Summary
De DNA-bindend eiwit van uitgehongerde cellen (DPS) speelt een cruciale rol in de strijd tegen bacteriële stress. Dit artikel bespreekt de zuivering van
Abstract
Oxidatieve stress is een onvermijdelijk bijproduct van aërobe leven. Moleculaire zuurstof is essentieel voor aardse stofwisseling, maar het neemt ook deel aan vele schadelijke reacties in levende organismen. De combinatie van aërobe metabolisme en ijzer, dat een essentieel samenstelling voor het leven, is voldoende om radicalen door Fenton chemie en degraderen cellulaire componenten. DNA-degradatie is misschien wel de meest schadelijke proces waarbij intracellulaire radicalen, zoals DNA-reparatie is verre van triviaal. De bepaling in dit artikel een kwantitatieve methode om het effect van moleculen en enzymen op radicaal-bemiddelde DNA beschadiging gemeten en gevisualiseerd.
De bescherming assay DNA is een eenvoudige, snelle en krachtige instrument voor de in vitro karakterisering van de beschermende eigenschappen van eiwitten of chemicaliën. Het DNA bestaat uit de blootstelling aan een schadelijke oxidatieve reactie en variërende concentraties van de verbinding van belang te voegen. De verlaging of verhoging van DNA schade als functie van verbindingconcentratie wordt gevisualiseerd middels gelelektroforese. In dit artikel tonen we de techniek van het DNA bescherming assay door het meten van de beschermende eigenschappen van het DNA-bindende eiwit van gedepriveerde cellen (Dps). Dps is een mini-ferritine die wordt gebruikt door meer dan 300 bacteriële soorten krachtig tegen milieu-invloeden. Hier presenteren we de Dps zuiveringsprotocol en de geoptimaliseerde testomstandigheden voor de evaluatie van bescherming DNA door Dps.
Introduction
Aërobe organismen dient steeds kampen met reactieve zuurstof species op hun DNA en andere belangrijke biologische macromoleculen kunnen beschadigen. Een krachtig middel om de toxische effecten van oxidatieve schade tegen het DNA-bindend eiwit van gedepriveerde cellen (Dps). Sinds zijn ontdekking in 1992 van uitgehongerde E. coli cultuur 1 is Dps geïdentificeerd in meer dan 300 soorten bacteriën en archaebacteriën 2. Massive opregulatie van Dps tijdens stationaire fase maakt het de meest sterk uitgedrukt nucleoid-geassocieerd eiwit van E. coli onder hongersnood voorwaarden 3, 4. Daarnaast heeft Dps is aangetoond dat zowel bacteriële levensvatbaarheid en DNA-integriteit tijdens de vele verschillende spanningen, waaronder honger, hoge ijzerconcentratie, blootstelling aan UV licht, warmte shock, en oxidatieve stress 5, 6 te bewaren.
Structureel, Dps self-vennoten in een stabiele homo-oligomere complex van 12 monomeren, which assembleren in een bolvormige holle schelp. De ~ 4,5 nm gehele inwendige holte is toegankelijk voor het uitwendige oplosmiddel via poriën die de passage van kleine moleculen 7 mogelijk en kan gemineraliseerde metalen zoals ijzer 8 sekwestreren. Het beschermende effect van Dps komt uit zijn verscheidene biochemische activiteiten, die niet-specifiek DNA-binding 1, ferroxidase activiteit en ijzeropslageiwit 8 omvatten.
Gedetailleerde studie van de gunstige biochemische activiteiten van Dps eerste vereist de zuivering ervan. Dps zuivering is een uitgebreide procedure zoals Dps niet alleen van andere eiwitten worden gescheiden, maar ook elk gebonden DNA 7. Onze geoptimaliseerde zuivering gebruikt veel voorkomende technieken, bestaande uit twee ionenuitwisselingskolommen en een ammoniumsulfaatprecipitatie stap. Verschillende buffer uitwisselingen zijn nodig, zoals sterk geconcentreerd Dps kan neerslaan uit de oplossing in zoutarm omstandigheden. Zodra Dps eiwit is gezuiverdHet kan worden toegepast op assays die zijn ferroxidase activiteit 8, DNA-bindingsstoichiometrie 9 en mechanismen van ijzerbindend 10 direct te meten. Gezuiverde Dps heeft ook andere mogelijke toepassingen. De stabiele holle sferische structuur van Dps is gebruikt als steigers voor opslag hydrofobe deeltjes in het eiwit holte 11 en zelfs als een reactiekamer om nieuwe magnetische nanodeeltjes synthetiseren 12.
Het beschermende vermogen van Dps om schade als gevolg van reactieve zuurstofradicalen bemiddelen kan duidelijk zijn en rechtstreeks aangetoond met behulp van de DNA-protectie-analyse 13, 14. In deze in vitro-procedure, worden radicalen geproduceerd wanneer ijzer katalyseert H 2 O 2 degradatie via Fenton chemie. Deze radicalen direct aanwezig DNA schade in de reactie en kan volledig degraderen bij hoge concentraties. Twee belangrijke Dps activiteiten kunnen zowel direct tegengaan van de effecten van Fenton-gemedieerde radicalen. Dps verlaagt de concentratie van katalytisch ijzer door mineralisatie, verbruiken de beschikbare waterstof-peroxide in het proces. Daarnaast Dps binden aan DNA kan mogelijk fysiek afschermen van radicale schade en condenseert het in een kleiner volume met minder reactief oppervlak. De combinatie van deze twee eigenschappen maakt de DNA protectie-analyse geschikt voor het meten beschermende Dps activiteit.
De bescherming assay DNA is zeer veelzijdig en kan worden gebruikt voor een verscheidenheid van toepassingen buiten Dps karakterisatie. Radicalen is een veel voorkomende vorm van stress in cellen en vele verschillende eiwitten en chemicaliën worden gebruikt om het tegen. Het algemene principe van de assay, met behulp van DNA integriteit als een marker voor radicalen, kunnen worden gebruikt in combinatie met vrijwel elk radicaal-producerende reactie of tegengaan middel. Onder andere is de test met succes gebruikt om anti-oxidatieve eigenschappen te bepalenvan K. paniculata extract voor gebruik in de voedingsindustrie 15, om de effecten van urinezuur karakteriseren op hydroxyl schade bemiddeling 16, en nieuwe inzichten in de functie van Fur transcriptionele regulator eiwitten 17.
Ondanks de talrijke toepassingen van de assay in gepubliceerde artikelen, vonden we dat optimalisatietechnieken en probleemoplossingsstappen nodig waren, waardoor het opzetten van de test voor het eerst onnodig tijdrovend proces voor veel onderzoekers. Het protocol presenteren we in dit artikel is bedoeld om deze barrière voor vermelding te verwijderen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Dps Expressie en zuivering
Het verkrijgen van eiwit van hoge zuiverheid is een essentiële eerste stap voor de DNA-protectie-analyse. Zuivering van Dps eiwit kan worden uitgevoerd in 4-5 dagen.
- Transformeren van een protease-deficiënte stam van E. coli (zoals BL21 (DE3) pLysS) met pET vector (bijvoorbeeld pET17) waarin de Dps eiwit coderende sequentie gekloond.
- Strook de getransformeerde cellen uit op Luria Broth (LB) agarplaten die geschikte antibiotica (zoals ampicilline en chlooramfenicol de voorbeelden in 1.1). Incubeer de platen gedurende de nacht bij 37 ° C.
- Inoculeren een enkele kolonie van de plaat in 30 ml LB-medium met de juiste antibiotica. Incubeer overnacht bij 37 ° C onder schudden bij 200-250 rpm.
- Inoculeren 2 x 1 L LB-medium met geschikte antibiotica met elk van de overnacht cultuur 10 ml. Groeien bij 37 ° C onder schudden tot OD 600
- Oogst cellen door centrifugeren bij 6000 xg gedurende 15 minuten. Resuspendeer de celpellets in 7,5 ml DEAE buffer A (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 100 mM NaCl, 0,1 mM EDTA) per L van geïnduceerde celkweek. Monsters kunnen worden bevroren in vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C, indien gewenst. De procedure kan vervolgens ontdooien van de monsters in een waterbad worden voortgezet bij 4 ° C.
- Voeg een mengsel van proteaseremmers (zoals Calbiochem set III proteaseremmers op 0.167 gl per ml celsuspensie) aan de celsuspensie afbraak van overexpressie Dps voorkomen.
- Bereid cel-vrij extract met behulp van een Franse pers. Prime de Franse pers met 20 ml DEAE Buffer A (bij gebruik van een continue-flow-model), dan verstoringent het monster tweemaal bij 20 kpsi. Centrifugeer het lysaat bij 30.000 xg gedurende 35 min bij 4 ° C tot onoplosbare deeltjes te verduidelijken, en sla het supernatant. De supernatant kan vervolgens worden bevroren met vloeibare stikstof en bewaard bij -80 ° C, indien gewenst.
- Equilibreer een ml DEAE Sepharosekolom 30 CL-6B met DEAE Buffer A, met behulp van een FPLC. Voer buffer door de kolom 1-2 ml / min met een maximale druk van 0,2 MPa over achtergrond. Laad het celvrije extract op de kolom, en beginnen de doorstroming als de OD 280 signaal begint te stijgen boven de basislijn verzamelen. Was de kolom met DEAE Buffer A totdat de OD 280 waarde keert terug naar de uitgangswaarde, terwijl het continu verzamelen van de doorstroming. De doorstroom dient de meerderheid van de Dps eiwit, vrij van gebonden DNA bevatten. Was de kolom met 100% buffer B (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 1 M NaCl, 0,1 mM EDTA). Dit eluaat bevat Dps-DNA complexen en andere eiwitten en kunnen worden weggegooid.
- Verwijder advertentiebijkomende verontreinigende proteïnen door ammoniumsulfaatprecipitatie. Bepaal de hoeveelheid samengevoegde doorstroom. Langzaam (over een periode van 10-20 min) droog add small-grain ammoniumsulfaat tot 62% verzadiging (390 mg per ml oplossing) bij 4 ° C onder goed roeren. Roer het mengsel gedurende nog eens 20-30 minuten na toevoeging van het laatste gedeelte van ammoniumsulfaat tot volledig evenwicht te waarborgen. Dps zal oplosbaar blijven, terwijl verontreinigende eiwitten zullen neerslaan uit de oplossing.
- Verwijder geprecipiteerde eiwitten door centrifugeren bij 20.000 xg gedurende 30 min bij 4 ° C en bewaar het supernatant.
- Voeg langzaam een extra 227 mg ammoniumsulfaat per ml supernatant aan 94% verzadiging te bereiken en roeren gedurende 20-30 min om volledige evenwicht te waarborgen. Dps precipitaten in deze hoge zoutconcentratie en bij 20.000 g gedurende 30 min kan worden verzameld door centrifugatie bij 4 ° C. Dps zal in het pellet, de supernatans worden verwijderd. De pellet kan worden opgeslagen bij -80 ° C indien desired.
- Resuspendeer de Dps-bevattende pellet in Resuspension Buffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA). Pas het monstervolume tot 2,5 ml.
- Bufferuitwisseling het ammoniumsulfaat te verwijderen met behulp van een PD-10 gelfiltratie kolom. Equilibreer de gel bed met 25 ml hersuspensiebuffer. Breng 2,5 ml van het monster Dps aan de top van de kolom PD-10 en laat het genieten inch Gooi de doorstroom. Verzamel Dps door elutie met 3,5 ml hersuspensiebuffer.
- Centrifugeer de buffer uitgewisselde monster bij 16.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C om eventuele onoplosbare componenten te verwijderen, en verdunnen met 6-10 ml verdunningsbuffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 0,1 mM EDTA), zodat de zoutconcentratie voldoende lage Dps bindt aan de SP Sepharose kolom. Bijzonder geconcentreerde monsters van Dps kan minder oplosbaar bij verdunning in een lagere zout buffer, zoals blijkt uit de vloeistof troebel worden, maar kan volledig opnieuw opgelost door toevoeging van een kleine Amount van 5 M NaCl-oplossing (extra 10-20 mM).
- Een evenwicht ml SP Sepharose Fast Flow kolom 30 met SP buffer A (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,1 mM EDTA). Voer buffer door de kolom 1,5-2 ml / min met een druk van 0,3 MPa grens over achtergrond. Laad het monster in de kolom. Wassen met SP Buffer A totdat de OD 280 spoor terug naar de basislijn, en gooi de doorstroming. Voer een 150 ml lineaire gradiënt van 0 tot 100% buffer B, terwijl het verzamelen van fracties van 2 ml. Dps zal elueren in een scherpe piek bij ongeveer 50% B, hoewel variatie door 10% mogelijk is.
- Voer de elutiefracties op een 15% SDS-PAGE gel, en controleer op verontreiniging van DNA door het meten van de OD 260 / OD 280 verhouding met behulp van een spectrofotometer. De gel moet dan alleen nog een band rond 19 kDa, en de OD 260 / OD 280 is meestal rond de 0.7. Zwembad de zuiverste Dps fracties. Gebruik een centrifugale filtereenheid (zoals Amicon Ultrafiltratie Unit) met een10K moleculair gewicht cut-off naar de Dps concentreren en ruilen het in een opslag buffer (50 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM NaCl). Aliquot de gezuiverde Dps, en vries in vloeibare stikstof voor opslag bij -80 ° C.
2. DNA Protection Assay
De bepaling omvat verschillende tijdgevoelige stappen en worden afgestemd op de tweede reproduceerbare resultaten te verkrijgen. Veel ingrediënten en pipetteerstappen betrokken, dus pipetteren tabel (zie tabel 1) is het raadzaam volgen stappen en volumes houden. De totale tijd die de test is niet meer dan 3 uur.
- Meet 30 ml water in een luchtdichte flacon, spoel het water met N2 gedurende 10 min (met twee injectienaalden, een in de vloeistof, een boven) om zuurstof uit de oplossing te verwijderen. Voeg 0,0168 g FeSO 4 • 7H 2 O om het water naar een 2 mM voorraad oplossing te verkrijgen. Sluit de flacon en spoelen met stikstof gedurende 5 minuten meer, dan meng. De oplossing moetduidelijk, als een zweem van geel detecteerbaar is, bereiden een nieuw ijzeren oplossing.
- Maak een 100 mm H 2 O 2-oplossing (10.87 pi 9.2MH 2 O 2 in 1 ml water); houden op ijs en afgeschermd van licht door het wikkelen in aluminiumfolie. Alleen te gebruiken voor ongeveer 1-2 uur na de bereiding te wijten aan spontane verval. De waterstofperoxide stock is eveneens onderworpen aan afbraak, die deels kan worden verminderd door droging (in het donker bij 4 ° C). Regelmatige controles van de voorraad concentratie door het meten van de OD 240 worden aanbevolen.
- Dooi een hoeveelheid van gezuiverd Dps snel in een kamer-temperatuur waterbad, en blijf op ijs. Centrifugeer gedurende 10 sec bij 4000 xg in een tafelblad picocentrifuge neer te slaan aggregaten. Meet concentratie na centrifugeren met een spectrofotometer (OD 280 = 1,547 geeft een concentratie van 100 uM monomeer Dps).
- Verdunnen lineair DNA van hoge concentratie voorraad met 12x reactiebuffer (1M MOPS-KOH pH 7,0, 1 M NaCl) tot een concentratie van 100 ng / ul. Lineair DNA wordt gebruikt voor kwantificering vergemakkelijken, maar plasmide-DNA kan worden gebruikt.
- Pipetteer 1 ui van de DNA-buffer mengsel in een PCR buis. Voeg voldoende water in het reactiemengsel, zodat het uiteindelijke reactievolume (minus SDS) 12 gl is. Dit bedrag moet vooraf kunnen worden berekend met behulp van het pipetteren tafel. Dps toevoegen aan een uiteindelijke dodecameer concentratie van 3 uM. Incubeer 15 minuten bij kamertemperatuur om voor Dps te binden aan DNA.
- Voeg genoeg 2 mM FeSO 4 oplossing om de gewenste concentratie te bereiken. Een typisch experiment maakt gebruik van een reeks concentraties van 0 tot 1 mM FeSO 4. Hogere concentraties leiden tot meer uitgebreide DNA degradatie maar kan ook leiden tot de vorming van ferri precipitaten in het reactiemengsel. Snel voeg 1 pl van de 100 mM H 2 O 2-oplossing (10 mM eindconcentratie) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten om de Fenton toe-Gemedieerde afbraak reactie plaatsvindt.
- Voeg 0,8 pl 20% SDS (natriumdodecylsulfaat). Meng en incubeer bij 85 ° C gedurende 5 minuten aan de Dps-DNA complexen verstoren. De SDS destabiliseert de Dps-DNA-complex en voorkomt ongewenste gel verschuivingen voor het DNA, die het gemak van de kwantificering verbetert. Een optionele stap is de reactie van katalytisch degraderen het waterstofperoxide tot niet-toxische producten te stoppen. Voor de in dit protocol omschreven voorwaarden, is deze stap niet nodig is om een breed scala van DNA degradatie te verkrijgen.
- Incubeer op ijs gedurende 1 min, voeg laden kleurstof en laad op een agarosegel. Run de gel, en vlek voor DNA met behulp van ethidiumbromide. De gel dient gekleurd na elektroforese plaats vóór elektroforese, om te voorkomen dat het SDS te mengen met ethidium bromide verdeling in de gel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De zuiveringswerkwijze voor Dps hier beschreven zeer reproduceerbaar. Dps zuivering volgens het beschreven protocol, met 2 L van E. coli cultuur als uitgangspunt, zal typisch opbrengst 2,5 ml eiwit dat Dps 12 bij concentraties tussen 5 en 12 pM. Langere inductietijden (4 uur) lijken deze variabiliteit te verminderen. Proteïne zuiverheid constant boven 99%, zoals blijkt uit SDS-PAGE gels (figuur 1). De mate van verontreiniging DNA is altijd verwaarloosbaar, zoals blijkt zowel door agarose gels gekleurd DNA en de OD 260 / OD 280 verhouding. Deze waarde kan variëren, maar de waarden zijn nooit boven de 0,9, wat aangeeft dat DNA contaminatie niveaus blijven ver beneden de 5%.
De reproduceerbaarheid van de resultaten van de DNA protectie-analyse zal sterk afhangen uitvoering. Indien de concentraties van alle bestanddelen nauwkeurig worden gemeten (met name de eiwitconcentratie na centrifugation), en incubatietijden voor monsters consistent zijn, zullen de resultaten consistent lijken op die getoond in Figuur 2. Als de omstandigheden minder ideaal, zullen kleine variabiliteit tussen assays zichtbaar zijn, hoewel een algemene toename van DNA-degradatie met toenemende ijzerconcentratie zal nog steeds zichtbaar. Het verkregen door de DNA bescherming testresultaten kan worden gekwantificeerd door het gebruik van beeld processing software zoals ImageLab. Figuur 3 toont het resultaat van de kwantificering, gemiddeld over drie bepalingen. De fout balken geven het algemene hoge niveau van reproduceerbaarheid verkregen.
Figuur 1. Tussenstappen Dps zuivering geanalyseerd door SDS-PAGE (1) celvrij extract,. (2) doorstroming van DEAE Sepharose kolom, (3) eluaat van de DEAE kolom, (4) van de supernatant 60% ammoniumsulfaat lot neerslag, (5) Dps monster na 90% ammoniumsulfaatprecipitatie en bufferuitwisseling door PD-10 kolom, (6) samengevoegde zuivere fracties Dps na SP Sepharose kolom, (7) eiwitmolecuulgewichtmerkers. De percentages onderaan elke baan duiden Dps zuiverheid zoals bepaald door het kwantificeren software (ImageQuant TL).
Figuur 2. Dps-gemedieerde bescherming van DNA tegen oxidatieve afbraak. Alle lanen bevatten 100 ng lineair 5 kb DNA. (1) Alleen DNA, (2) DNA met 1 mM H 2 O 2, (3) DNA met 1 mM H 2 O 2 en 166 uM FeSO 4, (4) tot (8) DNA met 3 uM Dps 12, 1 mM H 2 O 2 en toenemende ijzerconcentratie (0 uM, 166 uM, 333 uM, 666 pM en 1,000 pM) van links naar rechts.
Figuur 3. Fractie onbeschadigde DNA als functie van de concentratie ijzer, gemiddeld over drie herhalingen van de DNA protectie-analyse. Foutenbalken geven de standaardafwijking van het gemiddelde. Voorwaarden: 100 ng van 5 kb lineair DNA, 1 mM H 2 O 2, 3 uM Dps 12 in 1 x reactiebuffer (83 mM HEPES-KOH pH 7,0, 83 mM NaCl). De no-eiwit controle werd uitgevoerd met behulp van dezelfde voorwaarden, behalve met een Dps 12 concentratie van 0 uM.
Tabel 1. Voorbeeld van een basis pipetteren tafel. Voer het pipetteren voor elke kolom op een moment, in de juiste volgorde van links naar rechts. De incubatietijd na elke pipetteren stap wordt aangegevenin de laatste rij. Het poolen van ingrediënten wordt aangegeven door het plusteken tussen cellen in de kolommen 3 en 4 geeft aan dat de DNA en eiwitten worden gepipetteerd ve gemeenschappelijk buis met kookt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het zuiveringsproces van Dps zoals beschreven in dit artikel is zeer robuust. Zuiverheid vaste hoog (> 99%), geen andere eiwitten op SDS-PAGE gels zichtbare banden. Ondanks dit, sommige batches van gezuiverd Dps lijken nucleaseactiviteit hebben, zoals blijkt uit de gedeeltelijke DNA-degradatie bij incubatie met zeer hoge concentraties van Dps. Dit zou de aanwezigheid van zeer actieve DNasen in een lage concentratie dat we niet in staat waren tot zuivering te verwijderen geven. Echter, dit DNA degradatie alleen waargenomen bij concentraties die normaal gesproken worden gebruikt voor in vitro assays, dus meestal niet een probleem vormen.
De Dps zuiveringsprotocol zoals gepresenteerd in dit artikel heeft een aantal sterke punten. Het eiwit moet niet worden affiniteit-gemerkte, zodat geen mogelijkheid mengen functie bestaat. Het gezuiverde eiwit is DNA-vrij, dus in vitro testen waarbij DNA-bindende eigenschappen zal niet lijdeneen eventuele besmetting artefacten. Ten slotte, de gezuiverde Dps bevat vrijwel geen ijzer (<1 ijzeratomen / Dps dodecameer) opgeslagen in het eiwit holte, door de ferene methode van ijzer kwantificering 18, 19. Deze functie maakt het mogelijk om precies te controleren wat er in de Dps holte wordt geladen of op de holle Dps complex als een micro-reactor gebruiken zonder zorgen over inmenging.
De bescherming assay DNA is een snelle en betrouwbare manier om de therapeutische eigenschappen van Dps karakteriseren in vitro. De techniek biedt een eenvoudige methode om fysiek tonen het beschermende effect van Dps expressie van cellulaire levensvatbaarheid. De test kan worden gebruikt om kwantitatieve gegevens te verkrijgen over de mate van bescherming die door DNA Dps of andere enzymen die oxidatieve schade te compenseren en een aantal stappen kunnen worden ondernomen om de reproduceerbaarheid te verbeteren.
Reagens voorbereiding is een belangrijke fase, zo nauwkeurig concentration metingen zijn essentieel. Het beste is om hetzelfde DNA stock gebruiken voor alle experimenten zodat DNA concentratie niet schommelen tussen metingen. In ons geval geëxtraheerd we verscheidene milligrammen van plasmide-DNA met een Maxiprep kit (Promega) en verteerd in lineaire fragmenten met een enkele frees restrictie-enzym. Bovendien hoeft de Dps eiwit niet opnieuw invriezen na ontdooien; altijd werken met een verse hoeveelheid als herhaald invriezen en ontdooien kan de activiteit verlagen. Bereiding van Dps Aliquots bij de zuivering bij ongeveer hetzelfde volume als het experiment vereist voorkomt overmatige verspilling van eiwit. Snel centrifugeren van het eiwit voordat meet de concentratie is van cruciaal belang, omdat anders eiwitcomplexen leiden tot overschattingen van actief eiwit concentratie. Tenslotte wijdt verschillende monsters om te controleren of de reagentia werkt zoals verwacht (bijvoorbeeld DNA alleen, DNA met H 2 O 2, DNA met H 2 O 2 en FeSO De bescherming assay DNA is zeer gevoelig voor incubatietijden, dus elke stap moet worden getimed zo nauwkeurig mogelijk. Bij het doen veel experimenten, is het raadzaam om monsters spreiden zodat incubatieperiode tussen de monsters constant blijven. Middeling over meerdere experimenten helpt bij het verwijderen eventuele fouten geïntroduceerd door inconsistente incubatietijd, maar de totale fout kan worden verminderd door precieze timing. Een aantal tips kunnen worden voorgesteld voor onderzoekers optimaliseren van de bescherming van het DNA-test voor eiwitten (of chemicaliën), andere dan Dps. Het belangrijkste aspect optimaliseren is de verhouding tussen de hoeveelheid DNA, basis productiesnelheid en de omvang van het beschermende effect dat wordt onderzocht. Totdat een optimale verhouding gevonden, vele assays met Dps vertoonden totale vernietiging van DNA of geen zichtbare beschermende werking van het enzym. In onze ervaring, een efficiënte manier om perform deze optimalisatie is een redelijk hoge eiwitconcentratie selecteert, kiest een hoeveelheid DNA die duidelijk zichtbaar op gel zonder oversaturating, en bepalen specifieke concentraties H 2 O 2 en FeSO 4, waarbij alle beschikbare DNA wordt vernietigd. Daarna zal een reeks van metingen met een reeks FeSO 4 concentraties tussen nul en de vastgestelde waarde een dynamisch bereik van bescherming DNA onthullen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zijn dankbaar voor Michela de Martino, Wilfred R. Hagen, en Kourosh Honarmand Ebrahimi voor nuttige discussies. Dit werk werd ondersteund door de start-up financiering van de Technische Universiteit Delft.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BL21(DE3)pLysS competent cells | Promega | L1195 | |
| pET-17b DNA | EMD-Millipore | 69663-3 | |
| LB broth powder | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Ampicillin sodium salt | Sigma-Aldrich | A0166 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| HEPES | BDH | 441476L | |
| Potassium hydroxide | Merck | 105033 | |
| Sodium chloride | VWR | 443824T | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Protease Inhibitor Cocktail Set III | EMD-Millipore | 539134 | |
| DEAE-Sepharose | Sigma-Aldrich | DFF100 | |
| Ammonium sulphate | Sigma-Aldrich | A4418 | |
| PD-10 Desalting Columns | GE Healthcare LS | 17-0851-01 | |
| SP-Sepharose | Sigma-Aldrich | S1799 | |
| Amicon Ultra Centr. Filter (10K MWCO) | Millipore | UFC901024 | |
| Ferrous Sulphate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8048 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | 216763 | |
| MOPS | Calbiochem | 475898 | |
| SDS solution | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E1510 | |
| Static incubator | Hettich | INE500 | |
| Shaking Incubator | New Brunswick Sc. | Inova 44 | |
| Cooled centrifuge | Beckman Coulter | Avanti J-E | |
| Table-top centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Cell disrupter | Constant Systems Ltd. | TS2/40/AA/AA | |
| FPLC Purifier | General Electric | AKTA | |
| Airtight vials | Cole-Parmer | EW-08918-85 | |
| Syringe needles | BD | 305128 | |
| Pipettes | Eppendorf | Z683779-1EA, Z683795-1EA |
References
- Almiron, M., Link, A. J., Furlong, D., Kolter, R. A novel DNA-binding protein with regulatory and protective roles in starved Escherichia coli. Genes Dev. 6, 2646-2654 (1992).
- Chiancone, E., Ceci, P. The multifaceted capacity of Dps proteins to combat bacterial stress conditions: Detoxification of iron and hydrogen peroxide and DNA binding. Biochimica et biophysica acta. 1800 (8), 798-805 (2010).
- Ali Azam, T., Iwata, A., Nishimura, A., Ueda, S., Ishihama, A. Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid. J. Bacteriol. 181 (20), 6361-6370 (1999).
- Grainger, D. C., Goldberg, M. D., Lee, D. J., Busby, S. J. Selective repression by Fis and H-NS at the Escherichia coli dps promoter. Molecular Microbiology. 68 (6), 1366-1377 (2008).
- Martinez, A., Kolter, R. Protection of DNA during oxidative stress by the nonspecific DNA-binding protein Dps. J. Bacteriol. 179 (16), 5188-5194 (1997).
- Nair, S., Finkel, S. E. Dps protects cells against multiple stresses during stationary phase. J. Bacteriol. 186 (13), 4192-4198 (2004).
- Grant, R. A., Filman, D. J., Finkel, S. E., Kolter, R., Hogle, J. M. The crystal structure of Dps, a ferritin homolog that binds and protects DNA. Nat. Struct. Biol. 5 (4), 294-303 (1998).
- Zhao, G., Ceci, P., et al. Iron and hydrogen peroxide detoxification properties of DNA-binding protein from starved cells. A ferritin-like DNA-binding protein of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 277 (31), 27689-27696 (2002).
- Ceci, P., Cellai, S., et al. DNA condensation and self-aggregation of Escherichia coli Dps are coupled phenomena related to the properties of the N-terminus. Nucleic Acids Res. 32 (19), 5935-5944 (2004).
- Ilari, A., Ceci, P., Ferrari, D., Rossi, G. L., Chiancone, E. Iron incorporation into Escherichia coli Dps gives rise to a ferritin-like microcrystalline core. J. Biol. Chem. 277 (40), 37619-37623 (2002).
- Swift, J., Wehbi, W. A., et al. Design of functional ferritin-like proteins with hydrophobic cavities. Journal of the American Chemical Society. 128 (20), 6611-6619 (2006).
- Ceci, P., Chiancone, E., et al. Synthesis of iron oxide nanoparticles in Listeria innocua Dps (DNA-binding protein from starved cells): a study with the wild-type protein and a catalytic centre mutant. Chemistry. 16 (2), 709-717 (2010).
- Ceci, P., Ilari, A., Falvo, E., Chiancone, E. The Dps protein of Agrobacterium tumefaciens does not bind to DNA but protects it toward oxidative cleavage: x-ray crystal structure, iron binding, and hydroxyl-radical scavenging properties. The Journal of Biological Chemistry. 278 (22), 20319-20326 (2003).
- Su, M., Cavallo, S., Stefanini, S., Chiancone, E., Chasteen, N. D. The so-called Listeria innocua ferritin is a Dps protein. Iron incorporation, detoxification, and DNA protection properties. Biochemistry. 44 (15), 5572-5578 (2005).
- Kumar, M. Protective effects of Koelreuteria paniculata Laxm. on oxidative stress and hydrogen peroxide-induced DNA damage. Phytopharmacology. 1 (5), 177-189 (2011).
- Stinefelt, B., Leonard, S. S., Blemings, K. P., Shi, X., Klandorf, H. Free radical scavenging, DNA protection, and inhibition of lipid peroxidation mediated by uric acid. Annals of Clinical and Laboratory Science. 35 (1), 37-45 (2005).
- Lopez-Gomollon, S., Sevilla, E., Bes, M. T., Peleato, M. L., Fillat, M. F. New insights into the role of Fur proteins: FurB (All2473) from Anabaena protects DNA and increases cell survival under oxidative stress. The Biochemical Journal. 418 (1), 201-207 (2009).
- Ebrahimi, K. H., Hagedoorn, P. L., Hagen, W. R. Inhibition and stimulation of formation of the ferroxidase center and the iron core in Pyrococcus furiosus ferritin. Journal of Biological Inorganic Chemistry. 15 (8), 1243-1253 (2010).
- Smith, F. E., Herbert, J., Gaudin, J., Hennessy, D. J., Reid, G. R. Serum iron determination using ferene triazine. Clinical Biochemistry. 17 (5), 306-310 (1984).
