Summary
इस पत्र में, हम प्रास्टाग्लैंडिनों और अन्य eicosanoids से निकालने और विश्लेषण करने के लिए एक अनुकूलित प्रक्रिया का वर्णन
Abstract
Caenorhabditis एलिगेंस लिपिड 1-9 की जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली पशु मॉडल के रूप में उभर रहा है. Prostaglandins पॉलीअनसेचुरेटेड फैटी एसिड (PUFAs) 10-14 से व्युत्पन्न लिपिड संकेत हैं जो eicosanoids के एक महत्वपूर्ण वर्ग के हैं. ये संकेतन अणुओं की वजह से उनके कम बहुतायत और प्रतिक्रियाशील प्रकृति का अध्ययन करने के लिए मुश्किल हैं. प्रास्टाग्लैंडिनों की विशेषता फैटी एसिड रीढ़ के भीतर स्थित एक cyclopentane अंगूठी संरचना है. स्तनधारियों में, प्रास्टाग्लैंडिनों cyclooxygenase एंजाइम पर निर्भर है और स्वतंत्र रास्ते 10,15 के माध्यम से बनाई जा सकती है. सी. एलिगेंस cyclooxygenases 6,16,17 से स्वतंत्र prostaglandins के एक विस्तृत सरणी synthesizes. एफ श्रृंखला prostaglandins के एक बड़े वर्ग की पहचान की है, लेकिन eicosanoids के अध्ययन नई खोजों के लिए पर्याप्त कमरे के साथ एक प्रारंभिक चरण में किया गया है. यहाँ हम प्रास्टाग्लैंडिनों और अन्य eicosanoids निकालने और विश्लेषण करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन. आरोपी लिपिडएक तरल तरल निष्कर्षण तकनीक का उपयोग बड़े पैमाने पर कीड़ा संस्कृतियों से निकाला और electrospray ionization अग्रानुक्रम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LC-ESI-MS/MS) के लिए युग्मित तरल क्रोमैटोग्राफी द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं. ऐसे α-घ 4 PGF के रूप में 2 prostaglandins के deuterated एनालॉग, के शामिल किए जाने के लिए एक आंतरिक मानक मात्रात्मक विश्लेषण के लिए सिफारिश की है के रूप में. एकाधिक प्रतिक्रिया की निगरानी या एम आर एम जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती पशुओं के बीच विशिष्ट प्रोस्टाग्लैंडीन प्रकार यों और तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. टकराव प्रेरित विघटन या एमएस / एमएस महत्वपूर्ण ढांचागत सुविधाओं के बारे में जानकारी प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. लिक्विड क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (नियंत्रण रेखा एमएस) ऐसे मी / z 315-360 के रूप में एक चयनित जन रेंज के सर्वेक्षण स्कैन, प्रोस्टाग्लैंडीन के स्तर में वैश्विक परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम सभी तीन विश्लेषण का उदाहरण देते हैं. इन तरीकों उपन्यास eicosanoids की खोज और उनके चयापचय मार्ग delineating के लिए एक toolset के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करेगा.
Introduction
Prostaglandins (पीजीएस) बड़े पैमाने पर जांच की और जीवों 12-14 की एक विस्तृत सरणी में प्रजनन, प्रतिरक्षा, और विकास को विनियमित करने में शामिल किया गया है कि लिपिड हार्मोन का एक महत्वपूर्ण वर्ग के हैं. वे एक आम अग्रदूत (एस) से प्राप्त लिपिड की एक श्रृंखला शामिल है क्योंकि पीजीएस आदर्श व्यापक जीव विज्ञान प्रणाली विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं. निमेटोड सी. एलिगेंस आनुवंशिकी और प्रणालियों जीव विज्ञान में मौलिक सवालों का पता करने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल मॉडल जीवों में से एक है.
हमने दिखा दिया है कि सी. एलिगेंस एफ श्रृंखला पीजीएस synthesizes कि oocytes 3,6,16 को गतिशील शुक्राणु गाइड. क्रमश: तीन, चार, और पांच डबल बांड, एफ 1 शामिल हैं, F2, और F3 वर्गों, साथ 20 कार्बन PUFAs से व्युत्पन्न एफ श्रृंखला पीजीएस 3,16 पहचान की गई है. ये पीजीएस cyclooxygenase एंजाइमों की स्वतंत्र संश्लेषित, अभी तक PGF 1α और PGF 2α stereoisomers अभी जीई हैंnerated. सी. के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एलिगेंस पीजीएस, LC-MS/MS एक शक्तिशाली और संवेदनशील विश्लेषणात्मक तकनीक है. इस विश्लेषण के प्रदर्शन से पहले, यह विश्लेषणात्मक प्रक्रिया का प्रदर्शन भारी निकालने की गुणवत्ता पर निर्भर करता है क्योंकि एक अनुकूलित निष्कर्षण विधि विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है. लिक्विड क्रोमैटोग्राफी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री ही अनुपात (मी / z) चार्ज करने के लिए प्रत्याशित बड़े पैमाने पर है, साथ ही पीजी जनक आयन की वांछनीय शिखर आकार और अवधारण समय प्रदान कर सकते हैं. सी. में पीजीएस की मेटाबोलिक रूपरेखा एलिगेंस विभिन्न एमएस अधिग्रहण रणनीतियों की आवश्यकता होती है एक चुनौती भरा काम है.
नियंत्रण रेखा एमएस पूर्ण स्कैन या सर्वेक्षण स्कैनिंग (Q1 में स्कैनिंग) कि सबसे ionizable पीजीएस एक बड़े पैमाने पर spectrometric प्रतिक्रिया उत्पन्न होगा सुनिश्चित करने का फायदा है. सर्वेक्षण स्कैन जंगली प्रकार और उत्परिवर्ती सी. के संबंध में पीजीएस की कुल रूपरेखा पर उपयोगी जानकारी प्रदान करता है एलिगेंस, नाबालिग पीजीएस का पता लगाने के कम संवेदनशीलता की वजह से समझौता किया है. Nevertheकम, नियंत्रण रेखा एमएस सर्वेक्षण स्कैनिंग पीजीएस की एक वैश्विक दृष्टि दे और एक बड़े पीजी आबादी के उपापचय को प्रभावित करने के लिए भविष्यवाणी म्यूटेंट का विश्लेषण करने के लिए विशेष रूप से उपयोगी है सकते हैं.
Metabolite पहचान में, रासायनिक संश्लेषित पीजी मानकों के LC-MS/MS विश्लेषण पहला संदर्भ यौगिकों के रूप में अपने उत्पाद आयन स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए किया जाता है. ये स्पेक्ट्रा एक अज्ञात metabolite के स्पेक्ट्रम की तुलना में किया जा सकता है. एकाधिक प्रतिक्रिया की निगरानी (एम आर एम) मोड बढ़ाया संवेदनशीलता और विशिष्टता के लिए प्रयोग किया जाता है. एक एम आर एम प्रयोग एक परिसर के माता - पिता आयन / उत्पाद आयन जन संक्रमण निर्दिष्ट करने के द्वारा पूरा किया है. लक्ष्य analytes की मात्रा और संरचना जानने के द्वारा, यह कई अज्ञात मेटाबोलाइट्स के लिए सैद्धांतिक एम आर एम बदलाव की भविष्यवाणी करना संभव है.
सी. में समाजिक पीजीएस रूपरेखा के लिए एक अनुकूलित LC-MS/MS विधि एलिगेंस रिपोर्ट नहीं दी है. यहाँ हम नियंत्रण रेखा के एमएस और से मिलकर एक निष्कर्षण और एकीकृत मास स्पेक्ट्रोमेट्री दृष्टिकोण का वर्णन नियंत्रण रेखा, का पता लगाने बढ़ाता, और सी की जांच के लिए एमएस / एमएस तरीकों एलिगेंस पीजी मेटाबोलाइट्स. यह दृष्टिकोण अन्य eicosanoids के लिए लागू किया जा सकता है.
Protocol
कीड़ा संस्कृति, प्रोस्टाग्लैंडीन निकासी, और प्रोस्टाग्लैंडीन विश्लेषण: के रूप में नीचे वर्णित प्रोटोकॉल तीन वर्गों में बांटा गया है. के रूप में विख्यात नमूने अस्थायी रूप से -80 डिग्री सेल्सियस या -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है, जब कई बातें हैं
1. इल्ली संस्कृति
हम व्यापक LC-MS/MS के लिए मिश्रित चरण कीड़े के लगभग 6 ग्राम की सलाह देते हैं. यह पता लगाने में कम से कम छह अलग इंजेक्शन के लिए पर्याप्त सामग्री उपलब्ध कराने चाहिए. एक इंजेक्शन या दो में एम आर एम से जाना जाता पीजीएस की मात्रा का ठहराव के लिए, 1-2 छ पर्याप्त हैं. एक विशिष्ट चरण से मिलकर सिंक्रनाइज़ संस्कृतियों से अर्क के विश्लेषण से भी संभव है. अप करने के लिए 4 अलग उपभेदों एक साथ उगाया जा सकता है. उदाहरण के लिए, एक जंगली प्रकार नियंत्रण और तीन अलग उत्परिवर्ती उपभेदों.
- पूरक खिलाने के लिए 65 (16 सेमी) एक्स बड़े एन जी एम प्लेटों और केंद्रित बैक्टीरिया तैयार. बोने के लिए NA22 बैक्टीरिया का उपयोग करें. पूरक खिला, gro के लिए केंद्रित बैक्टीरिया बनाने के लिए16-24 घंटे के लिए लेग माध्यम में NA22 की w के कम से कम चार लीटर. स्पिन, M9 बफर के 100 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला, और resuspend बैक्टीरिया को दूर. इस केंद्रित बैक्टीरियल समाधान के 200 से 400 मिलीलीटर प्रत्येक कीड़ा तनाव के लिए आवश्यक हो सकता है. 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर
- 5 एक्स बड़े प्लेटों पर कीड़ा संस्कृतियों शुरू करो. प्लेटों गर्भवती वयस्कों से भरे हुए हैं जब तक लगभग 3 से 4 पीढ़ियों के लिए कीड़े आगे बढ़ें. केंद्रित बैक्टीरिया भुखमरी रोकने के लिए प्लेटों के लिए कहा, आवश्यक के रूप में (~ 1 मिलीग्राम / प्लेट और ढक्कन की जगह से पहले पूरी तरह से सूखी हैं) किया जाना चाहिए.
- M9 बफर के साथ प्लेटें बंद सगर्भ hermaphrodites धो लें और एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार polypropylene ट्यूब में कीड़े इकट्ठा.
- गर्भवती hermaphrodites नीचे (आमतौर पर 3-5 मिनट के बारे में) करने के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति दें. बैक्टीरिया, अंडे, और लार्वा चरण कीड़े सहित, सतह पर तैरनेवाला निकालें. 15 मिलीलीटर M9 बफर में Resuspend और धीरे मिश्रण.
- 60 वरीयता प्राप्त एन जी एम प्लेटों में से प्रत्येक के लिए कीड़ा निलंबन के 200 μl स्थानांतरण. प्लेटें भर में कीड़े फैलाने. कीड़ा समाधान मिश्रित रखेंसभी अच्छी तरह प्लेटें जब तक वे कीड़े के लगभग बराबर संख्या प्राप्त है कि यह सुनिश्चित करने के लिए वरीयता प्राप्त किया गया है.
- भुखमरी रोकने के लिए जरूरी (~ 1 ml/plate/12 के लिए 24 घंटे की अवधि) के रूप में केंद्रित बैक्टीरिया के साथ पूरक. प्लेटों के ढक्कन की जगह पहले शुष्क हवा की अनुमति दें. प्लेटों गर्भवती वयस्कों से भरे हुए हैं वरीयता प्राप्त कीड़े की मूल संख्या के आधार पर 2-4 पीढ़ियों के लिए कीड़े हो जाना, या जब तक.
- हार्वेस्ट कीड़ा प्लेटें एक समय में एक तनाव. M9 बफर के साथ प्लेटें बंद कीड़े धो लें और 50 मिलीलीटर polypropylene ट्यूब (जैसे 6 ट्यूब) में इकट्ठा. एक प्लेट धोने के लिए M9 बफर का प्रयोग करें, तो अगले थाली को कृमि से भरे बफर हस्तांतरण. प्लेटों की एक संख्या (उदाहरण के लिए. 10 वें) धोने के बाद, 50 मिलीलीटर ट्यूब कीड़ा भरा बफर हस्तांतरण. M9 बफर के साथ शीर्ष पर ट्यूब भरें. प्लेटों के आराम के लिए धोने दोहराएँ.
- गर्भवती वयस्कों 5-6 मिनट में नीचे के लिए व्यवस्थित रूप में, सतह पर तैरनेवाला (~ 35 मिलीलीटर) को हटाने और एक या दो ट्यूबों में मजबूत. Fr के साथ 50 मिलीलीटर ट्यूबों भरेंesh M9 बफर, 3-5 मिनट के लिए खड़े हो जाओ, और सतह पर तैरनेवाला छोड़ने गर्भवती वयस्कों को हटा दें. 3 बार दोहराएँ या तैरनेवाला पारदर्शी है जब तक.
- एक बड़े बोर पाश्चर पिपेट, दो 15 मिलीलीटर polypropylene शंक्वाकार ट्यूबों के लिए संभव के रूप में कई कीड़े के रूप में स्थानांतरण का उपयोग करना. एक नैदानिक अपकेंद्रित्र में 5 मिनट के लिए 1,000 आरसीएफ (CentraSL2 में ~ 3500 आरपीएम) में स्पिन. सतह पर तैरनेवाला निकालें और सब कीड़े ही ट्यूब में स्थानांतरित किया और pelleted कर रहे हैं जब तक दोहराएँ. -80 में संभव है और दुकान कीड़े के रूप में ज्यादा तैरनेवाला के रूप में निकालें डिग्री सेल्सियस सभी उपभेदों के लिए दोहराएँ.
2. प्रोस्टाग्लैंडीन निकालना
निकासी के लिए आवश्यक अभिकर्मकों नीचे दिखाई जाती हैं. विधि Golovko और मर्फी 17 के उस से संशोधित और LC-MS/MS संवेदनशीलता को बढ़ाता है जो तरल तरल शुद्धि के बाद, एसीटोन निकासी भी शामिल है. इसी तरह के परिणाम एक Dounce homogenizer के साथ प्राप्त किया जा सकता है, हालांकि एक गोली ब्लेंडर 5 homogenizer, प्रक्रिया में प्रयोग किया जाता है. Butylated hydroxytolueपूर्वोत्तर (BHT) और नाइट्रोजन के तहत वाष्पीकरण (एन 2) गैस ऑक्सीकरण रोकने के लिए किया जाता है. सभी कांच के बने पदार्थ लिपिड बाध्यकारी कम करने के लिए (Sigmacote) siliconized किया जाना चाहिए. कार्बनिक विलायकों के साथ निकालना एक रासायनिक हुड में प्रदर्शन किया जाना चाहिए.
- एक 50 मिलीलीटर polypropylene शंक्वाकार ट्यूब वजन. 6.5 मिलीलीटर निशान के पास एक गर्म धार के साथ ट्यूब के माध्यम से काटने से -80 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब से जमे हुए कीड़े का लगभग 6.0 ग्राम स्थानांतरण. एक मेथनॉल साफ रंग ट्यूब के नीचे से जमे हुए कीड़ा गोली निकालने के लिए किया जा सकता है. गोली के शीर्ष से निचले हिस्से, कम घने लार्वा कीड़े और अवशिष्ट बैक्टीरिया को पुनः प्राप्त करने के लिए गोली के माध्यम से काटने से पीछे रह गए हैं.
- पूर्व तौला 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब जमे हुए कीड़े स्थानांतरण. कई नमूने संसाधित किया जा रहा है, तुलनात्मक अध्ययन के लिए ऊतक का एक ही राशि (6.0 ग्राम) का उपयोग करें. एक पेस्ट में कीड़े पिघलना के रूप में, वांछित जन प्राप्त करने के लिए रंग के साथ कीड़े जोड़ या हटा दें. वैकल्पिक: विज्ञापननिष्कर्षण दक्षता के लिए एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में PGF 2α-D4 मानक के घ 1.00 एनजी.
- कीड़ा निलंबन के लिए 0.005% BHT साथ ठंडा 02:01 एसीटोन / खारा की 12 मिलीलीटर जोड़ें और vortexing द्वारा अच्छी तरह से मिलाएं. बुलेट ब्लेंडर में उपयोग के लिए बारह 5 मिलीलीटर स्वयं से चली आ रही प्लास्टिक की ट्यूब में से प्रत्येक के लिए कीड़ा घोल के 1.5 मिलीलीटर बांटना.
- 0.5 मिमी 0.7-0.8 मिलीलीटर जोड़ें व्यास Ceria प्रत्येक 5 मिलीलीटर ट्यूब zirconium ऑक्साइड मोती स्थिर हो. कसकर टोपियां बंद और बुलेट ब्लेंडर 5 homogenizer में 12 ट्यूब लोड. गति 8-9 पर 3 मिनट के लिए ब्लेंडर चलाने के लिए और बर्फ पर ट्यूबों की जगह. बहुत कसकर टोपी बंद करने के लिए या सामग्री बाहर फैल सकता है सुनिश्चित करें. एक त्रिविमेक्ष का उपयोग करते हुए एक स्लाइड पर एक ट्यूब से homogenate के 10 μl की जाँच करें. शेष बहुत कुछ बरकरार कीड़े होना चाहिए. यदि आवश्यक हो, एक मिनट के लिए एक ही रफ्तार से दोहराएँ.
- समान रूप से एक 9 "पाश्चर पिपेट का उपयोग कर चार 10 मिलीलीटर शंक्वाकार ग्लास ट्यूब को homogenates हस्तांतरण. स्थानांतरित मोतियों से बचें. तीन ट्यूबों seque से मोती धो लेंntially 01:02 एसीटोन / खारा युक्त BHT के 1 मिलीलीटर के साथ. सभी मोती धो रहे हैं जब तक अन्य ट्यूबों के लिए दोहराएँ. 10 एमएल ग्लास ट्यूब के लिए शेष समाधान (~ 4 एमएल) स्थानांतरण और बर्फ पर उन्हें जगह है.
- 4 में 10 एमएल ग्लास ट्यूब अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस 10 मिनट के लिए ~ 1000 XG पर एक नैदानिक अपकेंद्रित्र में. प्रत्येक ट्यूब से एक साफ 10 मिलीलीटर कांच शंक्वाकार ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला.
- एक रासायनिक हुड में, प्रत्येक 10 एमएल ग्लास ट्यूब को हेक्सेन के एक बराबर मात्रा में जोड़ें. उदाहरण के लिए, 3.5 मिलीग्राम एसीटोन / खारा समाधान के लिए 3.5 मिलीलीटर हेक्सेन जोड़ें. 30 सेकंड के लिए अधिकतम गति पर भंवर.
- 4 में 10 एमएल ग्लास ट्यूब अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस 10 मिनट के लिए ~ 1000 XG पर एक नैदानिक अपकेंद्रित्र में. हेक्सेन युक्त ऊपरी चरण और निष्पक्षता से आरोप लगाया लिपिड त्यागें.
- 2 एम फार्मिक एसिड (- 150 μl लगभग 100) का उपयोग पीएच 3.5 से कम चरण खट्टा करना. पीएच स्ट्रिप्स का उपयोग टेस्ट पीएच.
- प्रत्येक ट्यूब क्लोरोफॉर्म के एक बराबर मात्रा में जोड़ें. 30 सेकंड के लिए अधिकतम गति पर भंवर और 4 में ट्यूबों अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस मैं10 मिनट के लिए ~ 1000 XG पर ना नैदानिक अपकेंद्रित्र.
- निकालें और ऊपरी जलीय चरण त्यागें. अंतरावस्था परहेज, कम क्लोरोफॉर्म चरण के लिए किसी भी अवशिष्ट दूधिया अंतरावस्था के माध्यम से एक विंदुक टिप डालें. एक साफ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ग्लास ट्यूब से 4 ट्यूबों में से प्रत्येक से कम चरण लीजिए. कम से कम 24 घंटे के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. इस बिंदु पर, निकालने के दो सप्ताह तक के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है.
- फ्रीजर से निकालने के लिए बाहर ले जाओ और अगर मौजूद है, शेष दूधिया जलीय ऊपर परत त्यागें. एक नए पाश्चर pipet का उपयोग एक Teflon अटे लेबल साढ़े घूंट कांच की शीशी को क्लोरोफॉर्म चरण स्थानांतरण. एक रासायनिक हुड में, एन 2 गैस का एक कोमल प्रवाह के तहत सूखापन को क्लोरोफॉर्म घुलनशील अंश लुप्त हो जाना. सूखे निकालने के लिए 2 सप्ताह तक के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर भंडारित किया जा सकता है. पीजी निष्कर्षण और विश्लेषण के लिए इस्तेमाल के लिए एक समग्र योजना चित्र 1 में दिखाया गया है.
3. प्रोस्टाग्लैंडीन विश्लेषण
- स्टॉक तैयारएक काम कर समाधान प्राप्त करने के लिए पानी (08:02 v / v): ऐसे PGF 2α या PGF 2 मेथनॉल में α-D4 (1 ग्राम / एमएल) के रूप में और मेथनॉल के साथ पतला व्यक्ति के संदर्भ प्रास्टाग्लैंडिनों, का समाधान. एक मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए dilutions की एक श्रृंखला (100, 10, 1, 0.1, 0.01 एनजी / एमएल) तैयार करें.
- सूखे सी. करने के लिए पानी (08:02 v / वी): 200 μl मेथनॉल जोड़ें एलिगेंस लिपिड निकालने (एस) और मिश्रण अच्छी तरह से. पानी समाधान: कीड़ा ऊतक के कम से कम 6 ग्राम निकाला गया था, तो सूखे निकालने मेथनॉल की कम मात्रा में resuspended किया जाना चाहिए.
- पानी में 0.1% चींटी एसिड से मिलकर मोबाइल चरण तैयार [एक] और 0.1% चींटी एसिड युक्त acetonitrile [बी].
- 4 डिग्री सेल्सियस पर autosampler सेट और एक 70 गिनती 1.5 मिलीग्राम शीशी रैक में नमूना शीशियों जगह है.
- के बारे में 5 मिनट के लिए 0.2 मिलीग्राम / मिनट की एक प्रवाह दर में 0.1% चींटी एसिड के साथ सिनर्जी पनबिजली आरपी-C18 स्तंभ संतुलित करना.
- स्तंभ में नमूना (20-50 μl) इंजेक्षन. ढाल क्षालन शुरू निष्पादित करेंआईएनजी 10% बी के साथ और 0-11 मिनट, 11-14 मिनट से 80-100% बी, से 80% बी करने के लिए ऊपर जा रहा है और 16 मिनट से कम 10% बी को वापस लौटने. कुल चलाते समय 20 मिनट है. 13 प्रामाणिक मानकों की अवधारण समय संदर्भ 3 के लिए 1 टेबल में दिखाया जाता है.
- नकारात्मक आयन मोड में एक ईएसआई इंटरफेस ऑपरेटिंग उपयोग कर मास स्पेक्ट्रोमीटर में प्रवाह स्तंभ का परिचय दें. नाइट्रोजन एक छिटकानेवाला और पर्दा गैस (चालू = 10) के रूप में प्रयोग किया जाता है. टक्कर गैस, टक्कर ऊर्जा, और तापमान क्रमश: 10, -35 EV और 600 डिग्री सेल्सियस पर सेट कर रहे हैं. Declustering क्षमता (डीपी), टक्कर ऊर्जा (सीई), और सेल से बाहर निकलने की क्षमता (CXP) क्रमशः, -90, -35 और -10 में स्थापित कर रहे हैं.
- सर्वेक्षण स्कैन (Q1 के स्कैन) के लिए, सबसे पीजीएस (चित्रा 2) के लिए मी / z 315-360 के जन रेंज में नकारात्मक आयन मोड का उपयोग करें. सीमा ब्याज के यौगिक (ओं) की बड़े पैमाने पर निर्भर करता है, बदला जा सकता है. नियंत्रण रेखा एमएस आयन chromatograms की कुल आयन वर्तमान (घरेलू) से आयनों निकालें और निर्धारित extrac चाहेटेड आयनों deprotonated या अभिवर्तन आयनों के अनुरूप, या टुकड़ा आयनों.
- एम आर एम प्रयोगों के लिए, जन के संक्रमण मी / z 355/311 एफ 1 वर्ग का पता लगाने के लिए किया जाता है, मी / z 353/193 एफ 2 वर्ग के लिए प्रयोग किया जाता है, और मीटर z / 351/193 या 351/191 F3 के वर्ग के लिए प्रयोग किया जाता है (चित्रा 3). एम आर एम भी आंतरिक मानक (उदाहरण के लिए, मी / z 357/197 PGF 2α-D4 के लिए) का पता लगाने के लिए और मानक वक्र उत्पन्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है. पीजी बड़े पैमाने पर बदलाव 18 पर अतिरिक्त जानकारी के लिए मर्फी एट अल. देखें.
- एमएस / एमएस प्रयोगों के लिए, एफ 1 वर्ग, मी / z 353for F2 वर्ग, और मी / z 351for F3 वर्ग पीजीएस के लिए मीटर z / 355 का उपयोग करें. सी. एफ श्रृंखला पीजीएस के लिए एलिगेंस एमएस / एमएस डेटा चित्रा 4 और 2 टेबल 3,16 में उपलब्ध है. स्तनधारी eicosanoids के लिए एमएस / एमएस डेटा पर उपलब्ध है www.lipidmaps.org .
- Analys उपयोग कर विश्लेषणात्मक डेटा की प्रक्रियाटी सॉफ्टवेयर (संस्करण 1.4.2, एप्लाइड Biosystems).
Representative Results
नमूना तैयार Golovko और मर्फी 17 से अनुकूलित तरल तरल निष्कर्षण द्वारा किया गया. यह आंतरिक मानक (PGF 2α-D4) के शानदार वसूली प्रदान की. सी. से पीजी निकासी के लिए सामान्य योजना एलिगेंस चित्र 1 में दिखाया गया है. Chromatographic शर्तों> 30 eicosanoid मानकों (1 टेबल 13 मानकों से पता चलता है) की आधारभूत जुदाई प्रदान करने के लिए अनुकूलित किया गया. 0.1% चींटी एसिड युक्त पानी और acetonitrile साथ एक पन आर.पी. स्तंभ (250 x 2.0 मिमी आईडी) सबसे अच्छा जुदाई और संवेदनशीलता प्रदान की. जंगली प्रकार और वसा 3 उत्परिवर्ती अर्क का सर्वेक्षण स्कैन 315-360 परमाणु जन इकाइयों की बड़े पैमाने पर सीमा के भीतर आयनों के चित्रा 2 दस्तावेज़ वैश्विक स्तर में दिखाया गया है. वसा 3 (wa22) म्यूटेंट सबसे अधिक 20 कार्बन PUFAs की कमी है. एक F3 वर्ग पीजी प्रकाश डाला है. चित्रा 3 में, एक जंगली प्रकार निकालने के एम आर एम विश्लेषण F1 के कई पीजी आइसोमरों (चित्रा 3A दिखाने एनजी>), एफ 2 (3B चित्रा), और F3 (आंकड़े -3 सी और 3 डी) वर्गों. F3 के वर्ग दो बड़े पैमाने पर बदलाव के साथ या तो पता लगाया जा सकता है, मी / z 351/193 या मीटर z / 351/191. CePGF2 मुख्य रूप PGF 2α enantiomer के शामिल है. CePGF1 PGF 1α या अपने enantiomer होने की संभावना है. चित्रा 4 CePGF2 की टक्कर प्रेरित अपघटन (आर टी = 11.8) PGF2 α मानक की तुलना में (आर टी = 11.8) से पता चलता है. उत्पाद आयनों में मामूली अंतर होने की संभावना निकालने में कम CePGF2 बहुतायत और सह एल्यूटिंग यौगिकों के कारण हैं.
चित्रा 1. सी. के योजनाबद्ध आरेख एलिगेंस पीजीएस निष्कर्षण और नियंत्रण रेखा एमएस विश्लेषण करती है. दोनों लिपिड ऑक्सीकरण को कम करने के लिए 0.005% BHT है एसीटोन / खारा और क्लोरोफॉर्म ध्यान दें. अधिक जानकारी के लिए पाठ को देखें.http://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 2. जंगली प्रकार और वसा 3 (wa22) उत्परिवर्ती अर्क की मी / z 315-360. लिक्विड क्रोमैटोग्राफी प्रतिधारण समय (आर टी) के सर्वेक्षण स्कैन पैनल [ए] में दिखाया गया है. आरटी पर निकाले आयनों = 11.3 जंगली प्रकार [बी] और वसा 3 (wa22) [सी] के अर्क के लिए दिखाए जाते हैं. जन मीटर z / 351 के साथ एक F3 वर्ग पीजी प्रकाश डाला है. सीपीएस, मायने रखता है / सेक, एएमयू, परमाणु जन इकाई.
अंजीरउरे 3. जंगली प्रकार के अर्क के एम आर एम विश्लेषण. एफ 1 वर्ग पीजीएस जन संक्रमण मी / z 355/311 [ए] के साथ पाया जाता है. पीजीएस होने की उम्मीद नहीं कर रहे हैं जो कई हाइड्रोफोबिक यौगिकों (आरटी> 14 मिनट) ने भी इस संक्रमण से पता चला रहे हैं उस पर ध्यान दें. एफ 2 वर्ग पीजीएस जन संक्रमण से पता चला रहे हैं मीटर z / 353/193 [बी]. F3 वर्ग पीजीएस या तो जन संक्रमण से पता चला रहे हैं मीटर z / 351/193 [सी] या मीटर z / 351/191 [डी]. अर्क प्रत्येक वर्ग के कई पीजी आइसोमरों कि रोकने पर ध्यान दें. नंबर 2 तालिका में दिखाया पीजीएस के अनुरूप हैं. CePGF2 की एकाग्रता 1.8 एनजी / मिली है. आरटी, प्रतिधारण समय, सीपीएस, मायने रखता है / सेक.
4 चित्रा. रासायनिक synth के टकराव प्रेरित अपघटनPGF 2α और CePGF2 esized. पैनल में तीर [एक] PGF 2α और CePGF2 (आर टी = 11.8) के बीच साझा उत्पाद या विखंडन आयनों का संकेत मिलता है. मी / z 309 और मी / z 193 पर उत्पाद आयनों दिखाया संरचनाओं के अनुरूप संकेत दरार साइटों (ए और बी प्रकाश डाला), से उत्पन्न, और एफ श्रृंखला पीजीएस के लक्षण हैं [बी] कर रहे हैं. सीपीएस, मायने रखता है / सेक. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .
| मानक | आर टी (मिनट) | [महाराष्ट्र] - मी / z | एमएस / एमएस में प्रमुख उत्पाद आयनों | ||||
| 20 हाइड्रोक्सी पीजीई 2 | 9.43 | 367 | 349, 331, 287, 234, 189, 129, 109 | PGF 3 - | 11.26 | 351 | 333, 307, 289, 271, 245, 219, 209, 193, 191, 171, 165, 111 |
| बी 2 थ्राम्बाक्सेन | 11.66 | 369 | 289, 191, 177, 169, 151 | ||||
| PGF 2 - | 11.80 | 353 | 335, 309, 291, 273, 263, 247, 235, 209, 193, 171, 165, 111 | ||||
| PGF 1 - | 11.79 | 355 | 337, 319,311, 301, 293, 275, 265, 237, 211, 195 | ||||
| Lipoxin बी 4 | 12.38 | 351 | 201, 191,189, 165, 155, 115, 107, 71, 59 | ||||
| पीजीडी 2 | 12.56 | 351 | 315, 271,203, 189 | ||||
| 5 (एस), 6 (नि.) - Lipoxin एक 4 | 12.83 | 351 | 235, 217, 189, 144, 135, 115, 99, 59 | ||||
| पीजीए 2 | 14.02 | 333 | 315, 297, 271, 235, 191, 189, 175, 163, 137, 113, 109 | ||||
| Δ12-PGJ 2 | 14.20 | 333 | 271, 189, 123 | ||||
| Leukotriene बी 4 | 14.73 | 335 | 181, 109, 93, 71, 69, 59, 57 | ||||
| 15d-Δ 12,14-PGJ 2 | 16.80 | 315 | 297, 271, 217, 203, 158 | ||||
| 5 (एस) HpETE | 17.88 | 335 | 97, 83, 81, 57 |
तालिका 1. रिटेंशन बार और LC-MS/MS विधि 3 से 13 eicosanoid मानकों के प्रमुख उत्पाद आयनों. 30 ओवर मानकों LC-MS/MS कार्यक्रम विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया गया. chromatographic प्रतिधारण बार (आरटीएस) भी बहुत समान पीजीएस के बीच मतभेद है. एक अपवाद PGF 1α और PGF 2α है. फिर भी, इन पीजीएस हैं घ(- मी / z [महाराष्ट्र]) और टक्कर प्रेरित अपघटन स्पेक्ट्रा (एमएस / एमएस) अपने माता - पिता आयन जनता द्वारा istinguished.
| प्रोस्टाग्लैंडीन वर्ग | चित्रा 3 में नहीं. | [महाराष्ट्र] - मी / z | एमएस / एमएस में प्रमुख उत्पाद आयनों |
| एफ 1 (CePGF1) | 1 | 355 | 319, 301, 311, 293, 275, 265, 237, 223, 211, 195, 157 |
| एफ 1 | 2 | 355 | 311, 301, 293, 275, 265, 211, 195, 167, 157 |
| एफ 2 (CePGF2) | 3 | 353 | 309, 291, 273, 263, 247, 209, 193, 171, 165, 127 |
| F2 | 4 | 353 | 309, 291, 273, 263, 255, 247, 219, 209, 193, 171, 113 |
| F3 | 5 | 351 | 315, 307, 289, 275, 249, 205, 193, 191, 167, 153, 139 |
| F3 | 6 | 351 | 333, 289, 271, 261, 245, 223, 193, 191, 163 |
तालिका 2. कई प्रमुख सी. के लिए टकराव प्रेरित अपघटन उत्पाद आयनों एलिगेंस F1, F2, और F3 पीजीएस 3 चित्र में दिखाया गया है. अन्य कम प्रचुर मात्रा isomers का एमएस / एमएस नहीं दिखाए जाते हैं. ये आंकड़े कई विश्लेषण से कर रहे हैं और सभी उत्पाद आयनों किसी दिए गए समय में दिखाई दे सकता है. अर्क की जटिलता को देखते हुए, कुछ कम प्रचुर मात्रा में उत्पाद आयनों हस्तक्षेप से इसी तरह की अवधारण समय या परिणाम के साथ एक और माता पिता आयन से प्राप्त कर सकते हैं. पीक 2 संभावना CePGF1 के एक stereoisomer है और चोटी के 4 संभावना CePGF2 के एक stereoisomer है. अतिरिक्त डेटा 3 के लिए एडमंड्स, एट अल. (2010) देखें.
Discussion
हम एफ श्रृंखला पीजीएस पर ध्यान केंद्रित, eicosanoid निष्कर्षण और विश्लेषण के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन. समस्याग्रस्त हो सकता है कि प्रक्रिया के कई हिस्से हैं. सबसे पहले, यह भुखमरी पीजी चयापचय को बदल सकते हैं के रूप में कीड़ा संस्कृतियों, भूखा नहीं है कि महत्वपूर्ण है. NA22 उच्च घनत्व पहुंचता है क्योंकि पूरक खिलाने के लिए, NA22 बैक्टीरिया के बजाय और आमतौर पर इस्तेमाल OP50 बैक्टीरिया की सिफारिश कर रहे हैं. हालांकि, NA22 तनाव एंटीबायोटिक प्रतिरोध का अभाव है और संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील है. दूसरा, कीड़े स्तनधारी ऊतकों के सापेक्ष कम बहुतायत में व्यक्तिगत पीजी आइसोमरों synthesize. इस भाग में कई isomers के बीच अतिरेक के कारण हो सकता है. हम व्यापक विश्लेषण और मजबूत संकेतों के लिए ऊतक के बारे में 6 ग्राम की सलाह देते हैं. सूखे निकालने कम मेथनॉल में resuspended है तो कम ऊतक (1-2 ग्राम) का उपयोग किया जा सकता है: पानी के घोल पीजी एकाग्रता बढ़ाने के लिए. हालांकि, केवल एक से दो इंजेक्शन प्रदर्शन किया जा सकता है. हमारे LC-MS/MS प्रणाली का पता लगाने सीमा 10 स्नातकोत्तर के बारे में हैPGF 2α / एमएल. घनी पैक मिश्रित चरण कीड़े की एक मिलीलीटर (लगभग 1 ग्राम) CePGF2 के लगभग 25-50 स्नातकोत्तर पैदावार. अधिक संवेदनशील मास स्पेक्ट्रोमेट्री सिस्टम विश्लेषण के लिए आवश्यक कीड़ा ऊतक की मात्रा को कम कर सकते हैं. तीसरा, नमूनों के बीच पीजी निकासी दक्षता में मतभेद चर परिणाम हो सकते हैं. हम निकासी दक्षता ऊतकों समानांतर में निकाले जाते हैं जब इसी तरह की है कि मिल गया है. दक्षता का निर्धारण करने के लिए, एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में homogenization के कदम पर PGF 2α घ 4 से 1.0 एनजी जोड़ें. एम आर एम मी / z 357/197 एक 1 एनजी / एमएल मानक समाधान के सापेक्ष PGF 2α-D4 एकाग्रता को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है बड़े पैमाने पर संक्रमण का उपयोग कर. निकासी के दौरान खो PGF 2α घ 4 की राशि तो गणना की जाती है.
हम शामिल क्रोमैटोग्राफी मापदंडों और बड़े पैमाने पर बदलाव अन्य पीजीएस और eicosanoids पता लगाने के लिए बदला जा सकता है. काफी प्रयास के बावजूद, हम डी सीरीज या ई सेवाओं की पहचान करने में सक्षम नहीं किया गया हैएँ अर्क 17 में पृ. इसके अलावा, हम 8 आईएसओ PGF 2α और पीजी stereoisomers 19 की एक nonselective मिश्रण उत्पन्न करता है जो मुक्त कणों द्वारा शुरू किए peroxidation, की विशेषता है कि 8 आईएसओ पीजीई 2 का पता नहीं है. कीड़े अन्य पीजी प्रकार synthesize ज्ञात नहीं है. Endocannabinoids और arachidonic और eicosapentaenoic एसिड के विभिन्न epoxy और हाइड्रोक्सी मेटाबोलाइट्स सी में पाया गया है एलिगेंस 5,7,20,21 निकालता है. हम क्रमशः मात्रा का ठहराव और पहचान के लिए प्रामाणिक मानकों की तुलना में एम आर एम और एमएस / एमएस दोनों के उपयोग की सलाह देते हैं. उपन्यास eicosanoids के लिए, इन विश्लेषण संभव हो तो, एंजाइमों 22, साथ ही एक कार्यात्मक परख synthesizing PUFA में कमी कर रहे हैं, जो वसा म्यूटेंट, का एक तुलनात्मक अध्ययन के साथ जोड़ा जाना चाहिए. वसा म्यूटेंट का विश्लेषण करने के लिए एक चेतावनी है कि कीड़े में मौजूद PUFAs की मात्रा मिनट पीजी संश्लेषण के लिए पर्याप्त हैं. उदाहरण के लिए, वसा -2 (wa17) म्यूटेंटडी 12 desaturase गतिविधि की एक छोटी राशि (~ 5 जंगली प्रकार की 22%) और इन म्यूटेंट अभी पीजीएस 6 का उत्पादन. वसा 3 (wa22) और वसा -4 (WA14) म्यूटेंट arachidonic और eicosapentaenoic एसिड 16 से व्युत्पन्न पीजीएस synthesize करने में विफल है . हम यह भी वसा म्यूटेंट शेष वर्गों से ऊपर विनियमन पीजी संश्लेषण द्वारा PUFA वर्गों के नुकसान की भरपाई के लिए मिल गया है. उदाहरण के लिए, वसा 3 (wa22) म्यूटेंट 20 कार्बन PUFAs से निकाली गई सबसे पीजीएस synthesize करने में विफल. इसके बजाय, वे 18 कार्बन PUFAs 16 से व्युत्पन्न उपन्यास पीजीएस अप विनियमित करने के लिए दिखाई देते हैं. तिथि करने के लिए, हम एक सी. पहचान नहीं है पीजी संश्लेषण में पूरी तरह से कमी है कि एलिगेंस तनाव. यह पीजीएस विकास या विकास के लिए आवश्यक हैं कि संभव है.
Disclosures
लेखक ब्याज की कोई संघर्ष है.
Acknowledgments
हम UAB त्वचा रोग अनुसंधान केंद्र (सी. Elmets को P30 AR050948), UAB-UCSD ओ ब्रायन तीव्र गुर्दे की चोट केंद्र (P30 DK079337 ए अग्रवाल करने के हिस्से में समर्थित किया गया है जो UAB लक्षित Metabolomics और प्रोटिओमिक्स प्रयोगशाला, धन्यवाद ) और UAB फेफड़े स्वास्थ्य केंद्र (R01 HL114439, R01 HL110950 जेई Blalock के लिए). मास स्पेक्ट्रोमीटर के लिए समर्थन एक NCRR साझा इंस्ट्रुमेंटेशन अनुदान (एस बार्न्स को S10 के RR19261) से था. हम भी तकनीकी सहायता के लिए रे मूर धन्यवाद. सी. एलिगेंस उपभेदों NIH द्वारा वित्त पोषित है जो Caenorhabditis जेनेटिक्स सेंटर द्वारा प्रदान किया गया. इस काम एनआईएच (एक ARRA के प्रशासनिक पूरक सहित R01GM085105 को MAM,) द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||
| REAGENTS | |||||||||||||||||
| X-large (16 cm) plates | Fisher Scientific | 0875714 | |||||||||||||||
| E. coli strain NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | NA22 | http://www.cgc.cbs.umn.edu | ||||||||||||||
| Acetone, 399.5% | Fisher Scientific | A928-4 | |||||||||||||||
| Butylated Hydroxytoluene | MP Biomedicals | 101162 | |||||||||||||||
| Hexane, HPLC grade | Fisher Scientific | H302-1 | |||||||||||||||
| Formic acid, 399% | Acros | AC27048-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
| Chloroform, HPLC grade | Acros | AC26832-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
| PGF2α-d4 | Cayman Chemicals | 316010 | Cayman has a wide array of standards available for purchase | ||||||||||||||
| Sterile screw cap self-standing 5 ml tube | Fisher Scientific | 14-222-651 | For use with Bullet Blender | ||||||||||||||
| 0.5 mm zirconium oxide beads | Next >>> Advance | ZrOB05 | |||||||||||||||
| 10 ml glass conical heavy-duty graduated centrifuge tubes | Kimble Kimax | 45200-10 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
| 15 ml glass conical tubes | Corning Pyrex | 8082-15 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
| Sigmacote (Siliconizing reagent) | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |||||||||||||||
| Teflon lined capped 1/2 Dram glass vial | Fisher Scientific | V1235C-TFE | |||||||||||||||
| EQUIPMENT | |||||||||||||||||
| CentraSL2 Clinical Centrifuge | Thomas Scientific | 2517N92-TS | |||||||||||||||
| Bullet Blender 5 blue homogenizer | Next >>> Advance | BBY5MB | A 40 ml Dounce homogenizer can be used as an alternative | ||||||||||||||
| Synergi 4 μm Hydro-RP 80 Å LC Column 250 x 2.0 mm | Phenomenenex | 00G-4375-B0 | HPLC Column | ||||||||||||||
| SecurityGuard Cartridges AQ C18 4 x 2.0 mm | Phenomenenex | AJ0-7510 | |||||||||||||||
| SecurityGuard Guard Cartridges Kit | Phenomenenex | KJ0-4282 | |||||||||||||||
| Shimadzu Prominence HPLC with refrigerated auto sampler | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | Any standard HPLC system coupled to a triple quadrupole mass spectrometer should be sufficient | |||||||||||||||
| API 4000 triple quadrupole mass spectrometer | Applied Biosystems/MDS SCIEX | ||||||||||||||||
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References
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