Summary
Nötrofiller, kan içinde en bol bulunan lökositlerin vardır. Nötrofiller proinflamatuar sitokinlerin ve apopitoz inhibisyonu üretimi gibi transkripsiyonel düzenlenir fonksiyonları sahip. Bu işlevler izole çekirdeklerinde flow sitometri ile nükleer faktörlerin tespiti ve ölçümü sağlar Burada sunulan yöntem ile ele alınabilir
Abstract
Nötrofiller periferik kanda en bol lökosit vardır. Bu hücreler böylece mikroorganizmaların işgalci karşı ilk savunma hattı olma, inflamasyon ve enfeksiyon sitelerinde görünmesini ilk. Nötrofiller gibi fagositoz, parçalayıcı enzimlerin salınımı, ve reaktif oksijen türlerinin üretimi gibi önemli antimikrobiyal fonksiyonları sahip. Bu önemli savunma işlevlerine ek olarak, nötrofillerin proinflamatuar sitokinlerin ve apopitoz inhibisyonu üretimi gibi enfeksiyonuna yanıt olarak diğer görevleri yerine getirir. Sitokinler enfeksiyonu temizlemek yardımcı olan diğer lökositler işe ve apopitoz inhibisyonu nötrofil enfeksiyon yerinde uzun yaşamalarını sağlar. Bu işlevler, transkripsiyon seviyesinde düzenlenir. Nötrofiller kısa ömürlü hücreler çünkü herhangi bir verimli olduğu için Bununla birlikte, bu hücreler içinde transkripsiyonel yanıtlar düzenlenmiş bir çalışma geleneksel raportör gen yöntemler ile gerçekleştirilemezNötrofil transfeksiyon için cient teknikleri. Burada, flow sitometri ile izole ve immunolabeled çekirdeklerindeki nükleer faktörlerin tespiti ve ölçümü sağlayan basit ve etkili bir yöntem sunuyoruz. Biz insan periferik kan saf nötrofilleri izole teknikleri tanımlamak, anti-reseptör antikorları ile bu hücreleri uyarmak yalıtmak ve immunolabel çekirdekler ve flow sitometri ile çekirdekler analiz. Yöntem başarılı bir şekilde nötrofiller ve diğer hücre türleri çekirdeklerinde NF-KB ve Elk-1 nükleer faktör tespit etmek için kullanılmıştır. Bu yüzden, bu yöntem, hücre tiplerinde izole edilen çekirdeklerin içinde transkripsiyon faktörlerinin aktivasyonu analiz etmek için bir seçenek oluşturmaktadır.
Introduction
Nötrofiller, periferik kan 1. en bol bulunan lökositlerin vardır. Inflamasyon ve enfeksiyon nötrofiller sırasında onlar savunma 2 ilk satırı olarak hareket nereye etkilenen sitesinde görünmeye ilk hücrelerdir. Nötrofiller fagositoz, reaktif oksijen türlerinin üretimi, degranülasyonu tarafından parçalayıcı enzimlerin salınımı, ve 4,5 proinflamatuar sitokinlerin üretimi dahil olmak üzere birçok antimikrobiyal mekanizmaları 3 sahiptirler. Nötrofiller hızla çeşitli hücre yüzey reseptörler aracılığıyla aktif olsun kısa ömürlü hücrelerdir. Nötrofiller, kısa ömrü nedeniyle terminali hücreler sayılır ve inflamatuar süreç 6 sırasında aktive sürece apoptoz geçmesi, çünkü onlar da belirli genlerin transkripsiyon düzeyini değiştirerek onların fenotip değiştirebilirsiniz artık açıktır olmasına rağmen. Sitokinler 5 ve apoptoz ile 7,8 inhibisyonu üretim iki tanesi important aktivasyonu-bağımlı hücre fonksiyonlarını nötrofillerde transkripsiyon seviyesinde düzenlenir. Nükleer faktör kappa B (NF-kB) sitokin üretimi 4 transkripsiyonel kontrolü ve hücre canlılığı ve çeşitli hücre tiplerinde apoptoz 9-11 düzenlenmesinde katılır.
Nükleer faktör aktivasyonu neden sinyal yollarının genellikle muhabir gen deneyleri veya elektroforetik hareketlilik kayma analizi (EMSA) tarafından incelenmiştir. Nötrofiller kısa ömürlü hücreler, çünkü nötrofil transfeksiyon için bir etkili teknikler vardır Bununla beraber, bu hücreler içinde transkripsiyonel yanıtlar düzenlenmiş çalışması, haberci gen deneyleri ile gerçekleştirilemez. EMSA deneyleri nükleer faktör aktivasyon 12,13 keşfetmek için nötrofillerin kullanılmış olan, bu radyoaktif maddelerin kullanımı içerir çünkü ancak bu yöntem karmaşık ve pahalıdır. Nucleofection successfu kullanılmış olan diğer bir tekniktirlly monositler 14 transferinde. Böylece, en azından teoride, nükleer faktör aktivasyonu (düşük verimlilik rağmen) transfeksiyon tarafından nötrofil tespit edilebilir. Bununla birlikte, bu yöntem daha pahalı ve zaman alıcı bir olasılıkla daha az miktar olacaktır. Immunohistokimyasal hücrelerin mikroskopik analiz aynı zamanda çekirdek içinde nükleer faktör tespit etmek için kullanılabilir. Nitekim, biz çekirdeği bu şekilde 15 içine NF-KB translokasyon tespit ettik. Ne yazık ki, bu tekniğin ayrıca, zaman alıcı az nicel ve gözlemcinin önyargı tabidir.
Burada, flow sitometri ile izole ve immunolabeled çekirdeklerindeki nükleer faktörlerin tespiti ve ölçümü sağlayan basit ve etkili bir yöntem sunuyoruz. Biz insan periferik kan nötrofillerin izole teknikleri tanımlamak, (F, anti-reseptör antikorları ile integrinler veya Fc reseptörleri aracılığıyla bu hücreleri uyarmak yalıtmak ve immunolabel çekirdekler ve flow sitometri ile çekirdekler analizŞEKIL 1). Yöntem başarılı bir NF-KB 15 ve nötrofil çekirdekler Elk-1 16 nükleer faktör tespit etmek için kullanılmıştır. Bu yöntemin duyarlılığı çekirdek içinde nükleer faktör seviyeleri küçük değişiklikleri algılama izin verir. Bu yöntem ayrıca diğer hücre tipleri arasından çekirdeklerinde transkripsiyon faktörlerinin düzeyini analiz etmek için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. İnsan Kanı gelen Nötrofiller İzolasyonu (PMN)
- Pıhtılaşma önleyici olarak heparin (10 U / ml) ile 20 ml insan kanı kullanın. Kan venopuncture tarafından sağlıklı yetişkin gönüllüler toplanmıştır. UNAM - Tüm deneyler Instituto de INVESTIGACIONES Biomédicas de Biyoetik Komitesi onayı altında yapılmıştır.
- 15 ml konik santrifüj tüpü içine PBS içinde% 6 dekstran T500, 2 ml koyun ve kan 10 ml eklenir. Ters tüp ile iki veya üç kez karıştırın ve eritrosit sedimantasyon için izin vermek için 45 dakika bekletin.
- Taze bir 15 ml konik santrifüj tüpünde 5 ml Ficoll-Paque koydu.
- Sedimanlaşmış eritrositler üzerinde oluştuğunu lökosit zengin plazma alın ve dikkatlice ikinci bir katman oluşturan Ficoll-Paque üstüne Pipeti. Iki faz vardır emin olun.
- 4 ° C'de 20 dakika süre ile 516 x g'de santrifüjleyin Santrifüjlemeden sonra, plazma ve Ficoll-Paque bir ara yüzeyinde mononükleer hücrelerin bir tabakası vardır. Neutrophils tüpün alt tarafında yer alır.
- Süpernatant ortadan kaldırır, bir raf karşı tüp dokunarak hücre peleti kırmak ve 10 ml soğuk (4 ° C) PBS Not eklenerek hücrelerin tekrar süspansiyon:. Yukarı pipetleme hücreleri resuspending ve bu da olduğu aşağı tavsiye edilmez hücrelere zarar.
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 290 xg'de 50 ml konik santrifüj tüpü ve santrifüj hücre süspansiyonu aktarın
- Daha önce olduğu gibi hücre peleti kırmak ve 10 mL soğuk (4 ° C), eritrositlerin lyse hipotonik çözelti (% 0.2 NaCl,% 1 BSA, 20 mM Hepes, pH = 7.4) ekleyin. Tam bir dakika boyunca elle tüpü yavaşça dönen çevirerek karıştırın.
- 10 ml soğuk (4 ° C) hipertonik çözelti (% 1.6 NaCl,% 1 BSA, 20 mM Hepes, pH değeri = 7.4) karışımı ve bir hemositometre kullanılarak hücrelerin sayısı (genellikle>% 95 PMN vardır). Ekleme
Not: hücrelerin sayılması sırasında buz üzerinde hücre süspansiyonu ile tüp tutun. - Daha önce olduğu gibi santrifüjden sonra tekrar süspansiyon 10 PMNSoğuk 7 hücre / ml (4 ° C) PBS ile yıkandı. Buz üzerinde tutun.
Not: Nötrofiller 4 de yaşatılabilir ve işlevsel kalır yaklaşık 6 ila 8 saat boyunca ° C.
2. PMN etkinleştirilmesi
- 100 PMN süspansiyon ul (1 x 10 7 hücre / ml) 1.5 ml Eppendorf tüp içine koymalısınız.
Not: Örnek tüpleri en azından çiftleri halinde yapılmalıdır. Olağan negatif kontroller yalnızca ilk antikor ve sekonder antikor içermelidir. - 10 ug / ml 'de karşılık gelen anti-integrin ya da anti-Fc reseptörü monoklonal antikor (mAb) ekleyin ve 15 dakika süreyle buz üzerinde inkübe edilir.
- 1 ml soğuk (4 ° C) PBS, bir mikrosantrifüj içinde 1,743 x g'de (4500 rpm) santrifüje tabi tutarak, ve süpernatan aspire. Eklenmesi ile yıkayın PMN
- Bir raf karşı tüpün alt dokunarak hücre peleti Break, 1 ml soğuk PBS ekleyin ve iki kez daha, önceki adımda olduğu gibi yıkayın.
Not: Bu ilişkisiz antikor kaldırmak yıkar. - Aynı süspanse PMN (inılık itial) hacim (37 ° C) PBS F 60 ug / ml (ab ') 2 keçi anti-fare IgG içeren.
Not: ikincil anti-fare IgG antikoru ilk anti-reseptör antikor bağlanacaktır ve reseptör ile çapraz neden olur. - İlgi nükleer faktör bağlı olarak 1 ila 20 dakika, 37 ° C'de inkübe edin. NF-KB, genellikle 15 dakika için, ve genellikle Elk-1 5 dak.
Not: 37 hücreleri inkübe 4 yer alamaz ° C baskılanması reseptör çapraz, ° C - 1 ml soğuk PBS ekleyin ve mikrosantrifüj yılında 1.743 x g'de 3 dakika santrifüj.
- Süpernatantı
- Dry-ice/ethanol banyosunda hemen PMN ve 10 dakika boyunca onları orada tutmak dondurun.
3. Çekirdeğin İzolasyon ve Fiksasyon
- 100 ul soğuk içinde süspanse dondurulmuş PMN pellet (4 ° C), hipotonik tampon maddesi (10 mM HEPES, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, ve 1 mM taze katma DL-ditiyotretol [DTT]; PH = 7.9). Bu bir tarafından dry-ice/ethanol banyo biri tüp çıkarmak için, ve hipotonik tampon eklemeden önce tüpün alt silin tavsiye edilir.
- Buz üzerine yerleştirin ve tripan mavisi ile çekirdeklerin süspansiyonu bir kısım boyanarak çekirdeklerin bütünlüğünü kontrol edin. Çekirdekler yuvarlak ve mavi görünüyor. Bozulmamış PMN lekeli ve hücre artıkları Düzensiz şekilli mavi parçacıklar olarak görünür alamadım.
Not: çekirdekler askı birçok sağlam hücreler veya enkaz içeriyorsa, hazırlık atmak ve başka bir örneği ile işlemi tekrarlayın daha iyidir. - Soğuk bir oda içinde 10 dakika süreyle mikrosantrifüj 775 xg (3.000 rpm) çekirdekler santrifüjleyin. Bu noktada çekirdekler anda çok kırılgan ve ekstra bakım örnekler soğuk ve aşırı güçler santrifüj değil tutmak alınmalıdır vardır.
- Çok dikkatli pipetleme tarafından süpernatant çıkarın.
- Çekirdekler düzeltmek için PBS içinde soğuk% 4 paraformaldehid 100 ul ekleyin.
Not: pelet çok bir gevşek bird arabellek ekleyerek çekirdekleri tekrar süspansiyon için yeterlidir. Aşağı yukarı pipetleme ve kaçınılmalıdır. - 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
- Immunolabel Akım sitometri için çekirdekleri veya 4 yukarı 24 saat için onları tutmak ° C
4. Akım Sitometri Analiz Çekirdekler immün
- 1 dakika mikrosantrifüj yılında 1,743 xg (4.500 rpm) nükleuslu santrifüjleyin ve çok nazik pipetleme tarafından süpernatant kaldırmak.
- 100 ul soğuk (4 ° C)% 0.1 Triton X-100, çekirdeğin geçirgenliği PBS içinde% 4 paraformaldehid. Ekleme 10 dakika buz içinde inkübe edin.
- Santrifüj mikrosantrifüj yılında 1.743 xg'de nükleuslu permeabilize ve dikkatlice süpernatant kaldırmak. Bu noktada çekirdekler granül tüpün alt kısmında da binmemelidir. Bu pelet gevşek alırsa tekrar santrifüj önerilir.
- Spesifik olmayan bağlanma yerleri blok, ve 20 dakika süreyle buz üzerinde inkübe soğuk PBS içinde% 4 fetal bovin serumu (FBS), 500 ul içinde süspanse çekirdekleri. Santrifüj1.743 at çekirdekler mikrosantrifüj 3 dakika xg ve dikkatlice süpernatant kaldırmak.
- 4% FBS ve 2.5 mikrogram / ilgi nükleer faktör karşı mAb ml içeren soğuk PBS 100 ul çekirdekleri tekrar. 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
Not: Her zamanki negatif kontrolleri yalnızca anti-nükleer faktör antikoru içerir ve FITC-etiketli sekonder antikoru sadece olmalıdır. - 4% FBS ve 3 dk süreyle 1743 xg'de santrifüj ile soğuk PBS 500 ul ile iki kez yıkayın.
- % 4 FBS ve 10 ug / karşılık gelen ikincil FITC-etiketlenmiş antikor ml'lik soğuk PBS içinde 100 ul, çok dikkatli bir şekilde tekrar süspansiyon çekirdekler süpernatantı, ve 20 dakika süreyle buz üzerinde inkübe edilir.
- Önceki aşamada olduğu gibi% 4 FBS ile soğuk PBS 500 ul ile iki kez çekirdekler yıkayın.
- PBS içinde soğuk% 4 paraformaldehid 400 ul çekirdekleri tekrar.
Not: Çekirdek numune kontaminasyonu olmaksızın birkaç gün boyunca saklanır izin verecek şekilde yerleştirilir paraformaldehitserum varlığında meydana gelen sorunlar. - Üç gün için 4 de flow sitometri veya karanlıkta mağaza ° C tarafından hemen analiz edin.
5. Akış Sitometri Analizi
- Veya benzeri cihazlar; akış sitometresinin böyle bir FACScan (Franklin Lakes, NJ Becton Dickinson) olarak immunolabeled çekirdekleri analiz edin.
- 196 de log-ölçekte SSC ve bir nokta-arsa kapısı çekirdekleri, 10-1 de log-ölçekte FSC:, satın alma ayarları yapın.
- Numune başına on bin çekirdekler edinin.
- 400 log-ölçekte belirlenen FL-1 kanal (506 nm) ile FITC-lekeli çekirdeklerin floresans analiz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Saflaştırma yöntemi burada açıklanan genellikle% 95 (Şekil 1A) daha büyük saflık ile uyarılmamış nötrofiller (PMN) sağlar. İzole PMN sonra spesifik monoklonal antikorlar ile çapraz bağlama belirli reseptörler ile stimüle edilebilir. Biz Fc reseptörleri ve integrinler (Şekil 1B) ile PMN canlandırmıştır. Bir kez uyarılan PMN lize ve çekirdekler yüksek verimle izole edilmektedir. Çekirdekler sonra bu özel antikorlar ile nükleer faktör kappa B (NF-KB) (Şekil 1B) gibi, belirli bir nükleer faktörü için immunolabeled edilir.
Çekirdekler kolayca bir nokta-arsa (Şekil 2A) ile akış sitometresi bozulmamış PMN farklı bir popülasyon olarak kabul edilebilir. Dayanma PMN olarak NF-KB, bir bazal hücre çekirdeğine (Şekil 2B) bulunur. Çapraz β1 integrinler tarafından uyarılması üzerine, NF-KB çekirdek ve bu increm için transloke edilir Nükleer NF-KB in ent floresans (Şekil 2B) bir artış olduğu tespit edilmiştir. Flöresanlı (Şekil 2C) bir artış ile gösterildiği gibi Benzer şekilde, çapraz bağlama β2 integrinler tarafından PMN uyarılması da NF-KB aktivasyonunu indüklenen. Bu yöntemin duyarlılığı sağlayan gerçeği ile kanıtlandığı gibi nükleer faktör seviyeleri küçük değişiklikleri algılama şekilde, diğer hücreler üzerinde yapışma molekülleri bağladığı β2 integrinler, daha fibronektin, indirgenmiş güçlü bir NF-KB aktivasyonu gibi hücre dışı matris proteinlerine bağlama β1 integrinler, (Şekil 2B ve 2C karşılaştırın).
Bu yöntem de başarıyla PMN Fc reseptör uyarılması sonra NF-KB 15 ve izole çekirdekler Elk-1 16 nükleer faktör tespit etmek için kullanılmıştır. Bu yöntem daha basit ve ekonomik, bu nedenle kolayca diğer hücre tiplerinde in nükleer faktör analiz etmek için modifiye edilebilir.
içeriği "fo: keep-together.within-page =" always ">
Şekil 1. Şematik kan nötrofil (PMN) arıtma temsil, hücrelerinin uyarılması, çekirdeklerin izolasyonu ve izole çekirdeklerindeki nükleer faktörlerin immün. A) Heparin ile tedavi edilen kan eritrositler agglutinate'e dekstran ile karıştırılır. Eritrosit sediman sonra lökosit zengin plazma alyuvar üstünde. Bu lökosit zengin plazmanın bir başka tüpe aktarılır ve Ficoll-Paque üstüne serilir. Santrifüjlemeden sonra, mononükleer hücre (MNC) bir katman plazma ve Ficoll-Paque bir ara yüzeyinde bulunur. PMN tüpün alt tarafında bulunur. B) İzole PMN çapraz bağlı hücre membran spesifik monoklonal antikorlar ile reseptörleri (mAb) (turuncu) ve bir ikincil antikor (koyu yeşil tarafından uyarılır). Nükleer faktör kappa B (NF-KB) nükleusa inhibitörü IkB ve translocates ayrılır. Çekirdekler, daha sonra izole permeabilize ve NF-KB ya da bir spesifik mAb (sarı) ile başka nükleer faktörü ve bir FITC-etiketlenmiş sekonder antikor (açık yeşil) karşı immunolabeled edilir. Sabit çekirdekler flow sitometri (FACS) tarafından analiz edilir. büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2.. Nötrofiller (PMN) NF-KB aktivasyonu analizi. A) Bozulmamış PMN (sol panel) veya izole çekirdeklerin (sağ panel) akım sitometri nokta-plot grafikleri iki ayrı nüfus olarak görünür. Hücreler ve çekirdekleri tarafından bağımsız olarak analiz edilebilirsağlam hücreler için R1 (kırmızı) ve izole çekirdeklerinin R2 (mavi), farklı kapıları yaratmak. PMN izole B ve C) Çekirdek (yeşil kesikli çizgi) önce, NF-KB (p50 alt ünitesi) için immunolabeled veya hücreleri sonrasında edildi ile aktive edildi çapraz-bağlayıcı (B) TS2/16 (mavi çizgi) spesifik monoklonal antikor ile β1 integrinler, spesifik monoklonal antikor IB4 (kırmızı çizgi) ya da β2 integrinler (C). Gri alan yalnız FITC-etiketli sekonder antikoru gelen bazal floresans olduğunu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada anlatılan arınma yöntemi kısa bir süre içinde% 95 (mikroskobik gözlem yoluyla belirlenmiştir), daha yüksek saflıkta uyarılmamış nötrofillerin izolasyonu (PMN) verir. İkincisi tamamen lize değilseniz Bazen nötrofiller eritrositler kirlenmiş olabilir. Eritrositler ve PMN kolayca flow sitometri ile farklı hücre popülasyonlarının olarak ayırt edilebilir çünkü bu, genellikle, teknik etkilemez. İzole PMN sonra spesifik monoklonal antikorlar ile çapraz bağlama belirli reseptörler ile stimüle edilebilir. Aslında, PMN da farmakolojik yöntemlerle veya çeşitli yüzeyler ya da diğer hücrelere yapışma ile stimüle edilebilir. Burada sunulan yöntem hücrelerin hemen hemen herhangi bir ilgili biyolojik uyarıcı tarafından aktive edildikten sonra PMN çekirdeklerin içinde nükleer faktör değişikliklere yol açan sinyal yollarının analiz etmek için de kullanılabilir.
PMN stimüle edildikten sonra, bu yazıda anlatılan yöntem hızlı ve verimliliæi sağlarimmünofloresan ve akış sitometrisi analizi ile NF-KB bu çekirdek içinde çekirdeklerin ve tespiti için ent saflaştırma,. Bazı reseptörlerinin uyarılması PMN sonra, sitoplazma içinde NF-KB inhibitörleri IkB kendi serbest bırakılır, ve daha sonra nüve (Şekil 1B) içine traslocated. Böylece, NF-KB aktivasyonunun seviye çekirdek içinde NF-KB mevcut miktarı ile tespit edilir. Bu yöntem, çekirdek olarak NF-KB miktarını tespit etmek ve ölçmek için, kolayca bu nükleer faktör aktivasyonu belirleyebilir. Bunların aktivasyon nükleer seviyelerindeki değişiklikler ile bağlanmış olması durumunda yöntem, benzer bir şekilde başka nükleer faktör aktivasyonu tespit edebilir. Bunun için olduğu gibi, ya da faktör moleküler yapı içinde bu tür fosforilasyon gibi değişiklikler, nükleer faktör değişiklikler aktive o NF-kB için olduğu gibi, çekirdek içinde faktör mevcut miktarında değişikliklere bağlı olabilir, Elk-1. Bu yöntem, c tespit etmek için kullanılabilmektedirBelirli bir antikor mevcut olduğu herhangi bir molekül nükleer seviyeleri hanges.
Bu yöntem, hızlı ve basit bir şekilde bir saf çekirdekleri nüfus verir. Hücreler hücreleri yarıldı ve sağlam çekirdekleri bırakır hipotonik bir tampon içinde donmuş ve parçalanır. Bozulmamış PMN veya izole çekirdekler genellikle akım sitometri dot-plot grafikleri iki ayrı nüfus olarak görünür. Hücreler ve çekirdekler bozulmamış hücreler için, izole edilmiş ve çekirdeklerinin farklı kapılar oluşturarak bağımsız olarak analiz edilebilir. Sağlam bir hücre örneği bir kapısı çoğu hücreleri görünür alanı etrafında oluşturulur. Benzer şekilde, bir çekirdekler numune ile bir kapı en çekirdekler görünür alanı çevresinde oluşturulur. Normalde bu iki kapısı nokta-arsa grafiğin farklı yerlerde bulunmaktadır. Bazen bu kapılardan dışarı algılanır Parçacıklar, genellikle hücre veya çekirdeklerin enkaz ve bunlar analiz dışında bırakılmıştır. Hücre ve çekirdekleri kapıları çakışırsa, genellikle çekirdeklerin hazırlık cle olmadığı anlamına gelirBir. Bu çekirdeklerin hazırlık Analizi güvenilir değildir ve taze yapılmış tamponları ile işlemi tekrarlayın daha iyidir.
Bu yöntem, insan PMN ile birlikte çalışmak için geliştirilmiştir, fakat aynı zamanda başarılı bir şekilde lökosit kaynaklı 15, çeşitli hücre dizileri ile tatbik edilmiştir. Metod farklı hücre tiplerinden izole çekirdekleri için adapte edilebilir. Bu, etkin bir akış sitometrisi analizleri için yeterli çekirdekleri elde etmek için, 1 x 10 6 hücre olan en az işlemine başlamak için önemlidir. Çekirdeklerin küçük numaralar sonunda elde edilirse, bu rutin 3 x 10 6 hücre ile yöntemine başlamak daha iyidir.
Lizis adım sırasında, donmuş hücreleri erimeye izin verilmemelidir. Hücre bozulması nedeniyle düşük bir verim elde edilir. Böylece, hücrelerin lyse dry-ice/ethanol banyo dışına bir defada bir tüp almak için tavsiye edilir. Ayrıca, hipotonik parçalama eklemeden önce borunun dış silin önemlidirtampon. Bu yapılmazsa zaman, tampon bazen verimsiz hücre lizis veren ve sağlam hücreler tarafından kontamine çekirdeklerin hazırlıkları sonuçlanan tüp içinde donuyor. Yine de, bu durumda en çok sağlam hücreler ve çekirdekler akış sitometrisi ile ayrılması göz önüne alındığında önemli bir sorun değildir.
Onlar sabit olsun önce çekirdeklerin çok kırılgan olduğundan, buz tutarak 4 ° C'de tüm tampon çözeltiler soğuk olması önemlidir. Süpernatant çıkarırken Santrifüjlemeden sonra, çekirdeklerin granül tüpün alt bazen gevşek, bu yüzden ilave dikkat edilmelidir. Bu daha iyi vakum aspirasyon ile daha bir mikropipet ile yapılır. Bazı durumlarda, tüp tekrar santrifüje edilebilir, ancak bu zarar çekirdekleri için önerilen santrifüj kuvvetleri fazla olmamalıdır.
Yöntem tespit NF-KB p50 alt birimi (Şekil 2) için spesifik antikorları kullanarak etkinleştirme ve alsp65 alt ünitesi bu nükleer faktör 15 o. Ayrıca, ERK ve Elk-1 tarafından başlatılan bir nükleer reseptör aktivasyonunun miktarının da başarılı bir şekilde bu moleküller karşı gelen spesifik antikorları kullanarak, bu yöntem, 16 elde edildi. Buna ek olarak, Fc, farmakolojik inhibisyonuna bağlı olarak, aynı zamanda küçük integrinler farklı (Şekil 2) göre PMN ayırıcı uyarılmasına bağlı NF-KB nükleer seviyeleri değişiklikler, ve bu yönteme izin algılama hassasiyeti sinyal yollarının 16 reseptörü tarafından başlatılan . İyi bir spesifik antikor ve verimli bir floresan-etiketli ikincil antikor bileşimi büyük bir hassasiyet sağlayan ve çekirdeklerin içinde ilgilenilen nükleer faktör miktarı küçük değişikliklerin algılanması için olanak sağlar. Bu, çeşitli uyarım koşulları önce ve sonra nükleer faktör seviyelerinin niceliksel bir karşılaştırma izin verir. Ayrıca, bu metod izole nu içinde tespit edebilirclei, iyi bir spesifik antikor mevcut olduğu karşı hemen hemen herhangi bir molekül. Buna ek olarak, immün parçası doğrudan ek olarak duyarlılık artıracak fluorochome, etiketlenmiş bir antikor kullanılarak basitleştirilebilir. Birçok farklı fluorochomes kullanılabilir, çünkü Son olarak, büyük bir esneklik yöntem sunar. Bu nedenle, bu yöntem, çekirdek içinde protein seviyelerinin içeren bir çok farklı sinyal transdüksiyon çalışmaları için de uygulanabilir.
Sonuç olarak, bu yazıda anlatılan yöntemin geniş uygulanabilirlik ve duyarlılık, hücre tipleri çeşitli çekirdeğindeki protein düzeylerinin değişiklikleri içeren sinyal iletimi çalışmaları için basit ve ekonomik bir seçenek olarak yerleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Yazarlar onun teknik yardım için Nancy Mora teşekkür etmek istiyorum.
Bu çalışma Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia, Meksika, araştırma destekleri 48573-M ve 168098 tarafından hibe IN212308 ve IN205311-2 Direccion General de Asuntos del Kişisel Academico, Universidad Nacional Autonoma de Mexico, Meksika tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Heparin | PiSA (Mexico) | ||
| Dextran T500 | Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark) | T1-Dextran T500 | |
| Ficoll-Paque | Pharmacia | 17-0320-01 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S9390 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Cohn Fraction V |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium chloride anhydrous | Sigma | M8266 | |
| DL-dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9163 | |
| Trypan Blue (0.4 % solution) | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10437-028 | |
| Monoclonal antibody IV.3 | Medarex (Annandale, NJ) | 025-1 | Human-specific anti-FcRII (CD32) |
| Monoclonal antibody 3G8 | Medarex (Annandale, NJ) | 028-2 | Human-specific anti-FcRIII (CD16) |
| Monoclonal antibody TS2/16 | Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA) | Donated by Dr. Martin Hemler | Human-specific anti-β1 integrin (CD29) |
| Monoclonal antibody IB4 | University of California, San Francisco | Donated by Dr. Eric J. Brown | Human-specific anti-β2 integrin (CD18) |
| F(ab')2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55468 | |
| FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55522 | |
| FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55665 | |
| Anti-NF-κB p50 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-114 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-NF-κB p65 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-109 | Rabbit polyclonal antibody |
| EQUIPMENT | |||
| 15-ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 50-ml centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Centrifuge, Sorvall Tabletop | Dupont Instruments | RT 6000D | |
| pH-meter | Corning | 340 | |
| Pipetman pipette P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman pipette P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman pipette P-1000 | Gilson | F123602 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse E600 | |
| Inverted microscope | Nikon | TMS | |
| Water Bath Incubator | Fisher Scientific | 2IS-M | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5414C | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Flow Cytometer | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) | FACScalibur | |
References
- Sendo, F., et al. Regulation of neutrophil apoptosis: its biological significance in inflammation and the immune response. Human Cell. 9, 215-222 (1996).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33, 657-670 (2010).
- Naussef, W. M. How human neutrophils kill and degrade microbes. An integrated view. Immunol. Rev. 219, 88-102 (2007).
- Scapini, P., et al. The neutrophil as a cellular source of chemokines. Immunol. Rev. 177, 195-203 (2000).
- Hamilton, T., et al. Cell type- and stimulus-specific mechanisms for post-transcriptional control of neutrophil chemokine gene expression. J. Leukoc. Biol. 91, 377-383 (2012).
- Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol. Rev. 193, 101-110 (2003).
- Akgul, C., Moulding, D. A., Edwards, S. W.
- Witko-Sarsat, V., Pederzoli-Ribeil, M., Hirsch, E., Sozzani, S., Cassatella, M. A. Regulating neutrophil apoptosis: new players enter the game. Trends Immunol. 32, 117-124 (2011).
- Green, D. R. Death and NF-κB in T cell activation: life at the edge. Mol. Cell. 11, 551-552 (2003).
- Papa, S., Zazzeroni, F., Pham, C. G., Bubici, C., Franzoso, G. Linking JNK signaling to NF-κB: a key to survival. J. Cell Sci. 117, 5197-5208 (2004).
- Valente, P., et al. TNF increases camptothecin-induced apoptosis by inhibition of NF-κB. Eur. J. Cancer. 39, 1468-1477 (2003).
- Choi, M., et al. Inhibition of NF-κB by a TAT-NEMO-binding domain peptide accelerates constitutive apoptosis and abrogates LPS-delayed neutrophil apoptosis. Blood. 102, 2259-2267 (2003).
- Wang, K., et al. Inhibition of neutrophil apoptosis by type 1 IFN depends on cross-talk between phosphoinositol 3-kinase, protein kinase C-d, and NF-κB signaling pathways. J. Immunol. 171, 1035-1041 (2003).
- Schnoor, M., et al. Efficient non-viral transfection of THP-1 cells. J. Immunol. Meth. 344, 109-115 (2009).
- Garcia-Garcia, E., Rosales, C. Nuclear factor activation by FcγR in human peripheral blood neutrophils detected by a novel flow cytometry-based method. J. Immunol. Meth. 320, 104-118 (2007).
- Garcia-Garcia, E., Nieto-Castaneda, G., Ruiz-Saldana, M., Mora, N., Rosales, C. FcγRIIA and FcγRIIIB mediate nuclear factor activation through separate signaling pathways in human neuthophils. J. Immunol. 182, 4547-4556 (2009).
