemiska aktiviteter Dps kräver först dess rening. Dps rening är en utarbetad förfarandet, såsom Dps måste separeras inte bara från andra proteiner, men också från alla bundna DNA 7. Vår optimerade reningsprocess använder många vanliga tekniker, som består av två jonbyteskolonner och en ammoniumsulfatutfällning steg. Flera buffert utbyte behövs, så högkoncentrerade Dps kan fällas ut ur lösningen i låga salthalt. När Dps protein har renats, Kan den tillämpas på analyser som direkt mäter sin ferroxidase aktivitet 8, DNA-bindande stökiometri 9, och mekanismer för järnbindande 10. Renade Dps har även andra potentiella tillämpningar. Den stabila ihåliga sfäriska struktur av UP har använts som byggnadsställningar för lagring av hydrofoba partiklar inuti proteinet hålrummet 11 och även som en reaktionskammare för att syntetisera nya magnetiska nanopartiklar 12.
Den skyddande förmåga Dps att medla skador på grund av reaktiva syreradikaler kan vara tydligt och direkt påvisas med hjälp av analysen DNA skydd 13, 14. I detta in vitro-procedur, är radikala arter bildas när järn katalyserar H 2 O 2 nedbrytning genom Fenton kemi. Dessa radikaler skada direkt DNA närvarande i reaktionen och kan helt bryta ned den i höga koncentrationer. Två viktiga Dps aktiviteter kan både direkt motverka effekterna av Fenton-medierad radikalproduktion. Dps sänker koncentrationen av katalytiskt järn genom mineralisering, förbrukar den tillgängliga väteperoxiden i processen. Dessutom kan Dps bindning till DNA skydda potentiellt den fysiskt från radikaler och kondenserar den till en mindre volym med mindre reaktiv yta. Kombinationen av dessa två egenskaper gör analysen DNA skyddet väl lämpad för att mäta skyddande Dps aktivitet.
Den DNA-skydd analysen är ganska mångsidig och kan användas för en mängd olika applikationer utöver Dps karakterisering. Radikaler är en vanlig form av stress i celler, och många olika proteiner och kemikalier används för att motverka det. Den allmänna principen för analysen, använda DNA integritet som en markör för radikal skada, kan användas i kombination med nästan alla radikal-producerande reaktion eller motverka agent. Bl.a. har analysen använts framgångsrikt för att bestämma anti-oxidativa egenskaperav K. paniculata extrakt för användning inom livsmedelsindustrin 15, för att karakterisera effekterna av urinsyra på hydroxyl skador medling 16, och för att få nya insikter i funktionen av päls transkriptionsregulator proteiner 17.
Trots de många användningsområden för analysen i publicerade artiklar, fann vi att många optimering och steg felsökning krävdes, vilket gör installationen analysen för första gången en onödigt arbetsam process för många forskare. Protokollet vi presenterar i denna artikel syftar till att undanröja detta hinder för inträde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Ett. Dps Uttryck och rening
Skaffa protein av hög renhet är ett viktigt första steg för DNA-skydd analysen. Rening av Dps protein kan utföras i 4 till 5 dagar.
- Förvandla en proteas-brist stam av E. coli (t.ex. BL21 (DE3) pLysS) med ett husdjur vektor (t.ex. pET17) i vilken Dps protein-kodande sekvensen har klonats.
- Streak den transformerade cellerna ut på Luria-buljong (LB)-agarplattor innehållande lämpliga antibiotika (såsom ampicillin och kloramfenikol för de exempel som anges i 1.1). Inkubera plattorna över natten vid 37 ° C.
- Inokulera en enda koloni från plattan i 30 ml LB-medium innehållande lämpliga antibiotika. Inkubera över natten vid 37 ° C under skakning vid 200-250 rpm.
- Inokulera 2 x 1 medelstor L LB innehållande lämpliga antibiotika med 10 ml vardera av natten kultur. Odla vid 37 ° C, under omskakning till OD 600
- Harvest cellerna genom centrifugering vid 6000 x g under 15 min. Resuspendera cellen pellets i 7,5 ml DEAE buffert A (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA) per liter inducerad cellkultur. Prover kan frysas i flytande kväve och lagrades vid -80 ° C, om så önskas. Förfarandet kan därefter fortsätta genom att tina proven i ett vattenbad vid 4 ° C.
- Lägg en blandning av proteashämmare (t.ex. Calbiochem set III proteashämmare, vid 0,167 l per ml cell suspension) till cellsuspensionen för att förhindra nedbrytning av överuttryckta Dps.
- Förbered cellfritt extrakt med användning av en fransk press. Prime den franska pressen med 20 ml DEAE buffert A (om du använder ett kontinuerligt flöde modell), då störningart provet två gånger vid 20 kpsi. Centrifugera lysatet vid 30000 xg under 35 min vid 4 ° C för att klargöra olösliga partiklar, och spara supernatanten. Supernatanten kan sedan frysas med hjälp av flytande kväve och lagrades vid -80 ° C, om så önskas.
- Jämvikta en 30 ml DEAE Sepharose CL-6B-kolonn med DEAE Buffert A, med användning av en FPLC. Kör buffert genom kolonnen vid 1-2 ml / min med ett maximalt tryck på 0,2 MPa jämfört med bakgrunden. Fyll på cellfria extraktet på kolonnen, och börja samla genomströmning när OD 280-signalen börjar öka över baslinjen. Tvätta kolonnen med DEAE Buffert A tills OD 280 värdet återgår till baslinjen, medan kontinuerligt samla genomströmning. Genomflödet bör innehålla huvuddelen av Dps proteinet, fritt från bundet DNA. Tvätta kolonnen med 100% Buffert B (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 1 M NaCl, 0,1 mM EDTA). Detta eluat innehåller Dps-DNA-komplex såväl som andra proteiner och kan kasseras.
- Ta bort annonstionell förorenande proteiner genom ammoniumsulfatutfällning. Bestäm volymen av poolade genomströmning. Långsamt (under en period av 10 till 20 min) tillsätt torr small-grain ammoniumsulfat till 62% mättnad (390 mg per ml lösning) vid 4 ° C under omröring väl. Omrör blandningen under ytterligare 20 till 30 min efter tillsats av den sista delen av ammoniumsulfat för att säkerställa fullständig jämvikt. Dps förblir lösligt, medan kontaminerande proteiner fälls ut ur lösningen.
- Avlägsna utfällda proteiner genom centrifugering vid 20.000 x g under 30 min vid 4 ° C och spara supernatanten.
- Tillsätt långsamt ytterligare 227 mg ammoniumsulfat per ml överstående att nå 94% mättnad och rör om i 20-30 minuter för att säkerställa fullständig jämvikt. Dps fällningar vid denna höga saltkoncentration och kan uppsamlas genom centrifugering vid 20.000 x g under 30 min vid 4 ° C. Dps kommer att vara i pelleten, supernatanten kan kasseras. Pelleten kan förvaras vid -80 ° C om desired.
- Resuspendera Dps-innehållande pelleten i resuspensionsbuffert (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA). Justera prowolymen till 2,5 ml.
- Buffert utbyte för avlägsnande av ammoniumsulfat genom att använda en PD-10 gelfiltreringskolonn. Jämvikta gelbädden med 25 ml resuspensionsbuffert. Applicera 2,5 ml Dps prov till toppen av PD-10-kolonn och låt den suga in Kassera genomströmning. Samla Dps genom eluering med 3,5 ml resuspensionsbuffert.
- Centrifugera buffertbyttes provet vid 16.000 xg under 10 minuter vid 4 ° C för att avlägsna eventuella olösliga komponenter, och späd den med 6-10 ml spädningsbuffert (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 0,1 mM EDTA) för att säkerställa att saltkoncentrationen är låg nog för Dps att binda till SP Sepharose-kolonn. Särskilt koncentrerade prover av UP kan bli mindre lösliga vid spädning in i en lägre saltbuffert, vilket framgår av grumlighet av vätska, men kan vara helt resolubiliseras genom tillsats av en liten Amount av 5 M NaCl-lösning (en extra 10-20 mM).
- Jämvikta en 30 ml SP Sepharose Fast Flow-kolonn med SP Buffert A (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA). Kör buffert genom kolonnen vid 1,5 till 2 ml / min med ett tryck på 0,3 MPa jämfört med bakgrunden. Ladda provet på kolonnen. Tvätta med SP buffert A tills OD 280 spår återgår till baslinjen och kasta genomströmning. Kör en 150 ml linjär gradient från 0 till 100% buffert B, under uppsamling av 2 ml fraktioner. Dps kommer att elueras i en skarp topp vid omkring 50% B, även om variation genom 10% är möjlig.
- Kör elueringsfraktionerna på en 15% SDS-PAGE-gel, och kontrollera om DNA-kontaminering genom mätning av OD 260 / OD 280-förhållande med användning av en spektrofotometer. Gelen ska endast visa ett band runt 19 kDa, och OD 260 / OD 280 är typiskt omkring 0,7. Pool Den renaste Dps fraktionerna. Använd ett centrifugal filterenhet (såsom Amicon Ultra Filtration Unit) med en10K molekylvikt cut-off för att koncentrera DPS och byta den till en lagringsbuffert (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM NaCl). Alikvotera renade DPS och frysa i flytande kväve för lagring vid -80 ° C.
2. DNA Protection Assay
Analysen involverar flera tidskänsliga steg och bör tidsmässigt för att den andra för att erhålla reproducerbara resultat. Många ingredienser och pipetteringssteg är inblandade, så en pipettering tabell (se tabell 1) är tillrådligt att hålla koll på stegen och volymer. Den totala tiden som krävs för analysen är inte mer än 3 timmar.
- Mät 30 ml vatten i en lufttät ampull; spola vattnet med N2 under 10 min (med hjälp av två kanyler, en i vätskan, en ovanför den) för att avlägsna syre från lösningen. Lägg 0,0168 g FeSO 4 • 7H 2 O till vattnet för erhållande av en 2 mM stamlösning. Förslut flaskan och spola med kväve under 5 min mer, blanda. Lösningen måste varaklart, om någon antydan till gult är detekterbar, förbereda en ny järn-lösning.
- Gör en 100 mM H 2 O 2-lösning (10,87 pl 9.2MH 2 O 2 i 1 ml vatten), håll på is och avskärmas från ljus genom att linda in i aluminiumfolie. Använd endast för ca 1-2 timmar efter beredning på grund av spontana sönderfall. Den väteperoxid lager är likaledes föremål för nedbrytning, vilket kan delvis lindras genom rätt förvaring (i mörker vid 4 ° C). Regelbundna kontroller av beståndet koncentrationen genom att mäta OD 240 rekommenderas.
- Tina en alikvot av renad Dps snabbt i ett rumstempererat vattenbad, och hålla på is. Centrifugera i 10 sekunder vid 4000 xg i en bordsskiva picocentrifuge att fälla aggregat. Mät koncentration efter centrifugering med användning av en spektrofotometer (OD 280 = 1,547 indikerar en koncentration av 100 | iM monomer DPS).
- Späd linjärt DNA från högkoncentrerad lager med 12x reaktion buffert (1M MOPS-KOH pH 7,0, 1 M NaCl) till en koncentration av 100 ng / ul. Linjärt DNA används för att göra kvantifiering lättare, men plasmid-DNA kan användas också.
- Pipettera 1 ìl av DNA-buffert blandningen i en PCR-rör. Lägg tillräckligt med vatten in i reaktionen så att den slutliga reaktionsvolymen (minus SDS) kommer att vara 12 | il. Detta belopp bör beräknas i förväg med hjälp av pipettering tabellen. Lägg Dps till en slutlig dodecamer koncentration av 3 uM. Inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur för att tillåta för Dps att binda till DNA.
- Lägg tillräckligt med 2 mM FeSO 4 lösning för att nå den önskade koncentrationen. Ett typiskt experiment använder en rad koncentrationer från 0 till 1 mM FeSO 4. Högre koncentrationer kommer att orsaka mer omfattande DNA-nedbrytning men kan också leda till bildning av ferri fällningar i reaktionsblandningen. Tillsätt snabbt 1 ul av 100 mM H 2 O 2-lösning (till 10 mM slutlig koncentration), och inkubera vid rumstemperatur under 5 min för att göra det möjligt för Fenton-Medierad nedbrytning reaktion skall äga rum.
- Tillsätt 0,8 | il av 20% SDS (natriumdodecylsulfat). Blanda och inkubera vid 85 ° C i 5 minuter för att störa Dps-DNA-komplex. Den SDS destabiliserar Dps-DNA komplex och förhindrar oönskade gel skift för DNA, vilket förbättrar enkel kvantifiering. Ett valfritt steg är att stoppa reaktionen genom att man katalytiskt försämra väteperoxiden till icke-toxiska produkter. För de förhållanden som beskrivs i detta protokoll, är detta steg behövs inte för att få ett brett spektrum av DNA-nedbrytning.
- Inkubera på is under 1 min, tillsätt laddningsfärg, och ladda på en agarosgel. Kör gelén och färgning för DNA med användning av etidiumbromid. Gelén bör vara färgas efter elektrofores snarare än före elektrofores, för att förhindra SDS från att störa etidiumbromid fördelning i gelén.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Reningsprocessen för Dps beskrivs här är mycket reproducerbar. Dps rening enligt det beskrivna protokollet, med användning av 2 L av E. coli kultur som utgångspunkt, kommer typiskt att ge 2,5 ml av protein innehållande Dps 12 vid koncentrationer mellan 5 och 12 uM. Längre induktion gånger (4 tim) verkar minska denna variation. Proteinrenhet är genomgående över 99%, vilket framgår av SDS-PAGE-geler (fig 1). Nivån på DNA-kontaminering är genomgående försumbar, vilket framgår både av agarosgeler infärgade för DNA och OD 260 / OD 280-förhållandet. Detta värde kan variera, men värdena är aldrig över 0,9, vilket indikerar att DNA kontamineringsgrader kvar långt under 5%.
Reproducerbarhet resultaten av DNA-analysen, beror i hög grad på utförande. Om halterna av alla ingredienser mäts exakt (särskilt protein koncentrationen efter centrifugation), och inkubationen gånger för prover är konsekventa, kommer resultaten likna genomgående är de som visas i figur 2. Om förhållandena är mindre perfekt, kommer mindre variabilitet mellan analyser vara synliga, även om en total ökning av DNA-nedbrytning med ökande järn koncentration kommer fortfarande att vara uppenbara. De resultat som erhållits genom DNA-skydd analysen kan kvantifieras med hjälp av bildbehandlingsprogram som ImageLab. Figur 3 visar resultatet av denna kvantifiering, medelvärde över tre analyser. Felet Staplarna anger den allmänt höga reproducerbarhet uppnås.
Figur 1. Mellanliggande steg av UP rening, analyserat med SDS-PAGE (1) cellfritt extrakt,. (2) genomströmning av DEAE Sepharose-kolonn, (3) eluatet från DEAE-kolonn, (4) supernatanten från 60% ammonium sul ödet nederbörd, (5) Dps prov efter 90% ammoniumsulfatutfällning och buffertutbyte genom PD-10 kolonn; (6) poolad rena Dps fraktionerna efter SP Sepharose-kolonn, (7) protein molekylviktsmarkörer. De procentsatser på undersidan av varje bana betecknar Dps renhet bestämd med bild kvantifiering programvara (ImageQuant TL).
Figur 2. DPS-medierad skydda DNA från oxidativ nedbrytning. Samtliga banor innehåller 100 ng linjär 5 kb DNA. (1) DNA enbart, (2) DNA med 1 mM H 2 O 2, (3) DNA med 1 mM H 2 O 2 och 166 pM FeSO 4, (4) till (8) DNA med tre iM Dps 12, en mM H 2 O 2, och ökande järnkoncentrationen (0 pM, 166 pM, 333 pM, 666 pM och 1000 pM) från vänster till höger.
Figur 3. Fraktion av oskadad DNA som en funktion av järn koncentration, medelvärde över tre repetitioner av DNA skydd analysen. Felstaplar betecknar standardavvikelsen för medelvärdet. Villkor: 100 ng av 5 kb linjärt DNA, 1 mM H 2 O 2, 3 pm Dps 12 i 1 x reaktionsbuffert (83 mM HEPES-KOH pH 7,0, 83 mM NaCl). Det ingen protein kontrollen utfördes med samma förhållanden, förutom med en Dps 12 koncentration av 0 iM.
Tabell 1. Exempel på en grundläggande pipettering bord. Utför pipettering för varje kolumn i taget, i ordning från vänster till höger. Inkubationstiden efter varje pipettering steg indikerasi den sista raden. Genom sammanslagning av ingredienser indikeras av plustecken mellan cellerna i kolumnerna 3 och 4, vilket indikerar att DNA och protein bör pipetteras från en gemensam rör innehållande båda ingredienserna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Reningsförfarandet av UP som beskrivs i denna artikel är mycket robust. Renhet har genomgående varit hög (> 99%), inga andra proteiner visas på SDS-PAGE geler som synliga band. Trots detta kvarstår vissa partier av renade Dps verkar ha nukleasaktivitet, vilket framgår av partiell DNA-nedbrytning vid inkubation med mycket höga koncentrationer av UP. Detta skulle kunna tyda på förekomsten av högaktiva DNaser vid låg koncentration att vi inte kunde ta bort genom rening. Detta är dock DNA nedbrytning endast observerats vid koncentrationer som inte normalt används för in vitro-analyser, så det brukar inte utgöra ett problem.
DPS reningsprotokoll som presenteras i denna artikel har flera starka punkter. Proteinet inte behöver vara affinitet-märkta, så ingen möjlighet till störningar av funktioner existerar. Det renade proteinet är DNA-fri, så in vitro-analyser som involverar DNA-bindande egenskaper inte kommer att lidafrån eventuella föroreningar artefakter. Slutligen innehåller de renade Dps praktiskt taget inget järn (<1 järnatomer / Dps dodecamer) förvaras inuti proteinet hålighet, genom den ferene metoden för järn kvantifiering 18, 19. Denna funktion gör det möjligt att exakt kontrollera vad som lastas inuti Dps hålighet eller att använda de ihåliga Dps komplex som en mikro-reaktor utan oro för störningar.
Den DNA-skydd analysen är ett snabbt och tillförlitligt sätt att karakterisera den terapeutiska egenskaper Dps in vitro. Tekniken erbjuder en enkel metod att fysiskt demonstrera den skyddande effekten av Dps expression på cellulär viabilitet. Analysen kan användas för att erhålla kvantitativa data om graden av DNA-skydd som Dps eller andra enzymer som motverkar oxidativ skada, och flera steg kan vidtas för att förbättra dess reproducerbarhet.
Reagensberedning är en viktig fas, så exakt Koncentration mätningar är nödvändiga. Det är bäst att använda samma DNA-lager för alla experiment för att säkerställa att DNA-koncentration inte varierar mellan mätningarna. I vårt fall har vi extraheras flera milligram av plasmid-DNA med hjälp av en maxiprep kit (Promega) och smält den i linjära fragment med en enda-fräs restriktionsenzym. Dessutom Frys inte DPS proteinet efter upptining, alltid arbeta med en ny omgång som upprepad frysning och upptining kan sänka aktiviteten. Framställning av Dps alikvoter vid tidpunkten för rening i ungefär samma volym som experimentet kräver kommer att förhindra överdriven slöseri med proteiner. Snabbt centrifugering av proteinet innan mätning koncentration är avgörande, eftersom annars proteinaggregaten leda till överskattningar av aktivt protein koncentration. Slutligen ägnar flera prover för att kontrollera om reagensen fungerar som förväntat (t.ex. DNA ensamt, DNA med H 2 O 2, DNA med H 2 O 2 och FeSO Den DNA-skydd analysen är ganska känslig för inkubationstider, så varje steg bör tidsinställda så noggrant som möjligt. När man gör många experiment, är det tillrådligt att stagger prover för att säkerställa att inkubationsperioder förblir konstanta mellan proverna. Medelvärde över flera experiment hjälper till att avlägsna eventuella fel som införs genom inkonsekventa inkubationstider, men det totala felet kan minskas genom exakt timing. Flera tips kan föreslås för forskare optimera analysen DNA skydd för proteiner (eller kemikalier) andra än UP. Den viktigaste aspekten att optimera är förhållandet mellan DNA-kvantitet, radikal produktionshastighet, och storleken av den skyddande effekten som undersöks. Tills ett optimalt förhållande hittades, visade många analyser med användning Dps antingen totala förstörelsen av DNA eller ingen synlig skyddande effekt av enzymet. Enligt vår erfarenhet, ett effektivt sätt att perform denna optimering är att välja en någorlunda hög koncentration av protein, välj en DNA-mängd som kommer att synas tydligt på gel utan oversaturating det, och fastställa specifika koncentrationer av H 2 O 2 och FeSO 4 vid vilken allt tillgängligt DNA förstörs. Därefter kommer en serie mätningar med en rad FeSO 4 koncentrationer mellan noll och det bestämda värdet avslöjar ett dynamiskt spektrum av DNA-skydd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för Michela de Martino, Wilfred R. Hagen, och Kourosh Honarmand Ebrahimi för nyttiga diskussioner. Detta arbete stöddes av start-up finansiering från Delft University of Technology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BL21(DE3)pLysS competent cells | Promega | L1195 | |
| pET-17b DNA | EMD-Millipore | 69663-3 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| HEPES | BDH | 441476L | |
| Potassium hydroxide | Merck | 105033 | |
| Sodium chloride | VWR | 443824T | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Set III | EMD-Millipore | 539134 | |
| DEAE-Sepharose | Sigma-Aldrich | DFF100 | |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare LS | 17-0851-01 | |
| SP-Sepharose | Sigma-Aldrich | S1799 | |
| Amicon Ultra Centr. Filter (10K MWCO) | Millipore | UFC901024 | |
| Ferrous Sulphate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8048 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| MOPS | Calbiochem | 475898 | |
| SDS solution | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Static incubator | Hettich | INE500 | |
| Shaking Incubator | New Brunswick Sc. | Inova 44 | |
| Cooled centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-E | |
| Table-top centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Cell disrupter | Constant Systems Ltd. | TS2/40/AA/AA | |
| FPLC Purifier | General Electric | AKTA | |
| Airtight vials | Cole-Parmer | EW-08918-85 | |
| Syringe needles | BD | 305128 | |
| Pipettes | Eppendorf | Z683779-1EA, Z683795-1EA |
References
- Almiron, M., Link, A. J., Furlong, D., Kolter, R. A novel DNA-binding protein with regulatory and protective roles in starved Escherichia coli. Genes Dev. 6, 2646-2654 (1992).
- Chiancone, E., Ceci, P. The multifaceted capacity of Dps proteins to combat bacterial stress conditions: Detoxification of iron and hydrogen peroxide and DNA binding. Biochimica et biophysica acta. 1800 (8), 798-805 (2010).
- Ali Azam, T., Iwata, A., Nishimura, A., Ueda, S., Ishihama, A. Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid. J. Bacteriol. 181 (20), 6361-6370 (1999).
- Grainger, D. C., Goldberg, M. D., Lee, D. J., Busby, S. J. Selective repression by Fis and H-NS at the Escherichia coli dps promoter. Molecular Microbiology. 68 (6), 1366-1377 (2008).
- Martinez, A., Kolter, R. Protection of DNA during oxidative stress by the nonspecific DNA-binding protein Dps. J. Bacteriol. 179 (16), 5188-5194 (1997).
- Nair, S., Finkel, S. E. Dps protects cells against multiple stresses during stationary phase. J. Bacteriol. 186 (13), 4192-4198 (2004).
- Grant, R. A., Filman, D. J., Finkel, S. E., Kolter, R., Hogle, J. M. The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA. Nat. Struct. Biol. 5 (4), 294-303 (1998).
- Zhao, G., Ceci, P., et al. Iron and hydrogen peroxide detoxification properties of DNA-binding protein from starved cells. A ferritin-like DNA-binding protein of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 277 (31), 27689-27696 (2002).
- Ceci, P., Cellai, S., et al. DNA condensation and self-aggregation of Escherichia coli Dps are coupled phenomena related to the properties of the N-terminus. Nucleic Acids Res. 32 (19), 5935-5944 (2004).
- Ilari, A., Ceci, P., Ferrari, D., Rossi, G. L., Chiancone, E. Iron incorporation into Escherichia coli Dps gives rise to a ferritin-like microcrystalline core. J. Biol. Chem. 277 (40), 37619-37623 (2002).
- Swift, J., Wehbi, W. A., et al. Design of functional ferritin-like proteins with hydrophobic cavities. Journal of the American Chemical Society. 128 (20), 6611-6619 (2006).
- Ceci, P., Chiancone, E., et al. Synthesis of iron oxide nanoparticles in Listeria innocua Dps (DNA-binding protein from starved cells): a study with the wild-type protein and a catalytic centre mutant. Chemistry. 16 (2), 709-717 (2010).
- Ceci, P., Ilari, A., Falvo, E., Chiancone, E. The Dps protein of Agrobacterium tumefaciens does not bind to DNA but protects it toward oxidative cleavage: x-ray crystal structure, iron binding, and hydroxyl-radical scavenging properties. The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 20319-20326 (2003).
- Su, M., Cavallo, S., Stefanini, S., Chiancone, E., Chasteen, N. D. The so-called Listeria innocua ferritin is a Dps protein. Iron incorporation, detoxification, and DNA protection properties. Biochemistry. 44 (15), 5572-5578 (2005).
- Kumar, M. Protective effects of Koelreuteria paniculata Laxm. on oxidative stress and hydrogen peroxide-induced DNA damage. Phytopharmacology. 1 (5), 177-189 (2011).
- Stinefelt, B., Leonard, S. S., Blemings, K. P., Shi, X., Klandorf, H. Free radical scavenging, DNA protection, and inhibition of lipid peroxidation mediated by uric acid. Annals of Clinical and Laboratory Science. 35 (1), 37-45 (2005).
- Lopez-Gomollon, S., Sevilla, E., Bes, M. T., Peleato, M. L., Fillat, M. F. New insights into the role of Fur proteins: FurB (All2473) from Anabaena protects DNA and increases cell survival under oxidative stress. The Biochemical Journal. 418 (1), 201-207 (2009).
- Ebrahimi, K. H., Hagedoorn, P. L., Hagen, W. R. Inhibition and stimulation of formation of the ferroxidase center and the iron core in Pyrococcus furiosus ferritin. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1243-1253 (2010).
- Smith, F. E., Herbert, J., Gaudin, J., Hennessy, D. J., Reid, G. R. Serum iron determination using ferene triazine. Clinical Biochemistry. 17 (5), 306-310 (1984).
