Summary
Neutrofiler är de mest rikligt förekommande leukocyter i blod. Neutrofiler har transkriptionellt reglerade funktioner såsom produktion av proinflammatoriska cytokiner och hämning av apoptos. Dessa funktioner kan studeras med den metod som presenteras här, vilket möjliggör detektion och kvantifiering av nukleära faktorer genom flödescytometri i isolerade kärnor
Abstract
Neutrofiler är de mest rikligt förekommande leukocyter i perifert blod. Dessa celler är de första att synas på ställen för inflammation och infektion, och blev därmed den första försvarslinjen mot invaderande mikroorganismer. Neutrofiler har viktiga antimikrobiella funktioner som fagocytos, utsläpp av lytiska enzymer och produktion av reaktiva syreradikaler. Utöver dessa viktiga försvar funktioner, neutrofiler utföra andra uppgifter i svar på infektion såsom produktion av proinflammatoriska cytokiner och hämning av apoptos. Cytokiner rekrytera andra leukocyter som hjälper rensa infektion och hämning av apoptos låter neutrofila att leva längre på platsen för infektionen. Dessa funktioner regleras vid nivån för transkription. Men eftersom neutrofiler är kortlivade celler, kan studier av transkriptionellt reglerade svar i dessa celler inte utföras med konventionella metoder reportergen eftersom det inte finns några effektivträckliga tekniker för neutrofil transfektion. Här presenterar vi en enkel och effektiv metod som möjliggör detektion och kvantifiering av nukleära faktorer i isolerade och immunolabeled kärnor med flödescytometri. Vi beskriver tekniker för att isolera rena neutrofiler från humant perifert blod, stimulera dessa celler med anti-receptor-antikroppar, isolera och immunolabel kärnor, och analysera kärnor genom flödescytometri. Metoden har framgångsrikt använts för att detektera NF-kB och Elk-1 nukleära faktorer i kärnor från neutrofiler och andra celltyper. Således representerar detta förfarande ett alternativ för att analysera aktivering av transkriptionsfaktorer i isolerade kärnor från en mängd celltyper.
Introduction
Neutrofiler är de mest rikligt förekommande leukocyter i perifert blod 1. Under inflammation och infektion neutrofiler är de första cellerna ska visas på den drabbade platsen där de fungerar som första försvarslinjen 2. Neutrofiler har flera antimikrobiella mekanismer 3 inklusive fagocytos, produktion av reaktiva syreradikaler, frisättning av lytiska enzymer genom degranulering, och produktion av proinflammatoriska cytokiner 4,5. Neutrofiler är kortlivade celler som snabbt blir aktiverade genom signalering från olika cellytereceptorer. Även neutrofiler har ansetts terminal celler på grund av deras korta liv och eftersom de genomgår apoptos inte aktiveras under den inflammatoriska processen 6, är det nu klart att de också kan ändra sin fenotyp genom att ändra nivån för transkription av specifika gener. Produktionen av cytokiner 5 och hämningen av apoptos 7,8 är två iVIKTIG aktivering-beroende cellfunktioner regleras vid nivån för transkription i neutrofiler. Nukleär faktor kB (NF-kB) deltar i den transkriptionella kontrollen av cytokinproduktion 4 och i regleringen av cellöverlevnad och apoptos 9-11 i olika celltyper.
De signalvägar som leder till nukleär faktor aktivering vanligtvis studeras genom analyser reportergen eller genom elektroforetiska mobilitetsförskjutningsanalyser analyser (EMSA). Men eftersom neutrofiler är kortlivade celler, kan studier av transkriptionellt reglerade svar i dessa celler inte utföras med analyser reportergen, eftersom det inte finns några effektiva metoder för neutrofil transfektion. EMSA-analyser har använts i neutrofiler för att utforska nukleär faktor aktivering 12,13, men är denna metod komplicerad och dyr eftersom den förutsätter användning av radioaktivt material. Nucleofection är en annan teknik som har använts successfully att transfektera monocyter 14. Sålunda, åtminstone i teorin, kan nukleär faktor aktivering detekteras i neutrofiler efter transfektion (trots låg verkningsgrad). Emellertid skulle denna teknik vara dyrare, tidskrävande och förmodligen mindre kvantitativ. Mikroskopisk analys av immunofärgade celler skulle också kunna användas för att detektera nukleära faktorer i kärnan. I själva verket har vi upptäckt NF-KB translokation in i kärnan på detta sätt 15. Tyvärr är denna teknik också tidskrävande, mindre kvantitativ och med förbehåll för observatörens partiskhet.
Här presenterar vi en enkel och effektiv metod som möjliggör detektion och kvantifiering av nukleära faktorer i isolerade och immunolabeled kärnor med flödescytometri. Vi beskriver tekniker för att isolera neutrofiler från humant perifert blod, stimulera dessa celler via integriner eller Fc-receptorer med anti-receptor-antikroppar, isolera och immunolabel kärnor, och analysera kärnor med flödescytometri (Figure 1). Metoden har framgångsrikt använts för att detektera NF-kB 15 och älg-1 16 nukleära faktorer i neutrofil kärnor. Känsligheten hos denna metod medger detektering av små förändringar i nukleär faktor nivåer i kärnan. Denna metod kan också användas för att analysera nivån av transkriptionsfaktorer i kärnor från andra celltyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Isolering av neutrofiler (PMN) från humant blod
- Användning ca 20 ml humant blod med heparin (10 U / ml) som antikoagulant. Blod samlades från vuxna friska frivilliga med venopuncture. Alla experiment utfördes under godkännande av bioetiska kommittén vid Instituto de Investigaciones Biomédicas - UNAM.
- Sätt 2 ml 6% dextran T500 i PBS i ett 15 ml koniskt centrifugrör och tillsätt 10 ml blod. Blanda genom att vända röret två eller tre gånger och låt det sitta i 45 minuter för att möjliggöra SR.
- I en färsk 15 ml koniskt centrifugrör satte 5 ml Ficoll-Paque.
- Ta leukocyt-rika plasman som bildas ovanför sedimenterade erytrocyter, och försiktigt pipettera den på toppen av Ficoll-Paque bilda ett andra skikt. Se till att det finns två faser.
- Centrifugera vid 516 x g under 20 minuter vid 4 ° C. Efter centrifugering vid interfasen av plasma och Ficoll-Paque det finns ett skikt av mononukleära celler. Neutrophils är på botten av röret.
- Eliminera supernatanten, bryta cellpelleten genom att knacka på röret mot ett rack, och återsuspendera cellerna genom att tillsätta 10 ml kallt (4 ° C) PBS Anmärkning:. Återsuspendering av cellerna genom att pipettera upp och ned rekommenderas inte eftersom det är för skadar cellerna.
- Överför cellsuspensionen till en 50 ml koniskt centrifugrör och centrifugera vid 290 xg under 5 minuter vid 4 ° C.
- Bryt cellpelleten som tidigare och tillsätt 10 ml kall (4 ° C) hypoton lösning (0,2% NaCl, 1% BSA, 20 mM Hepes, pH = 7,4) för att lysera erytrocyter. Blanda genom att snurra röret försiktigt för hand under exakt en minut.
- Tillsätt 10 ml av kall (4 ° C) hyperton lösning (1,6% NaCl, 1% BSA, 20 mM HEPES, pH = 7,4), blanda och räkna cellerna med en hemocytometer (vanligtvis> 95% är PMN).
Notera: Håll röret med cellsuspensionen på is medan räkna cellerna. - Centrifugera som tidigare och återsuspendera PMN vid 107 celler / ml i kall (4 ° C) PBS. Håll på is.
Obs: Neutrofiler förblir viabla och funktionella vid 4 ° C under omkring 6 till 8 timmar.
2. Aktivera PMN
- Sätt 100 pl av PMN suspension (1 x 10 7 celler / ml) i en 1,5 ml Eppendorf-rör.
Obs: Provrör bör göras åtminstone dubbletter. Vanliga negativa kontroller bör omfatta första antikropp bara, och sekundär antikropp bara. - Tillsätt motsvarande anti-integrin eller anti-Fc-receptor monoklonal antikropp (mAb) vid 10 | ig / ml och inkubera på is under 15 minuter.
- Tvätta PMN genom att tillsätta 1 ml kall (4 ° C) PBS, centrifugering vid 1.743 x g (4.500 rpm) i en mikrocentrifug, och aspirera supernatanten.
- Bryt cellpelleten genom att knacka på botten av röret mot ett rack, tillsätt 1 ml kall PBS och tvätta två gånger som i föregående steg.
Notera: Dessa tvättar avlägsna obunden antikropp. - Återsuspendera PMN i samma (iitial) volym av varm (37 ° C) PBS innehållande 60 | ig / ml av F (ab ') 2 get-anti-mus-IgG.
Obs: Det sekundära anti-mus-IgG-antikropp kommer att binda till den första anti-receptor-antikropp och kommer att orsaka tvärbindning av receptorn. - Inkubera vid 37 ° C under 1 till 20 minuter, beroende på den nukleära faktorn av intresse. För NF-kB vanligtvis 15 minuter, och för Elk-1 vanligen 5 minuter.
Obs: Inkubation av cellerna vid 37 ° C inducerar receptor-tvärbindning, vilket inte kan ske vid 4 ° C. - Tillsätt 1 ml kall PBS och centrifugera 3 min vid 1.743 xg i mikrocentrifug.
- Avlägsna supernatanten
- Frys PMN omedelbart dry-ice/ethanol bad och behålla dem där i 10 min.
3. Isolering och Fixering av kärnor
- Återsuspendera frysta PMN pelleten i 100 pl kall (4 ° C) hypoton buffert (10 mM HEPES, 10 mM KCl, 1,5 mM MgClz 2, och 1 mM färska extra DL-ditiotreitol [DTT], PH = 7,9). Det rekommenderas att ta rören ur dry-ice/ethanol badet en efter en, och för att rengöra botten av röret före tillsats av hypoton buffert.
- Placera på is, och kontrollera kärnor integriteten genom färgning en alikvot av kärnorna fjädring med trypanblått. Kärnor titta runt och blå. Intakt PMN inte får färgas och cellrester visas som blå partiklar av oregelbunden form.
Obs: Om kärnor suspension innehåller många intakta celler eller skräp, är det bättre att kasta förberedelserna och upprepa proceduren med ett annat prov. - Centrifugera kärnor vid 775 xg (3.000 rpm) i mikrocentrifug under 10 minuter i ett kallt rum. Vid denna punkt kärnor är mycket bräcklig och extra försiktighet bör iakttas för att hålla proverna kallt och inte centrifugera vid alltför stora krafter.
- Avlägsna supernatanten genom mycket noggrann pipettering.
- Tillsätt 100 | il kall 4% paraformaldehyd i PBS för att fastställa kärnor.
Obs: Pelleten mycket förlora end. tillsats av bufferten är tillräckligt för att resuspendera kärnorna. Pipettera upp och ned bör undvikas. - Inkubera på is under 20 minuter.
- Immunolabel kärnor för flödescytometri eller behålla dem i upp till 24 timmar vid 4 ° C.
4. Kärnor immunomärkning för flödescytometrianalys
- Centrifugera kärnor vid 1.743 xg (4.500 rpm) i mikrocentrifug under 1 min, och avlägsna supernatanten genom mycket försiktig pipettering.
- Tillsätt 100 | il kall (4 ° C) 0,1% Triton X-100, 4% paraformaldehyd i PBS att permeabilisera kärnor. Inkubera på is under 10 minuter.
- Centrifugera permeabiliseras kärnor vid 1.743 xg i mikrocentrifug och ta försiktigt bort supernatanten. Vid denna punkt kärnor pellets fäster inte bra på botten av röret. Det rekommenderas att centrifugera igen om pelleten lossnar.
- Resuspendera kärnor i 500 | il kall 4% fetalt bovint serum (FBS) i PBS för att blockera icke-specifika bindningsställen, och inkubera på is under 20 minuter. Centrifugkärnor vid 1.743 xg under 3 min i mikrocentrifug och ta försiktigt bort supernatanten.
- Resuspendera kärnor i 100 pl kall PBS innehållande 4% FBS och 2,5 | ig / ml av mAb mot den nukleära faktorn av intresse. Inkubera på is under 20 minuter.
Obs: Vanliga negativa kontroller bör omfatta anti-nukleär faktor antikropp bara, och FITC-märkt sekundär antikropp bara. - Tvätta två gånger med 500 | il kall PBS med 4% FBS och centrifugering vid 1743 x g under 3 minuter.
- Avlägsna supernatanten mycket försiktigt, resuspendera kärnor i 100 | il kall PBS innehållande 4% FBS och 10 pg / ml av den motsvarande FITC-märkt sekundär antikropp, och inkubera på is under 20 minuter.
- Tvätta kärnor två gånger med 500 | il kall PBS med 4% FBS såsom i föregående steg.
- Resuspendera kärnor i 400 | il kall 4% paraformaldehyd i PBS.
Obs: Kärnor placeras i paraformaldehyd för att tillåta provet att lagras under flera dagar utan kontaminationproblem som kan uppstå i närvaro av serum. - Analysera omedelbart genom flödescytometri eller förvara i mörker vid 4 ° C i upp till tre dagar.
5. Flödescytometrianalys
- Analysera immunolabeled kärnor i en flödescytometer sådan en FACScan (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) eller liknande anordning.
- Justera förvärv inställningar: FSC log-skala vid 10-1, SSC vid log-skala 196 och grind kärnor i en dot-plot.
- Förvärva 10.000 kärnor per prov.
- Analysera fluorescens av FITC-färgade kärnor genom FL-1 kanal (506 nm) inställd på log-skala 400.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Reningsmetoden som beskrivs här ger vanligtvis ostimulerade neutrofiler (PMN) med renhet större än 95% (Figur 1A). Isolerade PMN kan sedan stimuleras genom tvärbindning speciella receptorer med specifika monoklonala antikroppar. Vi har stimulerat PMN genom Fc-receptorer och integriner (Figur 1B). När stimuleras, är PMN lyseras och kärnor isoleras med hög avkastning. Kärnorna därefter immunolabeled för en viss nukleär faktor, såsom den nukleära faktorn kB (NF-kB), med specifika antikroppar (figur 1B).
Kärnor kan lätt igen som en annan befolkning från intakt PMN i flödescytometern med en prick-plot (Figur 2A). Vid vila PMN en basal nivå av NF-kB hittas i cellkärnan (fig 2B). Vid stimulering genom tvärbindning β1 integriner, är NF-kB translokeras till kärnan och detta increm ent i nukleär NF-kB detekteras som en ökning i fluorescens (figur 2B). Likaså, stimulering av PMN genom tvärbindning β2 integriner inducerade också NF-KB-aktivering såsom indikeras av en ökning i fluorescens (figur 2C). Känsligheten hos denna metod medger detektering av små förändringar i nukleär faktor nivåer, vilket framgår av det faktum att β1 integriner, vilka binder extracellulära matrisproteiner såsom fibronektin, inducerad starkare NF-KB-aktivering än β2 integriner, vilka binder till adhesionsmolekyler på andra celler (jämför figurerna 2B och 2C).
Denna metod har också använts framgångsrikt för att detektera NF-kB 15 och älg-1 16 nukleära faktorer i isolerade kärnor efter Fc-receptor stimulering av PMN. Denna metod är enkel och ekonomiskt, vilket den lätt kan modifieras för att analysera nukleära faktorer i andra celltyper.
innehåll "fo: keep-together.within-page =" alltid ">
Figur 1. Schematisk representation av neutrofil (PMN) rening från blod, stimulering av celler, isolering av kärnor och immunomärkning av kärntekniska faktorer i isolerade kärnor. A) heparinbehandlade blod blandas med dextran att agglutinera erytrocyter. Efter erytrocyter sediment är leukocyt-rika plasman ovanpå de röda cellerna. Denna leukocyt-rika plasman överförs och skiktas på toppen av Ficoll-Paque i ett annat rör. Efter centrifugering, ett skikt av mononukleära celler (MNC) finns vid gränsytan av plasma och Ficoll-Paque. PMN finns vid botten av röret. B) Isolerad PMN stimuleras genom tvärbindning cell-membranreceptorer med specifika monoklonala antikroppar (mAb) (orange) och en sekundär antikropp (mörkgrön). Nukleär faktor kappa B (NF-kB) separerar från dess inhibitor iKB och translokerar in i kärnan. Kärnorna isoleras sedan, permeabiliserades och immunolabeled mot NF-kB eller annan nukleär faktor med en specifik mAb (gul), och en FITC-märkt sekundär antikropp (ljusgrön). Fast kärnor analyseras med flödescytometri (FACS). Klicka här för att se större bild .
Figur 2. Analys av NF-KB-aktivering i neutrofiler (PMN). A) Intakt PMN (vänstra panelen) eller isolerade kärnor (högra panelen) visas som två distinkta populationer i prick-plott flödescytometriska grafer. Celler och kärnor kan analyseras oberoende avskapa olika grindar, R1 (röd) för intakta celler, och R2 (blå) för isolerade kärnor. B och C) Kärnor isoleras från PMN immunolabeled för NF-kB (p50 subenhet), före (grön streckad linje), eller efter det att cellerna aktiverades genom tvärbindning β1 integriner (B) med den specifika monoklonala antikroppen TS2/16 (blå linje), eller β2 integriner (C) med den specifika monoklonala antikroppen IB4 (röd linje). Den grå området är den basala fluorescensen från FITC-märkt sekundär antikropp enbart.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Reningen här beskrivna metoden medger isolering av ostimulerade neutrofiler (PMN) med renhet större än 95% (bedömas genom mikroskopisk observation), på kort tid. Ibland neutrofiler kan förorenas av erytrocyter om dessa inte lyseras helt. Detta brukar vanligtvis inte påverkar tekniken, eftersom erytrocyter och PMN kan enkelt särskiljas som distinkta cellpopulationer genom flödescytometri. Isolerade PMN kan sedan stimuleras genom tvärbindning speciella receptorer med specifika monoklonala antikroppar. I själva verket kan PMN också stimuleras med farmakologiska medel eller genom vidhäftning till olika substrat eller andra celler. Den metod som presenteras här kan användas för att analysera signaleringsvägar som leder till förändringar av nukleära faktorer i PMN kärnor efter celler aktiveras av praktiskt taget alla relevanta biologiska stimulans.
När PMN stimuleras, ger den metod som beskrivs i detta dokument för att snabbt och efent rening av kärnor och för upptäckt, i dessa kärnor av NF-kB genom immunofluorescens och flödescytometrianalys. Efter PMN stimulering av vissa receptorer, är NF-kB i cytoplasman frigörs från dess inhibitor IkB, och därefter traslocated in i kärnan (figur 1B). Sålunda, är nivån av NF-KB-aktivering bestäms av mängden av NF-KB är närvarande i kärnan. Eftersom denna metod kan detektera och mäta mängden av NF-kB i kärnan, kan den lätt bestämma aktivering av denna nukleär faktor. Förfarandet kan på ett liknande sätt detektera aktivering av andra nukleära faktorer, när deras aktivering är kopplad till förändringar i nukleära nivåer. Aktivera ändringar av nukleära faktorer kan bero på förändringar i mängden av faktor närvarande i kärnan, eftersom det är fallet för NF-KB, eller förändringar såsom fosforylering, i den molekylära strukturen av faktorn, eftersom det är fallet för elk-1. Denna metod kan användas för att detektera CHanges av kärntekniska nivåer av varje molekyl för vilken en specifik antikropp är tillgänglig.
Denna metod ger en ren kärnor befolkning på ett enkelt och snabbt sätt. Celler fryses och lyseras i en hypoton buffert som spränga cellerna öppna och lämnar intakta kärnor. Intakt PMN eller isolerade kärnor visas oftast som två distinkta populationer i dot-plot flödescytometriska grafer. Celler och kärnor kan analyseras oberoende genom att skapa olika grindar för intakta celler, och för isolerade kärnor. I en intakt cellprov en grind skapas runt det område där de flesta celler visas. Likaså med kärnor prov en grind skapas runt det område där de flesta kärnor visas. Normalt är dessa två portar är på olika platser i dot-plot diagram. Partiklar som ibland detekteras från dessa grindar, är vanligtvis cell eller kärnor skräp, och de lämnas ut av analysen. Om cellen och kärnor grindar överlappar, betyder det oftast att kärnor beredningen inte cleen. Analys av detta kärnor preparat inte är tillförlitliga, och det är bättre att upprepa proceduren med nybakade buffertar.
Metoden utvecklades för att arbeta med humant PMN, men det har också med framgång använts för olika cellinjer av leukocyt ursprung 15. Förfarandet kan enkelt anpassas för att isolera kärnor från olika celltyper. Det är viktigt att börja proceduren med ett minimum av 1 x 10 6 celler, för att erhålla tillräckligt kärnor för en effektiv flödescytometrianalys. Om små mängder kärnor erhålls i slutet, är det bättre att rutinmässigt börja metoden med 3 x 10 6 celler.
Under lys steg bör frusna celler inte tillåtas att tina. Detta resulterar i lågt utbyte på grund av cell-nedbrytning. Sålunda, är det rekommenderat att ta ett rör vid en tidpunkt från dry-ice/ethanol badet att lysera celler. Dessutom är det viktigt att torka av utsidan av röret före tillsats av hypoton lysbuffert. När detta inte sker, fryser bufferten ibland i röret, vilket ger en ineffektiv cellys och resulterar i kärnor preparat som är förorenade av intakta celler. Ändå är detta inte ett allvarligt problem eftersom det i de flesta fall intakta celler och kärnor kan separeras genom flödescytometri.
Eftersom kärnor är mycket sköra innan de blir fast, är det viktigt att ha alla buffertlösningar kallt vid 4 ° C genom att hålla dem i is. Efter centrifugering, kärnor pellets ibland löst i botten av röret, bör så extra försiktighet iakttas när du tar bort supernatanten. Detta är bättre gjort med en mikropipett än med vakuumaspiration. Ibland kan röret centrifugeras igen, men de rekommenderade centrifugalkraft bör inte vara överdrivet eftersom detta skadar kärnorna.
Metoden detekterade NF-KB-aktivering med användning av antikroppar specifika för p50-subenheten (figur 2), och also p65 subenheten 15 i denna nukleära faktor. Dessutom var kvantifiering av receptor-initierad nukleär aktivering av ERK och Elk-1 också framgångsrikt uppnås genom denna metod 16, användning av motsvarande specifika antikroppar mot dessa molekyler. Dessutom, känsligheten hos denna metod tillåts detektion av små förändringar i NF-kB nukleära nivåer, på grund av differentiell stimulering av PMN med olika typer av integriner (figur 2), och även på grund farmakologisk hämning av Fc-receptor-initierade signalvägar 16 . Kombinationen av en god specifik antikropp och ett effektivt fluorescensmärkt sekundär antikropp ger stor känslighet och medger detektering av små förändringar i mängden av den nukleära faktorn av intresse inuti kärnor. Detta medger en kvantitativ jämförelse av nivåerna av den nukleära faktorn före och efter olika förhållanden stimulering. Dessutom, kan denna metod detektera i isolerad Nuclei, praktiskt taget varje molekyl mot vilken en god specifik antikropp är tillgänglig. Vidare kan immunomärkning delen förenklas genom användning av en antikropp direkt märkt med fluorochome, som dessutom kommer att förbättra känslighet. Slutligen presenterar metoden stor flexibilitet eftersom många olika fluorochomes kan användas. Sålunda, kan denna metod tillämpas på många olika studier signaltransduktionsmolekyler som inbegriper förändringar av proteinnivåer i kärnan.
Sammanfattningsvis, den breda tillämpligheten och känsligheten hos förfarandet som beskrivs i detta dokument, placera den som ett enkelt och ekonomiskt alternativ för studier signaltransduktionsmolekyler som inbegriper förändringar av proteinnivåer i kärnan av ett flertal celltyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Nancy Mora för hennes hjälp.
Detta arbete har finansierats av forskningsbidrag 48.573-M och 168.098 från Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia, Mexiko och genom bidrag IN212308 och IN205311-2 från Dirección General de Asuntos del personal Academico, Universidad Nacional Autonoma de Mexico, Mexiko.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Heparin | PiSA (Mexico) | ||
| Dextran T500 | Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark) | T1-Dextran T500 | |
| Ficoll-Paque | Pharmacia | 17-0320-01 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S9390 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Cohn Fraction V |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium chloride anhydrous | Sigma | M8266 | |
| DL-dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9163 | |
| Trypan Blue (0.4 % solution) | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10437-028 | |
| Monoclonal antibody IV.3 | Medarex (Annandale, NJ) | 025-1 | Human-specific anti-FcRII (CD32) |
| Monoclonal antibody 3G8 | Medarex (Annandale, NJ) | 028-2 | Human-specific anti-FcRIII (CD16) |
| Monoclonal antibody TS2/16 | Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA) | Donated by Dr. Martin Hemler | Human-specific anti-β1 integrin (CD29) |
| Monoclonal antibody IB4 | University of California, San Francisco | Donated by Dr. Eric J. Brown | Human-specific anti-β2 integrin (CD18) |
| F(ab')2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55468 | |
| FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55522 | |
| FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55665 | |
| Anti-NF-κB p50 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-114 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-NF-κB p65 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-109 | Rabbit polyclonal antibody |
| EQUIPMENT | |||
| 15-ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 50-ml centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Centrifuge, Sorvall Tabletop | Dupont Instruments | RT 6000D | |
| pH-meter | Corning | 340 | |
| Pipetman pipette P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman pipette P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman pipette P-1000 | Gilson | F123602 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse E600 | |
| Inverted microscope | Nikon | TMS | |
| Water Bath Incubator | Fisher Scientific | 2IS-M | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5414C | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Flow Cytometer | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) | FACScalibur | |
References
- Sendo, F., et al. Regulation of neutrophil apoptosis: its biological significance in inflammation and the immune response. Human Cell. 9, 215-222 (1996).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
- Naussef, W. M. How human neutrophils kill and degrade microbes. An integrated view. Immunol. Rev. 219, 88-102 (2007).
- Scapini, P., et al. The neutrophil as a cellular source of chemokines. Immunol. Rev. 177, 195-203 (2000).
- Hamilton, T., et al. Cell type- and stimulus-specific mechanisms for post-transcriptional control of neutrophil chemokine gene expression. J. Leukoc. Biol. 91, 377-383 (2012).
- Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol. Rev. 193, 101-110 (2003).
- Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W.
- Witko-Sarsat, V., Pederzoli-Ribeil, M., Hirsch, E., Sozzani, S., Cassatella, M. A. Regulating neutrophil apoptosis: new players enter the game. Trends Immunol. 32, 117-124 (2011).
- Green, D. R. Death and NF-κB in T cell activation: life at the edge. Mol. Cell. 11, 551-552 (2003).
- Papa, S., Zazzeroni, F., Pham, C. G., Bubici, C., Franzoso, G. Linking JNK signaling to NF-κB: a key to survival. J. Cell Sci. 117, 5197-5208 (2004).
- Valente, P., et al. TNF increases camptothecin-induced apoptosis by inhibition of NF-κB. Eur. J. Cancer. 39, 1468-1477 (2003).
- Choi, M., et al. Inhibition of NF-κB by a TAT-NEMO-binding domain peptide accelerates constitutive apoptosis and abrogates LPS-delayed neutrophil apoptosis. Blood. 102, 2259-2267 (2003).
- Wang, K., et al. Inhibition of neutrophil apoptosis by type 1 IFN depends on cross-talk between phosphoinositol 3-kinase, protein kinase C-d, and NF-κB signaling pathways. J. Immunol. 171, 1035-1041 (2003).
- Schnoor, M., et al. Efficient non-viral transfection of THP-1 cells. J. Immunol. Meth. 344, 109-115 (2009).
- Garcia-Garcia, E., Rosales, C. Nuclear factor activation by FcγR in human peripheral blood neutrophils detected by a novel flow cytometry-based method. J. Immunol. Meth. 320, 104-118 (2007).
- Garcia-Garcia, E., Nieto-Castaneda, G., Ruiz-Saldana, M., Mora, N., Rosales, C. FcγRIIA and FcγRIIIB mediate nuclear factor activation through separate signaling pathways in human neuthophils. J. Immunol. 182, 4547-4556 (2009).
