Summary
Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes no sangue. Os neutrófilos possuem funções transcricionalmente regulados tais como a produção de citocinas pró-inflamatórias e inibição da apoptose. Estas funções podem ser estudadas com o método aqui apresentado, o que permite a detecção e quantificação dos factores nucleares por citometria de fluxo em núcleos isolados
Abstract
Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes no sangue periférico. Estas células são os primeiros a aparecer nos locais de inflamação e à infecção, tornando-se a primeira linha de defesa contra microorganismos invasores. Os neutrófilos possuem importantes funções antimicrobianas, tais como fagocitose, a libertação de enzimas líticas e produção de espécies reactivas de oxigénio. Em adição às funções de defesa importantes, os neutrófilos realizar outras tarefas, em resposta à infecção, tais como a produção de citocinas pró-inflamatórias e inibição da apoptose. Citocinas recrutar outros leucócitos que ajudam a eliminar a infecção, e a inibição da apoptose permite que o neutrófilo de viver mais tempo no local da infecção. Estas funções são reguladas ao nível da transcrição. No entanto, porque os neutrófilos são células de vida curta, o estudo das respostas transcricionalmente regulados nestas células não pode ser realizada com métodos convencionais de gene repórter já que não há eficientes para técnicas de transfecção de neutrófilos. Aqui, apresentamos um método simples e eficiente, que permite a detecção e quantificação de fatores nucleares em núcleos isolados e immunolabeled por citometria de fluxo. Descrevemos técnicas para isolar puros a partir de neutrófilos de sangue periférico humano, estimular estas células com anti-anticorpos do receptor, isolar e núcleos immunolabel, e analisar os núcleos por citometria de fluxo. O método tem sido utilizado com sucesso para detectar a NF-kB e Elk-1 factores nucleares de núcleos a partir de neutrófilos e de outros tipos de células. Assim, este método representa uma opção para a análise de activação de factores de transcrição no núcleo isolado a partir de uma variedade de tipos de células.
Introduction
Os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes no sangue periférico 1. Durante neutrófilos inflamação e infecção são as primeiras células a aparecer no local afetado, onde eles agem como a primeira linha de defesa 2. Neutrófilos possuem vários mecanismos, incluindo antimicrobianos 3 fagocitose, produção de espécies reativas de oxigênio, liberação de enzimas líticas pela degranulação e produção de citocinas pró-inflamatórias 4,5. Os neutrófilos são células de curta duração que são rapidamente ativadas através de sinalização de receptores de superfície vários celulares. Embora os neutrófilos foram consideradas células de terminal, devido à sua curta vida e porque eles sofrem apoptose, a menos que activada durante o processo inflamatório 6, é agora evidente que pode também modificar o seu fenótipo, alterando o nível de transcrição de genes específicos. A produção de citocinas 5 e a inibição da apoptose 7,8 são dois important funções de activação dependentes de células reguladas ao nível da transcrição dos neutrófilos. Factor nuclear kB (NF-kB) participa no controlo transcricional da produção de citoquina e 4 na regulação da sobrevivência celular e apoptose 9-11 em vários tipos de células.
As vias de sinalização que levam à ativação do fator nuclear são estudados por ensaios de gene repórter ou por ensaios de mobilidade eletroforética turno (EMSA). No entanto, porque os neutrófilos são células de vida curta, o estudo das respostas transcricionalmente regulados nestas células não pode ser realizada com os ensaios de gene repórter, uma vez que não existem técnicas eficazes para a transfecção de neutrófilos. Ensaios de EMSA foram usados em neutrófilos para explorar activação do factor nuclear 12,13, no entanto, esta metodologia é complicada e dispendiosa uma vez que envolve a utilização de material radioactivo. Nucleofection é uma outra técnica que tem sido utilizada successfully para transfectar monócitos 14. Assim, pelo menos em teoria, a activação do factor nuclear pode ser detectado nos neutrófilos por transfecção (apesar de baixa eficiência). No entanto, esta técnica poderia ser mais dispendioso, demorado e provavelmente menos quantitativo. A análise microscópica de células imunomarcadas também poderia ser usado para detectar factores nucleares no núcleo. Com efeito, temos detectado translocação de NF-kB para o núcleo deste modo 15. Infelizmente, esta técnica também é demorada, menos quantitativos, e sujeita a viés do observador.
Aqui, apresentamos um método simples e eficiente, que permite a detecção e quantificação de fatores nucleares em núcleos isolados e immunolabeled por citometria de fluxo. Descrevemos técnicas para isolar os neutrófilos a partir de sangue periférico humano, estimular estas células via integrinas ou receptores de Fc com anti-anticorpos do receptor, isolar e núcleos immunolabel, e analisar os núcleos por citometria de fluxo (Figura 1). O método tem sido utilizado com sucesso para detectar a NF-kB 15 e Elk-1 16 factores nucleares de núcleos de neutrófilos. A sensibilidade deste método permite a detecção de pequenas mudanças nos níveis do factor nuclear no núcleo. Este método também pode ser utilizado para analisar o nível de factores de transcrição no núcleo de outros tipos de células.
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Protocol
1. Isolamento de Neutrófilos (PMN) a partir de Sangue Humano
- Usar cerca de 20 ml de sangue humano com heparina (10 U / ml) como anti-coagulante. O sangue foi coletado de voluntários adultos saudáveis por venopuntura. Todos os experimentos foram realizados com a aprovação da Comissão de Bioética no Instituto de Investigaciones Biomédicas - UNAM.
- Coloque 2 ml de 6% de dextrana T500 em PBS num tubo de centrífuga de 15 ml e adicionar 10 ml de sangue. Misturar invertendo o tubo de duas ou três vezes e deixar repousar durante 45 minutos para permitir a sedimentação de eritrócitos.
- Num tubo de centrífuga de fresco 15 mL cónico colocar 5 ml de Ficoll-Paque.
- Levar o plasma rico em leucócitos que se formou por cima eritrócitos sedimentados, e cuidadosamente pipetar-o em cima do Ficoll-Paque formar uma segunda camada. Certifique-se de duas fases.
- Centrifugar a 516 xg durante 20 min a 4 ° C. Após a centrifugação, a interfase de plasma e de Ficoll-Paque, há uma camada de células mononucleares. Neutrophils estão na parte inferior do tubo.
- Elimine o sobrenadante, romper o pellet celular tocando o tubo contra uma prateleira, e ressuspender as células por adição de 10 ml de frio (4 ° C) Nota PBS:. Ressuspender as células pipetando para cima e para baixo não é recomendada uma vez que este está demasiado prejudiciais para as células.
- Transferir a suspensão de células para um tubo de centrífuga de 50 ml e centrifugar a 290 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Quebrar o sedimento de células, como antes e adicionam-se 10 ml de frio (4 ° C) uma solução hipotónica (0,2% de NaCl, 1% de BSA, Hepes 20 mM, pH = 7,4) para lisar os eritrócitos. Misture agitando o tubo suavemente com a mão por exatamente um minuto.
- Adicionar 10 ml de frio (4 ° C) a solução hipertónica (1,6% de NaCl, 1% de BSA, HEPES 20 mM, pH = 7,4), misturar e contar as células utilizando um hemocitómetro (geralmente> 95% são PMN).
Nota: Mantenha o tubo com a suspensão de células sobre gelo durante a contagem de células. - Centrifugar como antes e ressuspender PMN em 107 células / ml em frio (4 ° C) PBS. Manter em gelo.
Nota: Os neutrófilos permanecer viável e funcional, a 4 ° C durante cerca de 6 a 8 horas.
2. Ativando PMN
- Coloque 100 ul de suspensão de PMN (1 x 10 7 células / ml) para um tubo Eppendorf de 1,5 ml.
Nota: os tubos de amostras deve ser feito pelo menos em duplicata. Habituais controles negativos deve incluir primeiro anticorpo somente, e anticorpo secundário. - Adicionar o anticorpo para o receptor anti-integrina correspondente ou anti-Fc de anticorpo monoclonal (mAb) a 10 ng / ml e incuba-se em gelo durante 15 min.
- Lavar PMN por adição de 1 ml de frio (4 ° C) PBS, centrifugação a 1743 xg (4500 rpm) numa microcentrífuga, e aspiração do sobrenadante.
- Romper o pellet celular tocando no fundo do tubo contra um rack, adicionar 1 ml de PBS frio, e lavar mais duas vezes como no passo anterior.
Nota: Estes lava remover o anticorpo não ligado. - Ressuspender PMN na mesma (emvolume) mador inicial de água morna (37 ° C) de PBS contendo 60 ug / ml de F (ab ') 2 de cabra anti-IgG de ratinho.
Nota: O anticorpo secundário anti-rato IgG que se ligam ao anticorpo anti-receptor da primeira e fará com que a reticulação do receptor. - Incubar a 37 ° C durante 1 a 20 minutos, dependendo do factor nuclear de interesse. Por min geralmente NF-kB 15, e para Elk-1 geralmente 5 min.
Nota: A incubação das células a 37 ° C reticulação do receptor induz, que não pode ter lugar a 4 ° C. - Adicionar 1 ml de PBS frio e centrifugar 3 min a 1743 xg em microcentrífuga.
- Remover o sobrenadante
- PMN congelar imediatamente em banho dry-ice/ethanol e mantê-los lá por 10 min.
3. Isolamento e Fixação de Núcleos
- Ressuspender o pellet congelado PMN em 100 ul de frio (4 ° C) de tampão hipotónico (10 mM HEPES, 10 mM de KCl, 1,5 mM MgCl 2, e 1 mM frescamente agregado DL-ditiotreitol [DTT], PH = 7,9). Recomenda-se a levar os tubos fora do banho dry-ice/ethanol um por um, e para limpar a parte inferior do tubo, antes de adicionar o tampão hipotónico.
- Colocar em gelo, e verificar a integridade núcleos por coloração de uma aliquota da suspensão de núcleos com azul de tripano. Núcleos de olhar em volta e azul. PMN intacto não ficam manchadas e os detritos de célula aparece como partículas azuis de forma irregular.
Nota: Se a suspensão contém muitos núcleos de células intactas ou fragmentos, é melhor para descartar a preparação e repetir o procedimento com outra amostra. - Centrifugar a 775 xg núcleos (3000 rpm) em microcentrífuga durante 10 minutos dentro de uma câmara fria. Neste ponto são núcleos de atendimento muito frágeis e devem ser levados em manter as amostras frio e não centrifugação a forças excessivas.
- Remover o sobrenadante por pipetagem muito cuidado.
- Adicionar 100 uL de paraformaldeído a 4% em PBS frio para fixar núcleos.
Nota: O sedimento é muito solta umd adicionando o tampão é suficiente para ressuspender os núcleos. Pipetando para cima e para baixo, deve ser evitada. - Incubar em gelo durante 20 min.
- Immunolabel núcleos por citometria de fluxo, ou mantê-los durante até 24 horas a 4 ° C.
4. Imunomarcação Núcleos de Análise de Citometria de Fluxo
- Centrifugar a 1.743 xg núcleos (4500 rpm) em microcentrífuga durante 1 minuto, e remover o sobrenadante por pipetagem suave muito.
- Adicionar 100 ul de frio (4 ° C) 0,1% de Triton X-100, paraformaldeído a 4% em PBS para permeabilizar núcleos. Incubar em gelo durante 10 min.
- Centrífuga permeabilizadas núcleos em 1743 xg em microcentrífuga e remova cuidadosamente o sobrenadante. Neste ponto, os núcleos aglomerados não atribuem bem na parte inferior do tubo. Recomenda-se a centrifugar de novo se o sedimento se solta.
- Núcleos ressuspender em 500 ul de frio de 4% de soro fetal bovino (FBS) em PBS para bloquear locais de ligação não específicos, e incubar em gelo durante 20 min. Centrifugadornúcleos em 1743 xg durante 3 minutos em microcentrifuga e remover cuidadosamente o sobrenadante.
- Ressuspender núcleos em 100 ul de PBS frio contendo 4% de FBS e 2,5 ng / ml do mAb contra o factor nuclear de interesse. Incubar em gelo durante 20 min.
Nota: Usual controlos negativos devem incluir anti-nuclear anticorpo único factor, e FITC marcado com anticorpo secundário apenas. - Lavar duas vezes com 500 ul de PBS frio com 4% de FBS e centrifugação a 1743 xg durante 3 min.
- Remover o sobrenadante cuidadosamente, núcleos ressuspender em 100 ul de PBS frio contendo 4% de FBS e 10 ng / ml de anticorpo marcado com FITC derivado correspondente, e incubar em gelo durante 20 min.
- Lave os núcleos duas vezes com 500 ul de PBS frio com FBS a 4% como no passo anterior.
- Ressuspender núcleos em 400 uL de paraformaldeído a 4% em PBS frio.
Nota: Os núcleos são colocados em paraformaldeído para permitir que a amostra a ser armazenadas durante vários dias sem contaminaçãoproblemas que podem ocorrer na presença de soro. - Analisar por citometria de fluxo imediatamente ou armazenar no escuro a 4 ° C durante um máximo de três dias.
5. Análise por Citometria de Fluxo
- Analise núcleos immunolabeled num citómetro de fluxo tal FACScan (Becton Dickinson; Franklin Lakes, NJ) ou aparelho semelhante.
- Ajustar as configurações de aquisição para: FSC no log-balança a 10-1, SSC, log-balança a 196, e núcleos portão em um ponto-enredo.
- Adquirir 10 mil núcleos por amostra.
- Analisar a fluorescência do FITC manchado de núcleos através do canal FL-1 (506 nm), fixado em log-balança a 400.
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Representative Results
O método de purificação descrito aqui fornece geralmente neutrófilos não estimulados (PMN) com pureza superior a 95% (Figura 1A). PMN isolado pode então ser estimulada pelos receptores de reticulação específicos com anticorpos monoclonais específicos. Temos estimulado PMN através de receptores Fc e integrinas (Figura 1B). Uma vez estimulado, PMN são lisadas e os núcleos são isolados com rendimentos elevados. Os núcleos são então immunolabeled para um determinado factor nuclear, tais como o factor nuclear kB (NF-kB), com anticorpos específicos (figura 1B).
Os núcleos podem ser facilmente reconhecida como uma população diferente de PMN intacto no citómetro de fluxo com um ponto-plot (Figura 2A). Em PMN descansando um nível basal de NF-kB é encontrada no núcleo das células (Figura 2B). Após a estimulação por ligação cruzada β1 integrinas, o NF-kB é translocado para o núcleo e esta INCREM ent em nuclear NF-kB é detectada como um aumento na fluorescência (Figura 2B). Do mesmo modo, a estimulação de PMN por reticulação β2 integrinas também induziu a activação do NF-kB, tal como indicado por um aumento na fluorescência (Figura 2C). A sensibilidade deste método permite a detecção de pequenas mudanças nos níveis do factor nuclear tal como evidenciado pelo facto de as integrinas β1, que se ligam a proteínas da matriz extracelular, tais como fibronectina induzida mais forte, a activação de NF-kB do que β2 integrinas, que se ligam a moléculas de adesão em células de outros (comparar as Figuras 2B e 2C).
Este método também tem sido utilizado com sucesso para detectar a NF-kB 15 e Elk-1 16 factores nucleares de núcleos isolados após a estimulação do receptor Fc de PMN. Este método é simples e económico, assim, ela pode ser facilmente modificado para analisar os factores nucleares em outros tipos de células.
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Figura 1. Representação esquemática da purificação de neutrófilos (PMN) a partir de sangue, a estimulação das células, o isolamento de núcleos, e imunomarcação de factores nucleares de núcleos isolados. A) de sangue tratado com heparina é misturado com dextrano para aglutinar eritrócitos. Depois de sedimento de eritrócitos, o plasma rico em leucócitos está no topo das células vermelhas. Este plasma rico em leucócitos é transferido e colocado em camadas sobre Ficoll-Paque em outro tubo. Após centrifugação, a camada de células mononucleares (MNC) é encontrado na interfase de plasma e de Ficoll-Paque. PMN são encontrados na parte inferior do tubo. B) isolada de PMN são estimulados por reticulação da membrana celular de receptores específicos com anticorpos monoclonais (mAb) (cor de laranja) e um anticorpo secundário (verde escuro). Factor nuclear kappa B (NF-kB), separa-se o inibidor de IkB e se transloca para o núcleo. Os núcleos são em seguida isoladas, permeabilizadas e immunolabeled contra NF-kB ou outro factor nuclear com um mAb específico (amarela), e um anticorpo secundário marcado com FITC (verde-claro). Núcleos fixos são analisados por citometria de fluxo (FACS). Clique aqui para ver maior figura .
Figura 2. Análise da activação de NF-kB em neutrófilos (PMN). A) PMN Intact (painel esquerdo) ou núcleos isolados (painel da direita), aparecem como duas populações distintas de citometria de fluxo em dot-plot. As células e os núcleos podem ser analisadas de forma independente porcriar portas diferentes, R1 (vermelho) para células intactas, e R2 (azul) para núcleos isolados. B e C Núcleos) isolado de PMN foram immunolabeled por NF-kB (p50 subunidade), antes (linha verde tracejada), ou depois de as células foram activadas por ligação cruzada integrinas β1 (B) com o anticorpo específico monoclonal TS2/16 (linha azul) ou β2 integrinas (C) com o anticorpo monoclonal específico IB4 (linha vermelha). A área cinzenta representa a fluorescência basal a partir do anticorpo secundário marcado com FITC sozinho.
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Discussion
O método de purificação descrito aqui permite o isolamento dos neutrófilos não estimulados (PMN) com pureza superior a 95% (avaliada por observação microscópica), num curto período de tempo. Por vezes, os neutrófilos podem ser contaminados por eritrócitos, se este não estiver completamente lisadas. Isso geralmente não afetam a técnica, uma vez que os eritrócitos e PMN pode facilmente ser distinguido como populações de células distintas por citometria de fluxo. PMN isolado pode então ser estimulada pelos receptores de reticulação específicos com anticorpos monoclonais específicos. Na verdade, PMN também pode ser estimulada por meios farmacológicos ou por adesão a vários substratos ou outras células. O método aqui apresentado pode ser utilizado para analisar as vias de sinalização que conduzem às alterações dos factores nucleares de núcleos PMN após as células são activadas por praticamente qualquer estímulo relevante biológica.
Uma vez PMN são estimuladas, o método descrito neste documento permite a rápida e efficient purificação dos núcleos e para a detecção, nesses núcleos de NF-kB por meio de imunofluorescência e análise de citometria de fluxo. Depois de PMN estimulação de determinados receptores, NF-kB, no citoplasma é libertado a partir do seu inibidor IkB e, em seguida, para dentro do núcleo traslocated (Figura 1B). Assim, o nível de activação de NF-kB é determinada pela quantidade de NF-kB presente no núcleo. Uma vez que este método pode detectar e medir a quantidade de NF-kB nos núcleos, pode facilmente determinar a activação deste factor nuclear. O método pode, de um modo semelhante detectar a activação de outros factores nucleares, quando a sua activação está associada a alterações nos níveis nucleares. A activação de factores de alterações nucleares pode ser devido a alterações na quantidade de fator presente no núcleo, como é o caso de NF-kB, ou alterações, tais como fosforilação, na estrutura molecular do factor, como é o caso para Elk-1. Este método pode ser usado para detectar changes de níveis nucleares de qualquer molécula para a qual um anticorpo específico está disponível.
Este método produz uma população de núcleos de puro de uma maneira simples e rápida. As células são congeladas e lisadas em tampão hipotónico, que rompeu as células abertas e deixa os núcleos intactos. PMN intacta ou núcleos isolado geralmente aparecem como duas populações distintas em citometria de fluxo dot-plot. As células e os núcleos podem ser analisadas de forma independente através da criação de diferentes portas de células intactas, e para núcleos isolados. Numa amostra de células intactas de um portão é criado em torno da área onde a maioria das células aparecem. De modo semelhante, com uma amostra de núcleos de um portão é criado em torno da área onde a maior parte núcleos aparecer. Normalmente estes dois portões estão em lugares diferentes do gráfico ponto-enredo. As partículas que são, por vezes detectados fora destas portas, são geralmente células ou detritos núcleos, e são deixados de fora da análise. Se as portas das células e núcleos se sobrepõem, isso normalmente significa que a preparação núcleos não é cleum. A análise desta preparação de núcleos não é de confiança, e que é melhor para repetir o procedimento com buffers frescas.
O método foi desenvolvido para trabalhar com PMN humano, mas também tem sido aplicada com sucesso a várias linhas celulares de origem de leucócitos 15. O método pode ser facilmente adaptado para isolar núcleos a partir de vários tipos de células. É importante para iniciar o processo com um mínimo de 1 x 10 6 células, para se obter núcleos suficientes para uma análise eficiente de citometria de fluxo. Se um pequeno número de núcleos são obtidos no final, é melhor começar o método rotineiramente com 3 x 10 6 células.
Durante o passo de lise, as células congeladas não deve ser deixada descongelar. Isso resulta em um rendimento baixo devido à degradação celular. Assim, recomenda-se ter um tubo de cada vez para fora do banho dry-ice/ethanol para lisar as células. Além disso, é importante limpar a parte externa do tubo, antes de adicionar a lise hipotónicatampão. Quando isto não for feito, o buffer de vezes congela no tubo, dando uma lise celular ineficiente e resulta em preparações de núcleos que são contaminadas por células intactas. Ainda assim, este não é um problema grave, uma vez que, na maioria dos casos, as células intactas e os núcleos podem ser separados por citometria de fluxo.
Porque os núcleos são muito frágeis antes que fiquem fixos, é importante dispor de todas as soluções-tampão fria a 4 ° C, mantendo-se em gelo. Após centrifugação, as peletes são, por vezes, os núcleos solto na parte inferior do tubo, de modo cuidado extra deve ser tomado durante a remoção do sobrenadante. Isto é melhor feito com uma micropipeta que com aspiração a vácuo. Na ocasião, o tubo pode ser centrifugado de novo, mas as forças de centrifugação recomendados não deve ser excessiva, pois isso danifica o núcleo.
O método de detecção de activação do NF-kB por meio de anticorpos específicos para a subunidade p50 (Figura 2), e also A subunidade p65 15 deste fator nuclear. Além disso, a quantificação da activação do receptor-iniciado nuclear de ERK e Elk-1 também foi atingido com sucesso por este método 16, utilizando os anticorpos correspondentes específicos contra estas moléculas. Além disso, a sensibilidade de detecção deste método permitiu de pequenas alterações no NF-kB níveis nucleares, devido à estimulação diferencial de PMN por diferentes tipos de integrinas (Figura 2) e, também, devido à inibição farmacológica do receptor Fc iniciada vias de sinalização 16 . A combinação de um anticorpo específico boa e um anticorpo marcado com fluorescência eficiente secundária fornece uma grande sensibilidade e permite a detecção de pequenas mudanças no valor do factor nuclear de interesse dentro dos núcleos. Isto permite a comparação quantitativa dos níveis do factor nuclear antes e depois de diferentes condições de estimulação. Além disso, este método pode detectar de forma isolada nuclei, virtualmente qualquer molécula de um anticorpo contra o qual bem específico está disponível. Além disso, a parte de imunomarcação pode ser simplificado pela utilização de um anticorpo marcado directamente com o fluorochome, que além irá melhorar a sensibilidade. Finalmente, o método apresenta uma grande flexibilidade porque muitos fluorochomes diferentes podem ser usados. Assim, este método pode ser aplicado a muitos estudos de transdução de sinal diferentes que envolvem alterações dos níveis da proteína no núcleo.
Em conclusão, a ampla aplicabilidade e sensibilidade do método descrito neste documento, coloca-lo como uma opção simples e económica para os estudos de transdução de sinal que envolvem alterações dos níveis de proteína do núcleo de uma grande variedade de tipos de células.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses conflitantes financeiros.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Nancy Mora por sua assistência técnica.
Este trabalho foi financiado por bolsas de investigação 48573-M e 168098 do Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia, do México, e por doações e IN212308 IN205311-2 da Dirección General de Asuntos del Academico Pessoal, Universidad Nacional Autónoma de México, México.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| Heparin | PiSA (Mexico) | ||
| Dextran T500 | Pharmacosmos A/S (Holbaek, Denmark) | T1-Dextran T500 | |
| Ficoll-Paque | Pharmacia | 17-0320-01 | |
| Sodium chloride | Sigma | S7653 | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S9638 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S9390 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A2153 | Cohn Fraction V |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9541 | |
| Magnesium chloride anhydrous | Sigma | M8266 | |
| DL-dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9163 | |
| Trypan Blue (0.4 % solution) | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO | 10437-028 | |
| Monoclonal antibody IV.3 | Medarex (Annandale, NJ) | 025-1 | Human-specific anti-FcRII (CD32) |
| Monoclonal antibody 3G8 | Medarex (Annandale, NJ) | 028-2 | Human-specific anti-FcRIII (CD16) |
| Monoclonal antibody TS2/16 | Dana Farber Cancer Research Institute (Boston, MA) | Donated by Dr. Martin Hemler | Human-specific anti-β1 integrin (CD29) |
| Monoclonal antibody IB4 | University of California, San Francisco | Donated by Dr. Eric J. Brown | Human-specific anti-β2 integrin (CD18) |
| F(ab')2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55468 | |
| FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-mouse IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55522 | |
| FITC-conjugated F(ab')2 goat anti-rabbit IgG | Cappel (Aurora, OH) | 55665 | |
| Anti-NF-κB p50 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-114 | Rabbit polyclonal antibody |
| Anti-NF-κB p65 | Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) | sc-109 | Rabbit polyclonal antibody |
| EQUIPMENT | |||
| 15-ml centrifuge tube | Corning | 430791 | |
| 50-ml centrifuge tube | Corning | 430291 | |
| Centrifuge, Sorvall Tabletop | Dupont Instruments | RT 6000D | |
| pH-meter | Corning | 340 | |
| Pipetman pipette P-20 | Gilson | F123600 | |
| Pipetman pipette P-200 | Gilson | F123601 | |
| Pipetman pipette P-1000 | Gilson | F123602 | |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 0267110 | |
| Microscope | Nikon | Eclipse E600 | |
| Inverted microscope | Nikon | TMS | |
| Water Bath Incubator | Fisher Scientific | 2IS-M | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5414C | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5418 | |
| Flow Cytometer | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ) | FACScalibur | |
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