Summary
In diesem Beitrag beschreiben wir ein optimiertes Verfahren zur Extraktion und Analyse Prostaglandine und andere Eicosanoide aus
Abstract
Caenorhabditis elegans ist als leistungsfähiges Tiermodell, um die Biologie von Lipiden 1-9 studieren Schwellenländern. Prostaglandine sind eine wichtige Klasse der Eicosanoide, die Lipid-Signale von mehrfach ungesättigten Fettsäuren (PUFAs) 10-14 abgeleitet sind. Diese Signalmoleküle sind aufgrund ihrer geringen Häufigkeit und reaktive Natur zu studieren. Das charakteristische Merkmal der Prostaglandine ist ein Cyclopentanring Struktur innerhalb der Fettsäure Rückgrat entfernt. Bei Säugetieren können Prostaglandine durch Cyclooxygenase-Enzym-abhängige und-unabhängige Wege 10,15 gebildet werden. C. elegans synthetisiert eine breite Palette von Prostaglandinen unabhängig von Cyclooxygenasen 6,16,17. Eine große Klasse von F-Serie Prostaglandine identifiziert worden ist, aber die Studie der Eicosanoide ist in einem frühen Stadium mit reichlich Platz für neue Entdeckungen. Hier beschreiben wir eine Methode zur Extraktion und Analyse Prostaglandine und andere Eicosanoide. Geladenen Lipids sind vom Massentourismus Wurm Kulturen mit einer Flüssig-Flüssig-Extraktion Technik extrahiert und durch Flüssigchromatographie gekoppelt mit Elektrospray-Tandem-Massenspektrometrie (LC-ESI-MS/MS). Die Einbeziehung der deuterierten Analoga der Prostaglandine, wie PGF 2 α-d 4 als ein interner Standard für die quantitative Analyse empfohlen. Multiple Reaction Monitoring oder MRM kann verwendet werden, um zu quantifizieren und vergleichen spezifische Prostaglandin-Typen zwischen Wildtyp und Mutante Tiere werden. Stoßfragmentierung oder MS / MS verwendet werden, um Informationen über wichtige strukturelle Merkmale zu erhalten. Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) Umfrage Scans eines ausgewählten Massenbereich wie m / z 315 bis 360 verwendet werden, um globale Änderungen in Prostaglandin Ebenen herangezogen werden. Wir stellen Beispiele für alle drei Analysen. Diese Methoden werden die Forscher mit einem Toolset für die Entdeckung neuartiger Eicosanoide und ihre Abgrenzung Stoffwechselwege zu stellen.
Introduction
Prostaglandine (PGs) sind eine wichtige Klasse von Lipid-Hormone, die ausgiebig untersucht und beteiligt bei der Regulierung der Fortpflanzung, Immunität und Entwicklung in einem breiten Spektrum von Organismen 12-14. PGs sind ideal für eine umfassende Systembiologie Analysen geeignet, da sie eine Reihe von Lipiden aus einem gemeinsamen Vorläufer (s) abgeleitet sind. Der Fadenwurm C. elegans ist einer der am weitesten verbreitete Modell Organismen, um grundlegende Fragen der Genetik und Systembiologie anzugehen.
Wir haben gezeigt, dass C. elegans synthetisiert F-Serie PGs, die Führung zu beweglichen Spermien Eizellen 3,6,16. F-Serie PGs von 20-Kohlenstoff-PUFAs mit drei, vier und fünf Doppelbindungen, umfassend die F1, F2, F3 und Klassen, die jeweils abgeleitet wurden 3,16 identifiziert. Diese PGs synthetisiert werden unabhängig von Cyclooxygenase Enzyme, noch PGF 1α und PGF 2α Stereoisomere sind noch generated. Für die qualitative und quantitative Analysen von C. elegans PGs ist LC-MS/MS eine leistungsfähige und empfindliche analytische Technik. Vor der Durchführung dieser Analyse ist es wichtig, eine optimierte Extraktionsverfahren entwickelt, weil die Leistung des analytischen Prozesses hängt stark von der Qualität Extrakt. Flüssigchromatographie und Massenspektrometrie können nur erwartet Masse-Verhältnis (m / z) berechnet, sowie wünschenswert Peakform und Verweilzeit des PG Stammion. Metabolic Profiling von PGs in C. elegans ist eine anspruchsvolle Aufgabe, die verschiedenen MS Akquisitionsstrategien.
LC-MS Scan oder Scan-Umfrage (Q1-Scanning) hat den Vorteil, dass die meisten ionisierbare PGs eine massenspektrometrische Antwort zu generieren. Während die Umfrage Scan liefert nützliche Informationen über den Gesamtbetrag Profilierung PGs gegenüber Wildtyp und Mutante C. elegans, Erkennung von untergeordneter PGs ist aufgrund der geringen Empfindlichkeit beeinträchtigt. Dennochweniger kann LC-MS Umfrage Scannen geben einen globalen Überblick über PGs und ist besonders nützlich für die Analyse von Mutanten vorhergesagt Stoffwechsel eines großen PG Bevölkerung beeinträchtigen.
In Identifizierung von Metaboliten wird LC-MS/MS Analyse von chemisch synthetisierten PG Standards zuerst durchgeführt, um ihre Produkt-Ionen-Spektren als Referenz Verbindungen zu erhalten. Diese Spektren können zur Spektrum eines unbekannten Metaboliten verglichen werden. Multiple Reaction Monitoring (MRM)-Modus wird für eine verbesserte Empfindlichkeit und Spezifität verwendet. Ein MRM Experiment wird durch die Angabe der Stammion / Produkt Ionenmasse Übergang einer Verbindung durchgeführt. Durch die Kenntnis der Masse und Struktur der Zielanalyten, ist es möglich, theoretischen MRM Übergänge für viele unbekannte Metaboliten vorherzusagen.
Eine optimierte LC-MS/MS Methode zur Profilierung isomeren PGs in C. elegans wurde nicht berichtet. Hier beschreiben wir eine Extraktion und integrierte Massenspektrometrie Ansatz bestehend aus LC-MS und LC-MS / MS-Methoden zum Nachweis, zur Quantifizierung und Untersuchung C. elegans PG Metaboliten. Dieser Ansatz kann auch auf andere Eicosanoide angewendet werden.
Protocol
Wurm Kultur, Prostaglandin-Extraktion und Prostaglandin-Analyse: Das Protokoll, wie unten beschrieben ist in drei Abschnitte unterteilt. Wie bereits erwähnt, gibt es mehrere Punkte, wenn Proben vorübergehend bei -80 ° C oder -20 ° C gelagert werden
1. Worm Kultur
Wir empfehlen ca. 6 g gemischte Bühne Würmer für umfassende LC-MS/MS. Dies sollte genug Material zum Nachweis von mindestens sechs separaten Injektionen stellen. Für die Quantifizierung bekannter PGs durch MRM in einer einzigen Injektion oder zwei, sind 1-2 g ausreichend. Analyse von Extrakten aus synchronisiert Kulturen, bestehend aus einer bestimmten Stufe ist auch möglich. Bis zu 4 verschiedene Stämme gleichzeitig angebaut werden. Zum Beispiel kann ein Wildtyp-Kontrolle und drei verschiedenen Mutanten.
- Bereiten 65 X-large (16 cm) NGM-Platten und konzentrierte Bakterien für ergänzende Fütterung. Verwenden NA22 Bakterien für die Aussaat. Um konzentrierten Bakterien Zufütterung, gro machenw mindestens vier Liter NA22 in LB-Medium für 16-24 Std. Spin down, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Bakterien in 100 ml M9-Puffer. 200 bis 400 ml dieser konzentrierten Bakterien-Lösung kann für jede Wurmstamm erforderlich. Lagern bei 4 ° C.
- Starten Wurm Kulturen am 5. X-großen Platten. Wachsen Würmer für etwa 3 bis 4 Generationen bis Platten voller schwangeren Erwachsenen sind. Konzentrierte Bakterien sollte, um Platten zu verhindern Hunger hinzugefügt werden, wie nötig (~ 1 ml / Platte und vollständig trocknen lassen, bevor Sie Deckel).
- Waschen trächtige Zwitter aus Platten mit M9-Puffer und sammeln die Würmer in einem 50 ml konischen Röhrchen aus Polypropylen.
- Erlauben trächtige Hermaphroditen auf den Boden (in der Regel ca. 3-5 min) zu begleichen. Überstand entfernen, einschließlich Bakterien, Eier und Larvenstadium Würmer. Resuspendieren in 15 ml M9-Puffer und vorsichtig mischen.
- Übertragen Sie 200 ul Wurm Suspension auf jeweils von 60 gesäten NGM-Platten. Disperse Würmer über die Platten. Halten Wurm-Lösung gemischtgut, bis alle Platten wurden ausgesät, um sicherzustellen, dass sie in etwa die gleiche Anzahl von Würmern erhalten.
- Nachtrag mit konzentrierter Bakterien nach Bedarf (~ 1 ml/plate/12 bis 24 Stunden-Zeitraum) um Hunger zu verhindern. Erlauben Platten an der Luft vor dem Ersetzen Deckel trocken. Wachsen Würmer für 2-4 Generationen, abhängig von der ursprünglichen Anzahl der gesetzten Würmer oder bis Platten sind voll von schwangeren Erwachsenen.
- Ernte Schnecke Platten einen Stamm zu einer Zeit. Waschen Würmer aus den Platten mit M9-Puffer und sammeln in 50 ml Polypropylen-Röhrchen (zB 6 Röhren). Verwenden M9 Puffer auf einen Teller zu waschen, dann überweisen Sie den Wurm gefüllten Puffer auf die nächste Platte. Nach dem Waschen eine Nummer (zB. 10.) von Platten, übertragen den Wurm gefüllten Puffer in den 50-ml-Tube. Füllen Sie den Schlauch an die Spitze mit M9-Puffer. Wiederholen der Wäsche für den Rest der Platten.
- Da die schwangeren Erwachsenen auf den Boden in 5-6 min absetzen, entfernen Sie den Überstand (~ 35 ml) und Konsolidierung in ein oder zwei Röhren. Füllen Sie die Röhrchen auf 50 ml mit fresh M9 Puffer stehen lassen für 3-5 min, und entfernen Überstand verlassen schwangeren Erwachsenen. Wiederholen 3 mal oder bis der Überstand transparent.
- Mit einem großen Bohrung Pasteurpipette Transfer so viele Würmer wie möglich, zwei 15 ml konische Röhrchen aus Polypropylen. Spin down bei 1.000 rcf (~ 3.500 rpm in CentraSL2) für 5 min in einer klinischen Zentrifuge. Überstand entfernen und wiederholen, bis alle Würmer übertragen werden und Pellets in das gleiche Rohr. Entfernen Sie so viel wie möglich und Überstand store Würmer bei -80 ° C. Wiederholen Sie dies für alle Stämme.
2. Prostaglandin Extraction
Die Reagenzien für die Extraktion benötigt werden weiter unten. Das Verfahren wird von der Golovko und Murphy 17 modifiziert und enthält Aceton-Extraktion durch Flüssig-Flüssig-Reinigung, die LC-MS/MS Empfindlichkeit verbessert gefolgt. A Bullet Blender 5 Homogenisator in dem Verfahren verwendet, obwohl ähnliche Ergebnisse mit einem Dounce Homogenisator erhalten werden kann. Butylated hydroxytoluene (BHT) und Eindampfen unter Stickstoff (N 2)-Gas verwendet werden, um Oxidation zu verhindern. Alle Glaswaren sollten silikonisiert (Sigmacote) werden Lipidbindung reduzieren. Extraktion mit organischen Lösemitteln sollte in einer chemischen Haube erfolgen.
- Wiegen eine 50 ml konischen Röhrchen aus Polypropylen. Übertragen etwa 6,0 g gefrorene Würmer aus dem 15 ml konischen Röhrchen bei -80 ° C durch einen Schnitt durch das Rohr mit einem heißen Rasierklinge in der Nähe der 6,5-ml-Markierung gespeichert. Ein Methanol gereinigt Spatel verwendet werden, um das gefrorene Schnecke Pellet aus der Unterseite des Rohres zu entfernen. Nach Durchtrennen des Pellet um den unteren Teil, weniger dicht Larven Würmer und Rückständen von Bakterien von der Spitze des Pellets abgerufen werden zurückgelassen.
- Übertragen Sie die gefrorenen Würmern zum vorgewogenen 50 ml konischen Röhrchen. Wenn mehrere Proben verarbeitet werden, verwenden die gleiche Menge (6,0 g) von Gewebe für vergleichende Studien. Da die Würmer Tauwetter zu einer Paste, hinzuzufügen oder zu entfernen Würmer mit dem Spatel, um den gewünschten Masse zu erhalten. Optional: add 1,00 ng von PGF 2α-d4 Norm als interne Kontrolle für die Extraktion Effizienz.
- In 12 ml eiskaltem Aceton 2.01 / Kochsalzlösung mit 0,005% BHT dem Wurm Federung und gut mischen durch Vortexen. Teststreifen 1,5 ml der Schnecke Aufschlämmung zu jedem der zwölf 5 ml selbsttragenden Kunststoff-Rohre für den Einsatz in der Kugel-Blender.
- In 0,7-0,8 ml von 0,5 mm Durchmesser Ceria Zirkonoxid-Perlen zu je 5 ml Tube. Schließen Kappen fest und laden Sie die 12 Röhren in dem Bullet Blender 5 homogenisiert. Führen Sie den Mixer für 3 min bei Geschwindigkeit 8-9 und platzieren Sie die Röhrchen auf Eis. Achten Sie darauf, um die Kappen sehr fest schließen oder der Inhalt kann austreten. Prüfen Sie 10 ul Homogenat aus einem Rohr auf einem Objektträger mit einem Stereoskop. Es sollten nur sehr wenige intakte Würmer verbleibenden sein. Wiederholen der gleichen Geschwindigkeit für eine Minute, falls erforderlich.
- Gleichmäßig übertragen Sie die Homogenate zu vier 10 ml konischen Glasröhrchen mit einem 9 "Pasteurpipette. Vermeiden Übertragung Perlen. Waschen Perlen aus drei Röhren sequentially mit 1 ml von 1:2 Aceton / Salzlösung, die BHT. Wiederholen Sie für andere Rohre bis alle Perlen gewaschen werden. Übertragen Sie die verbleibende Lösung (~ 4 ml) zu den 10 ml Glasröhrchen und legen sie auf Eis.
- Zentrifugieren Sie die 10 ml Glasröhrchen bei 4 ° C in einer klinischen Zentrifuge bei ~ 1.000 xg für 10 min. Den Überstand aus jedem Röhrchen zu einer sauberen 10 ml konischen Röhrchen Glas.
- In einer chemischen Abzugshaube, das gleiche Volumen von Hexan zu je 10 ml Glasröhrchen. Fügen Sie z. B. 3,5 ml Hexan und 3,5 ml Aceton / Kochsalzlösung. Vortex bei maximaler Geschwindigkeit für 30 Sekunden.
- Zentrifugieren Sie die 10 ml Glasröhrchen bei 4 ° C in einer klinischen Zentrifuge bei ~ 1.000 xg für 10 min. Entsorgen Sie die obere Phase mit Hexan und neutral geladenen Lipiden.
- Säuert die untere Phase auf pH 3,5 mit 2 M Ameisensäure (ca. 100 - 150 ul). Test-pH-Wert mit pH-Streifen.
- Fügen Sie dem gleichen Volumen Chloroform in jedes Röhrchen. Vortex bei maximaler Geschwindigkeit für 30 sec und zentrifugieren bei 4 ° C ina klinischen Zentrifuge bei ~ 1.000 xg für 10 min.
- Entfernen und Entsorgen der oberen wässrigen Phase. Legen Sie eine Pipettenspitze durch Reststoffe milchige Interphase an der unteren Chloroformphase, die Vermeidung der Zwischenphase. Sammeln Sie die untere Phase aus jeder der 4 Röhren in einen sauberen 15 ml konischen Glasrohr. Inkubation bei -20 ° C für mindestens 24 Stunden. An diesem Punkt kann der Extrakt bei -20 ° C für bis zu zwei Wochen gelagert werden.
- Nehmen Sie den Extrakt aus der Tiefkühltruhe und verwerfen die restliche milchig obere, wässrige Schicht, falls vorhanden. Übertragen Sie die Chloroform-Phase mit einer markierten Teflon ausgekleideten ½-Dram Glasfläschchen mit einem neuen Pasteur-Pipette. In einer chemischen Abzugshaube, dampft das Chloroform löslichen Fraktion zur Trockene unter einem leichten Strom von N 2-Gas. Der getrocknete Extrakt kann bei -20 ° C für bis zu 2 Wochen gelagert werden. Eine allgemeine Schema für PG Extraktion und Analyse verwendet, ist in 1 gezeigt.
3. Prostaglandin Analysis
- Bereiten LagerLösungen einzelner Referenz Prostaglandine, wie PGF 2α oder PGF 2 α-d4 (1 ug / ml) in Methanol und verdünnt mit Methanol: Wasser (8.02 v / v), eine funktionierende Lösung zu erhalten. Vorbereiten einer Reihe von Verdünnungen (100, 10, 1, 0,1, 0,01 ng / ml), um eine Standardkurve zu erzeugen.
- In 200 ul Methanol: Wasser (8.02 v / v) auf die getrocknete C. elegans Lipidextrakt (en) und gründlich mischen. Wasser-Lösung: Wenn weniger als 6 g Wurm Gewebe extrahiert wurde, sollte der getrocknete Extrakt in weniger Volumen Methanol suspendiert werden.
- Bereiten Sie die mobile Phase, bestehend aus 0,1% Ameisensäure in Wasser [A] und Acetonitril, das 0,1% Ameisensäure [B].
- Richten Sie den Autosampler bei 4 ° C und platzieren Sie die Probengefäße in einem 70-count 1,5 ml Fläschchen Rack.
- Equilibrieren die Synergy hydro RP-C18-Säule mit 0,1% Ameisensäure bei einer Flussrate von 0,2 ml / min für ca. 5 min.
- Die Probe (20-50 ul) in die Spalte. Führen Gradientelution Starting mit 10% B und gehen bis zu 80% B 0-11 min, 80-100% B 11-14 min, und wieder zurück auf 10% B in 16 min. Die gesamte Laufzeit beträgt 20 min. Die Retentionszeiten von 13 authentischen Standards sind in Tabelle 1 dienen 3 gezeigt.
- Führen Sie die Säulenausfluß in das Massenspektrometer mit einem ESI-Schnittstelle, die im Negativ-Ionen-Modus. Stickstoff wird als Schutzgas und Vernebler (CUR = 10) verwendet. Die Kollision Gas, Aufprallenergie, und die Temperatur bei 10, -35 eV und 600 ° C eingestellt sind. Declustering Potential (DP), Kollisionsenergie (CE) und der Zelle Ausgang Potential (CXP) werden bei -90, -35 und -10 eingestellt sind.
- Für Umfrage Scans (Q1-Scans), verwenden Negativ-Ionen-Modus im Massenbereich von m / z 315-360 für die meisten PGs (Abbildung 2). Der Bereich kann verändert werden, abhängig von der Masse der Verbindung (en) von Interesse. Auszug Ionen aus Totalionenstrom (TIC) der LC-MS Ionenchromatogramme und festzustellen, ob die Extraktionted deprotonierten Ionen oder Adduktionen entsprechen oder Fragment-Ionen.
- Für MRM Experimenten Massenübergang m / z 355/311 verwendet, um die Klasse F1 erkennen, m / z 353/193 für die F2-Klasse verwendet, und m / z 351/193 oder 351/191 ist für die F3-Klasse verwendet (Abbildung 3). MRM wird auch verwendet, um den internen Standard (z. B. m / z 357/197 für PGF 2α-d4) zu erfassen und die Standardkurve zu erstellen. Siehe Murphy et al. Für zusätzliche Informationen über PG Masse Übergänge 18.
- Für MS / MS-Experimente, verwenden m / z 355 für Klasse F1, m / z 353for F2-Klasse, und m / z 351for F3 Klasse PGs. C. elegans MS / MS-Daten für F-Serie PGs ist in Abbildung 4 und Tabelle 2 3,16. MS / MS-Daten für Säugetierzellen Eicosanoide ist verfügbar unter www.lipidmaps.org .
- Verarbeiten Sie die analytischen Daten mit Analyst-Software (Version 1.4.2, Applied Biosystems).
Representative Results
Probenvorbereitung erfolgte durch Flüssig-Flüssig-Extraktion aus Golovko und Murphy 17 angepasst durchgeführt. Es bot einen ausgezeichneten Erholung des internen Standards (PGF 2α-d4). Das allgemeine Schema für PG-Extraktion aus C. elegans ist in Abbildung 1 dargestellt. Chromatographische Bedingungen wurden optimiert, um Basislinientrennung von> 30 Eicosanoid Standards (Tabelle 1 zeigt 13 Standards) zu liefern. Eine Hydro-RP-Säule (250 x 2,0 mm ID) mit Wasser und Acetonitril, das 0,1% Ameisensäure sofern die beste Trennung und Empfindlichkeit. Umfrage Scans von Wildtyp-und Fett-3-Mutante Extrakte in Abbildung 2 Dokument globaler Ebene von Ionen im Massenbereich von 315 bis 360 Atommasseneinheiten gezeigt. Fat-3 (WA22) Mutanten fehlt es den meisten 20-Kohlenstoff-PUFAs. Eine Klasse F3 PG wird hervorgehoben. In Abbildung 3 zeigen MRM-Analysen eines Wildtyp-Extrakt mehrere PG Isomere der F1 (3A ng>), F2 (Abbildung 3B) und F3 (3C und 3D) Klassen. Die Klasse F3 können mit einer der beiden Massen-Übergänge erfaßt werden, m / z 351/193 oder m / z 351/191. CePGF2 wird überwiegend der PGF 2α Enantiomer besteht. CePGF1 ist wahrscheinlich PGF 1α oder dessen Enantiomer. Abbildung 4 zeigt die Stoßfragmentierung von CePGF2 (RT = 11,8) im Vergleich zum Standard-PGF2 α (RT = 11,8). Geringfügige Unterschiede im Produkt-Ionen sind wahrscheinlich aufgrund der geringen CePGF2 Fülle und koeluierenden Verbindungen im Extrakt.
Abbildung 1. Schematische Darstellung von C. elegans PGs Extraktion und LC-MS-Analysen. Beachten Sie, dass Aceton / Chloroform sowohl Kochsalzlösung und 0,005% BHT zu Lipid Oxidation zu minimieren. Siehe den Text für weitere Details.http://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig1large.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2. Umfrage Scans von m / z 315-360 von Wildtyp-und Fett-3 (WA22) Mutante Extrakten. Flüssigchromatographie Retentionszeit (RT) in Panel [A] gezeigt. Extrahierten Ionen bei RT = 11.3 sind für Wildtyp-[B] und Fett-3 (WA22) [C] Auszüge gezeigt. Eine Klasse F3 PG mit der Masse m / z 351 wird hervorgehoben. CPS counts / sec; amu, atomic mass unit.
Abb.Abbildung 3. MRM-Analysen von Wildtyp-Extrakten. F1 Klasse PGs sind mit Masse Übergang m / z 355/311 [A] erkannt. Beachten Sie, dass mehrere hydrophobe Verbindungen (RT> 14 min), bei denen es unwahrscheinlich PGs sein sollen, sind auch mit diesem Übergang erkannt. F2 Klasse PGs mit Masse erkannten Übergang m / z 353/193 [B]. F3 Klasse PGs sind entweder mit Masse erkannten Übergang m / z 351/193 [C] oder m / z 351/191 [D]. Beachten Sie, dass die Extrakte mehrere PG Isomere jeder Klasse enthalten. Zahlen zu PGs in Tabelle 2 gezeigt sind, entsprechen. Die Konzentration der CePGF2 1,8 ng / ml. RT, Verweilzeit; cps, counts / sec.
Abbildung 4. Stoßfragmentierung chemisch SynthPGF 2α esized und CePGF2. Arrows in Panel [A], dass das Produkt oder Fragmentierung Ionen zwischen PGF 2α und CePGF2 (RT = 11,8) geteilt. Die Produkt-Ionen bei m / z 309 und m / z 193 von angezeigten Schnittstellen (hervorgehoben A und B) entsprechen den gezeigten Strukturen erzeugt und sind charakteristisch für F-Serie PGs [B]. CPS counts / sec. Klicke hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen .
| Norm | RT (min) | [MH] - m / z | Key Produkt-Ionen in MS / MS | ||||
| 20-Hydroxy-PGE 2 | 9,43 | 367 | 349, 331, 287, 234, 189, 129, 109 | PGF 3 - | 11,26 | 351 | 333, 307, 289, 271, 245, 219, 209, 193, 191, 171, 165, 111 |
| Thromboxan B 2 | 11,66 | 369 | 289, 191, 177, 169, 151 | ||||
| PGF 2 - | 11.80 | 353 | 335, 309, 291, 273, 263, 247, 235, 209, 193, 171, 165, 111 | ||||
| PGF 1 - | 11.79 | 355 | 337, 319311, 301, 293, 275, 265, 237, 211, 195 | ||||
| Lipoxin B 4 | 12,38 | 351 | 201, 191189, 165, 155, 115, 107, 71, 59 | ||||
| PGD 2 | 12,56 | 351 | 315, 271.203, 189 | ||||
| 5 (S), 6 (R) - Lipoxin A 4 | 12,83 | 351 | 235, 217, 189, 144, 135, 115, 99, 59 | ||||
| PGA 2 | 14.02 | 333 | 315, 297, 271, 235, 191, 189, 175, 163, 137, 113, 109 | ||||
| Δ12-PGJ 2 | 14.20 | 333 | 271, 189, 123 | ||||
| Leukotrien B 4 | 14,73 | 335 | 181, 109, 93, 71, 69, 59, 57 | ||||
| 15d-Δ 12,14-PGJ 2 | 16.80 | 315 | 297, 271, 217, 203, 158 | ||||
| 5 (S)-HPETE | 17.88 | 335 | 97, 83, 81, 57 |
Tabelle 1. Retentionszeiten und die wichtigsten Produkt-Ionen von 13 Eicosanoid Standards aus der LC-MS/MS Methode 3. Mehr als 30 Standards wurden verwendet, um die LC-MS/MS Programm zu entwickeln. Die chromatographischen Retentionszeiten (RTS) unterscheiden, sogar unter sehr ähnlich PGs. Eine Ausnahme ist PGF 1α und PGF 2α. Dennoch sind diese PGs distinguished durch ihre Eltern Ionenmassen ([MH] - m / z) und Stoßfragmentierung Spektren (MS / MS).
| Prostaglandin-Klasse | Nr. in Abbildung 3 | [MH] - m / z | Key Produkt-Ionen in MS / MS |
| F1 (CePGF1) | 1 | 355 | 319, 301, 311, 293, 275, 265, 237, 223, 211, 195, 157 |
| F1 | 2 | 355 | 311, 301, 293, 275, 265, 211, 195, 167, 157 |
| F2 (CePGF2) | 3 | 353 | 309, 291, 273, 263, 247, 209, 193, 171, 165, 127 |
| F2 | 4 | 353 | 309, 291, 273, 263, 255, 247, 219, 209, 193, 171, 113 |
| F3 | 5 | 351 | 315, 307, 289, 275, 249, 205, 193, 191, 167, 153, 139 |
| F3 | 6 | 351 | 333, 289, 271, 261, 245, 223, 193, 191, 163 |
Tabelle 2. Stoßfragmentierung Produkt-Ionen für mehrere große C. elegans F1, F2, F3 und PGs in Abbildung 3 dargestellt. MS / MS anderer weniger reichlich Isomeren sind nicht dargestellt. Diese Daten sind aus mehreren Analysen und nicht alle Produkt-Ionen können in einem bestimmten Lauf sichtbar. Angesichts der Komplexität der Extrakte können einige weniger reichlich Produkt-Ionen von einer anderen ableiten Stammion mit ähnlichen Verweilzeit oder infolge von Störungen. Peak 2 ist wahrscheinlich ein Stereoisomer CePGF1 und Peak 4 ist wahrscheinlich ein Stereoisomer CePGF2. Siehe Edmonds, et al. (2010) für zusätzliche Daten 3.
Discussion
Wir beschreiben ein Verfahren zur Extraktion und Analyse Eicosanoid, mit Schwerpunkt auf F-Serie PGs. Es gibt mehrere Teile des Verfahrens, die problematisch sein kann. Erstens ist es wichtig, dass die Schnecke Kulturen nicht verhungern, als Hunger PG Stoffwechsel verändern können. Für Zufütterung werden NA22 Bakterien anstatt der häufiger verwendeten OP50 Bakterien weil NA22 erreicht höhere Dichte empfohlen. Allerdings mangelt es dem NA22 Stamm Antibiotikaresistenz und ist empfindlich gegen Verschmutzung. Zweitens synthetisieren Würmer individuelle PG Isomere in geringer Menge in Bezug auf Säugetiergeweben. Dies kann zum Teil auf Redundanz unter den zahlreichen Isomeren. Wir empfehlen ca. 6 Gramm Gewebe für eine umfassende Analyse und stärkere Signale. Weniger Gewebe (1-2 g) kann verwendet werden, wenn der getrocknete Extrakt in weniger Methanol resuspendiert werden: Wasser-Lösung in PG-Konzentration zu erhöhen. Jedoch kann nur ein bis zwei Injektionen durchgeführt werden. Die Nachweisgrenze der LC-MS/MS-System ca. 10 pgPGF 2α / ml. Ein ml von dicht gepackten gemischten Bühne Würmer (ca. 1 g) liefert etwa 25-50 pg CePGF2. Empfindlicher Massenspetrometriesysteme kann die Menge der Schnecke Gewebe zur Analyse. Drittens können Unterschiede in PG Extraktionseffizienz zwischen den Proben verursachen unterschiedliche Ergebnisse. Wir haben festgestellt, dass die Extraktion Effizienz sehr ähnlich, wenn Gewebe parallel extrahiert ist. Um die Effizienz zu bestimmen, fügen Sie 1,0 ng PGF 2α-d 4 auf der Stufe der Homogenisierung als interne Kontrolle. MRM mit Masse Übergang m / z 357/197 wird verwendet, um PGF 2α-d4 Konzentration relativ zu einer 1 ng / ml Standardlösung messen. Die Höhe der PGF 2α-d 4 während der Extraktion verloren wird dann berechnet.
Die Chromatographie Parameter und Masse Übergänge schließen wir können verändert werden, um anderen PGs und Eicosanoide detektieren. Trotz erheblicher Anstrengungen, haben wir nicht in der Lage, D-Serie oder E-ser identifizierenies PGs in den Extrakten 17. Darüber hinaus haben wir nicht 8-iso PGF 2α und 8-iso PGE 2, die charakteristisch für radikalisch initiierte Peroxidation, die eine Mischung von nicht-selektiven PG Stereoisomeren 19 erzeugt werden erkannt. Ob Würmer synthetisieren anderen PG-Typen ist nicht bekannt. Endocannabinoide und verschiedene Epoxy-und Hydroxy-Metaboliten von Arachidonsäure und Eicosapentaensäure Säuren in C. gefunden elegans extrahiert 5,7,20,21. Wir empfehlen die Verwendung von sowohl MRM und MS / MS im Vergleich zu authentischen Standards für die Quantifizierung und Identifizierung sind. Bei neuartigen Eicosanoide sollten diese Analysen mit einer vergleichenden Untersuchung von Fett-Mutanten, die einen Mangel an PUFA synthetisierende Enzyme 22, sowie einen funktionellen Assay, möglichst kombiniert werden. Ein Vorbehalt der Analyse ist, dass Fett-Mutanten winzige Mengen an PUFAs in Würmer ausreichend für PG-Synthese sind. Zum Beispiel Fett-2 (WA17) Mutanteneine kleine Menge von D12 Desaturaseaktivität (~ 5% der Wildtyp-22) und diese Mutanten noch produzieren PGs 6. fat-3 (WA22) und Fett-4 (WA14) Mutanten nicht zu PGs aus Arachidonsäure und Eicosapentaensäuren 16 abgeleitet synthetisieren . Wir haben auch festgestellt, dass Fett Mutanten für den Verlust von PUFA Klassen durch Hochregulierung PG-Synthese aus den verbleibenden Klassen kompensieren. Zum Beispiel, nicht Fett-3 (WA22) Mutanten, die meisten PGs aus 20 Kohlenstoff-PUFAs synthetisieren abgeleitet. Stattdessen werden sie bis zu regulieren Roman PGs aus 18 Kohlenstoff-PUFAs 16 abgeleitet. Bis heute haben wir keine C. identifiziert elegans-Stamm, der völlig unzulänglich in PG-Synthese ist. Es ist möglich, dass PGs essentiell für das Wachstum oder Entwicklung.
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Wir danken den UAB Targeted Metabolomics und Proteomics Laboratory, die zum Teil wurde von der UAB Skin Disease Research Center (P30 AR050948 zu C. Elmets), die UAB-UCSD O'Brien akuten Nierenschädigung Zentrum (P30 DK079337 A. Agarwal unterstützt ) und die UAB Lung Health Center (R01 HL114439, R01 HL110950 JE Blalock). Unterstützung für das Massenspektrometer war von einem NCRR Gemeinsame Besetzung Zuschuss (S10 RR19261 auf S. Barnes). Wir danken auch Ray Moore für den technischen Support. C. elegans-Stämme wurden durch die Caenorhabditis Genetics Center, das durch die NIH ist. Diese Arbeit wurde durch die NIH (R01GM085105 zu MAM, darunter ein ARRA administrative Ergänzung) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||
| REAGENTS | |||||||||||||||||
| X-large (16 cm) plates | Fisher Scientific | 0875714 | |||||||||||||||
| E. coli strain NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | NA22 | http://www.cgc.cbs.umn.edu | ||||||||||||||
| Acetone, 399.5% | Fisher Scientific | A928-4 | |||||||||||||||
| Butylated Hydroxytoluene | MP Biomedicals | 101162 | |||||||||||||||
| Hexane, HPLC grade | Fisher Scientific | H302-1 | |||||||||||||||
| Formic acid, 399% | Acros | AC27048-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
| Chloroform, HPLC grade | Acros | AC26832-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
| PGF2α-d4 | Cayman Chemicals | 316010 | Cayman has a wide array of standards available for purchase | ||||||||||||||
| Sterile screw cap self-standing 5 ml tube | Fisher Scientific | 14-222-651 | For use with Bullet Blender | ||||||||||||||
| 0.5 mm zirconium oxide beads | Next >>> Advance | ZrOB05 | |||||||||||||||
| 10 ml glass conical heavy-duty graduated centrifuge tubes | Kimble Kimax | 45200-10 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
| 15 ml glass conical tubes | Corning Pyrex | 8082-15 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
| Sigmacote (Siliconizing reagent) | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |||||||||||||||
| Teflon lined capped 1/2 Dram glass vial | Fisher Scientific | V1235C-TFE | |||||||||||||||
| EQUIPMENT | |||||||||||||||||
| CentraSL2 Clinical Centrifuge | Thomas Scientific | 2517N92-TS | |||||||||||||||
| Bullet Blender 5 blue homogenizer | Next >>> Advance | BBY5MB | A 40 ml Dounce homogenizer can be used as an alternative | ||||||||||||||
| Synergi 4 μm Hydro-RP 80 Å LC Column 250 x 2.0 mm | Phenomenenex | 00G-4375-B0 | HPLC Column | ||||||||||||||
| SecurityGuard Cartridges AQ C18 4 x 2.0 mm | Phenomenenex | AJ0-7510 | |||||||||||||||
| SecurityGuard Guard Cartridges Kit | Phenomenenex | KJ0-4282 | |||||||||||||||
| Shimadzu Prominence HPLC with refrigerated auto sampler | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | Any standard HPLC system coupled to a triple quadrupole mass spectrometer should be sufficient | |||||||||||||||
| API 4000 triple quadrupole mass spectrometer | Applied Biosystems/MDS SCIEX | ||||||||||||||||
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References
- Watts, J. L. Fat synthesis and adiposity regulation in Caenorhabditis elegans. Trends Endocrinol. Metab. 20, 58-65 (2009).
- Marza, E., Lesa, G. M. Polyunsaturated fatty acids and neurotransmission in Caenorhabditis elegans. Biochem. Soc. Trans. 34, 77-80 (2006).
- Edmonds, J. W., et al. Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction. Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).
- Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans. Genes Dev. 26 (3), 554-566 (2012).
- Kosel, M., et al. Eicosanoid formation by a cytochrome P450 isoform expressed in the pharynx of Caenorhabditis elegans. Biochem. J. 435, 689-700 (2011).
- Kubagawa, H. M., et al. Oocyte signals derived from polyunsaturated fatty acids control sperm recruitment in vivo. Nat Cell Biol. 8, 1143-1148 (2006).
- Lucanic, M., et al. N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 473, 226-229 (2011).
- Gerisch, B., et al. A bile acid-like steroid modulates Caenorhabditis elegans lifespan through nuclear receptor signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5014-5019 (2007).
- Edison, A. S. Caenorhabditis elegans pheromones regulate multiple complex behaviors. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 378-388 (2009).
- Funk, C. D. Prostaglandins and leukotrienes: advances in eicosanoid biology. Science. 294, 1871-1875 (2001).
- Wang, D., Dubois, R. N.
- Cha, Y. I., Solnica-Krezel, L., DuBois, R. N. Fishing for prostanoids: deciphering the developmental functions of cyclooxygenase-derived prostaglandins. Dev. Biol. 289, 263-272 (2006).
- Hata, A. N., Breyer, R. M. Pharmacology and signaling of prostaglandin receptors: multiple roles in inflammation and immune modulation. Pharmacol. Ther. 103, 147-166 (2004).
- Sugimoto, Y., Narumiya, S., Ichikawa, A. Distribution and function of prostanoid receptors: studies from knockout mice. Prog. Lipid Res. 39, 289-314 (2000).
- Basu, S. Isoprostanes: novel bioactive products of lipid peroxidation. Free Radic. Res. 38, 105-122 (2004).
- Hoang, H. D., Prasain, J. K., Dorand, D., Miller, M. A. A heterogenous mixture of F-series prostaglandins promotes sperm guidance in the C. elegans reproductive tract. PLoS Genetics. 9 (1), e1003271 (2013).
- Golovko, M. Y., Murphy, E. J. An improved LC-MS/MS procedure for brain prostanoid analysis using brain fixation with head-focused microwave irradiation and liquid-liquid extraction. J. Lipid Res. 49, 893-902 (2008).
- Murphy, R. C., et al. Electrospray ionization and tandem mass spectrometry of eicosanoids. Anal. Biochem. 346, 1-42 (2005).
- Milne, G. L., Yin, H., Morrow, J. D.
- Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes. Chem. Biodivers. 5, 2431-2441 (2008).
- Kulas, J., Schmidt, C., Rothe, M., Schunck, W. H., Menzel, R. Cytochrome P450-dependent metabolism of eicosapentaenoic acid in the nematode Caenorhabditis elegans. Arch. Biochem. Biophys. 472, 65-75 (2008).
- Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
