Summary
I denna uppsats beskriver vi en optimerad procedur för att extrahera och analysera prostaglandiner och andra eikosanoider från
Abstract
Caenorhabditis elegans framstår som en kraftfull djurmodell för att studera biologi lipider 1-9. Prostaglandiner är en viktig klass av eikosanoider, som är lipid signaler som härrör från fleromättade fettsyror (PUFA) 10-14. Dessa signalmolekyler är svåra att studera på grund av deras låga förekomst och reaktiv karaktär. Det karaktäristiska för prostaglandiner är en cyklopentanring struktur ligger inom fettsyran ryggraden. Hos däggdjur kan prostaglandiner bildas genom Cyklooxygenasenzymet-beroende och-oberoende vägar 10,15. C. elegans syntetiserar ett brett utbud av prostaglandiner oberoende av cyklooxygenaser 6,16,17. En stor klass av F-serien prostaglandiner har identifierats, men studier av eikosanoider är i ett tidigt skede med gott om plats för nya upptäckter. Här beskriver vi ett förfarande för att extrahera och analysera prostaglandiner och andra eikosanoider. Laddad lipids utvinns från samlas mask odlingar med användning av en vätske-vätske-extraktionsteknik och analyserades med vätskekromatografi kopplad till elektrosprayjonisering tandemmasspektrometri (LC-ESI-MS/MS). Införandet av deutererade analoger av prostaglandiner, såsom PGF 2 α-d4 som inre standard rekommenderas för kvantitativ analys. Flera reaktion övervakning eller MRM kan användas för att kvantifiera och jämföra specifika prostaglandin typer mellan vildtyp och muterade djur. Kollision-inducerad nedbrytning eller MS / MS kan användas för att få information om viktiga strukturella drag. Vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS) undersökning skanningar av ett valt massområde, såsom m / z 315 till 360 kan användas för att utvärdera globala förändringar i prostaglandin nivåer. Vi ger exempel på alla tre analyser. Dessa metoder kommer att ge forskare med ett verktyg för att upptäcka nya eikosanoider och avgränsar deras metaboliska vägar.
Introduction
Prostaglandiner (PG) är en viktig klass av lipid hormoner som har undersökts och inblandad i regleringen av reproduktionen, immunitet och utveckling i ett brett spektrum av organismer 12-14. PGs är idealiskt lämpade för omfattande systembiologiska analyser eftersom de innefatta en serie av lipider härledda från en gemensam prekursor (er). Nematoden C. elegans är en av de mest använda modellorganismer för att ta itu med grundläggande frågor i genetik och systembiologi.
Vi har visat att C. elegans syntetiserar F-seriens PG som styr rörliga spermier till oocyter 3,6,16. F-seriens PG härledda från 20-kol PUFAs med tre, fyra och fem dubbelbindningar, innefattande F1, F2, och F3 klasser, respektive har identifierats 3,16. Dessa PGs syntetiseras oberoende av cyklooxygenas enzymer, men PGF 1α och PGF 2α stereoisomerer är fortfarande GEnerated. För kvalitativa och kvantitativa analyser av C. elegans PGs är LC-MS/MS en kraftfull och känslig analysteknik. Innan denna analys, är det viktigt att utveckla en optimerad extraktion metod eftersom utförandet av den analytiska processen starkt beroende av extraktet kvalitet. Vätskekromatografi och masspektrometri kan endast ge förutses massa till laddningsförhållande (m / z), såväl som önskvärda toppform och retentionstid av PG moderjonen. Metabola profilering av PG i C. elegans är en utmanande uppgift som kräver olika MS förvärv strategier.
LC-MS fullständig genomsökning eller undersökning skanning (Q1 scanning) har fördelen att de joniserbara PGs kommer att generera en masspektrometrisk svar. Medan undersökningen scan ger användbar information om total profilering av PGs med avseende på vildtyp och mutant C. elegans, detektering av mindre PGs är nedsatt på grund av låg känslighet. Icke destomindre, kan LC-MS undersökning skanning ger en samlad bild av PGs och är särskilt användbart för att analysera mutanter förutspås påverka metabolismen av ett stort PG befolkning.
I metabolit identifiering, är LC-MS/MS analys av kemiskt syntetiserade PG standarder uruppfördes att få deras spektra produkt jon som referensföreningar. Dessa spektra kan jämföras med det spektrum av en okänd metabolit. Flera reaktion övervakning (MRM)-läget används för ökad känslighet och specificitet. En MRM experiment åstadkoms genom att ange moderjonen / produkt övergång jonmassan av en förening. Genom att veta massan och strukturen på målanalyter, är det möjligt att förutsäga teoretiska MRM övergångar för många okända metaboliter.
En optimerad LC-MS/MS metod för profilering isomera PGs i C. elegans har inte rapporterats. Här beskriver vi en extraktion och integrerad masspektrometri tillvägagångssätt bestående av LC-MS-och LC-MS / MS-metoder för detektion, kvantifiering och utreda C. elegans PG metaboliter. Denna metod kan tillämpas på andra eikosanoider.
Protocol
Protokollet som beskrivs nedan är uppdelad i tre sektioner: avmaska kultur, prostaglandin utvinning, och prostaglandin analys. Som nämnts, det finns flera punkter när prover kan tillfälligt förvaras vid -80 ° C eller -20 ° C.
Ett. Worm Kultur
Vi rekommenderar ca 6 g blandade scenen maskar för omfattande LC-MS/MS. Detta bör ge tillräckligt med material för detektion minst sex separata injektioner. För kvantifiering av kända PGs av MRM i en enda injektion eller två, 1-2 g är tillräcklig. Analys av extrakt från synkroniserade kulturer bestående av ett visst skede är också möjlig. Upp till 4 olika stammar kan odlas samtidigt. Till exempel, en vild typ kontroll och tre olika mutantstammar.
- Förbered 65 X-large (16 cm) NGM plattor och koncentrerade bakterier för extra utfodring. Använd NA22 bakterier för sådd. För att göra koncentrerade bakterier för extra utfodring, Grow minst fyra liter NA22 i LB-medium för 16-24 tim. Centrifugera ner, avlägsna supernatanten och återsuspendera bakterier i 100 ml M9-buffert. 200-400 ml av denna koncentrerade bakteriell lösning kan krävas för varje mask stam. Förvara vid 4 ° C.
- Starta mask kulturer på 5 X-stora plattor. Odla maskar för cirka 3 till 4 generationer tills plattorna är fulla av dräktiga vuxna. Koncentrerade bakterier bör läggas till plattorna för att förhindra svält, vid behov (~ 1 ml / plattan och låt torka helt innan du sätter tillbaka locket).
- Tvätta dräktiga hermafroditer off plattor med M9-buffert och samla maskar i en 50 ml koniskt polypropenrör.
- Tillåt dräktiga hermafroditer att sjunka till botten (vanligtvis ca 3-5 min). Avlägsna supernatanten, inklusive bakterier, ägg och larver maskar scenen. Återsuspendera i 15 ml M9 buffert och blanda försiktigt.
- Överför 200 pl av masken suspensionen till var och en av 60 ympade NGM plattor. Skingra maskar över plattorna. Håll masken lösning blandasväl tills alla plattor har ympats att säkerställa att de får ungefär lika många maskar.
- Komplettera med koncentrerade bakterier som behövs (~ 1 ml/plate/12 till 24 tim period) för att undvika svält. Låt plattorna lufttorka innan du sätter lock. Odla maskar för 2-4 generationer, beroende på det ursprungliga antalet sådda maskar, eller tills plattorna är fulla av dräktiga vuxna.
- Harvest mask plattorna en stam i taget. Tvätta maskar bort plattorna med M9 buffert och samla in 50 ml polypropenrör (t.ex. 6 tuber). Använd M9 buffert för att tvätta en tallrik, sedan överföra masken fylld buffert till nästa platta. Efter tvättning ett antal (t ex. 10: e) av plattor, överföra masken fylls bufferten till 50 ml tub. Fyll röret till toppen med M9 buffert. Upprepa tvätta för resten av plattorna.
- Eftersom de dräktiga vuxna sjunker till botten i 5-6 min, avlägsna supernatanten (~ 35 ml) och konsolideras till en eller två tuber. Fyll rören till 50 ml med fresh M9 buffert, låt stå i 3-5 minuter, och avlägsna supernatanten lämnar dräktiga vuxna. Upprepa 3 gånger eller tills supernatanten är transparent.
- Använda ett stort hål Pasteur pipett så många maskar som möjligt till två 15 koniska ml polypropylen rör. Centrifugera ner vid 1000 RCF (~ 3500 rpm i CentraSL2) under 5 min i en klinisk centrifug. Avlägsna supernatanten och upprepa tills alla maskar överförs och pelleterat i samma rör. Avlägsna så mycket supernatant som möjligt och maskar lagra vid -80 ° C. Upprepa för alla påfrestningar.
2. Prostaglandin Extraktion
De reagens som behövs för extraktion visas nedan. Metoden är modifierad från den hos Golovko och Murphy 17 och inkluderar aceton följt av vätske-vätske-rening, vilket förbättrar LC-MS/MS känslighet. En Bullet Blender 5 Homogeniseringsanordningen används i förfarandet, även om liknande resultat kan erhållas med en Dounce homogenisator. Butylerad hydroxytoluene (BHT) och indunstning under kväve (N 2) gas används för att förhindra oxidation. Allt glas bör silikoniserad (Sigmacote) för att minska lipidbindande. Extraktion med organiska lösningsmedel bör utföras i en kemisk huv.
- Väg en 50 ml polypropylen koniska rör. Överför ca 6,0 g av frysta maskar från 15 ml koniskt rör lagrades vid -80 ° C genom att skära genom röret med en varm rakblad nära 6,5 ml-markeringen. En metanol-rengjord spatel kan användas för att avlägsna den frusna masken pelleten från botten av röret. Genom att skära igenom pelleten för att hämta den nedre delen, mindre täta larver maskar och kvarvarande bakterier från toppen av pelleten är kvar.
- Överför de frusna maskarna till det på förhand vägda 50 ml koniska rör. Om flera prover bearbetas, använda samma mängd (6,0 g) av vävnad i jämförande studier. Eftersom maskarna tina till en pasta, lägga till eller ta bort maskar med spatel för att erhålla den önskade massan. Tillval: add 1,00 ng PGF 2α-d4 standard som en intern kontroll för utvinning effektivitet.
- Tillsätt 12 ml iskall 02:01 aceton / saltlösning med 0,005% BHT till masken fjädring och blanda väl genom skakning. Dispensera 1,5 ml av masken uppslamningen till var och en av tolv 5 ml fristående plaströr för användning i Bullet Blender.
- Lägg 0,7-0,8 ml 0,5 mm diameter Ceria stabiliserad zirkoniumoxid pärlor till varje 5 ml rör. Stäng locken tätt och läsa de 12 rören i Bullet Blender 5 homogenisator. Kör mixern i 3 min med hastighet 8-9 och placera rören på is. Var noga med att stänga locken mycket tätt eller innehållet kan spillas ut. Kontrollera 10 pl homogenat från ett rör på en bild med hjälp av ett stereoskop. Det bör finnas mycket få intakta maskar kvar. Upprepa vid samma hastighet i ytterligare en minut, om det behövs.
- Jämnt överföra homogenaten till fyra 10 ml koniska glasrör med en 9 "Pasteur pipett. Undvika att överföra pärlor. Tvätta pärlor från tre rör sequentially med 1 ml 1:2 aceton / saltlösning innehållande BHT. Upprepa för andra rör tills alla pärlorna tvättas. Överför återstående lösningen (~ 4 ml) till 10 tuber ml glasflaska och placera dem på is.
- Centrifugera 10 rören ml glasflaska vid 4 ° C i en klinisk centrifug vid ~ 1000 x g under 10 min. Överför supernatanten från varje rör till en ren 10 ml glas koniska rör.
- I en kemisk huv, tillsätt en lika stor volym hexan till varje 10 ml provrör. Till exempel, tillsätt 3,5 ml hexan 3,5 ml aceton / saltlösning. Vortex vid maximal hastighet under 30 sekunder.
- Centrifugera 10 rören ml glasflaska vid 4 ° C i en klinisk centrifug vid ~ 1000 x g under 10 min. Kassera den övre fasen innehållande hexan och neutralt laddade lipider.
- Surgör den undre fasen till pH 3,5 med användning av 2 M myrsyra (ca 100 - 150 | il). Test pH med användning av pH-remsor.
- Tillsätt en motsvarande volym kloroform till varje rör. Vortex vid maximal hastighet under 30 sekunder och centrifugera rören vid 4 ° C ina klinisk centrifugera vid ~ 1000 xg under 10 min.
- Avlägsna och kassera den övre vattenfasen. Sätt i en pipettspets genom eventuell resterande mjölkaktig interfas till den undre kloroformfasen, undvika interfasen. Samla den undre fasen från var och en av de 4 rören till en ren 15 ml koniskt glasrör. Inkubera vid -20 ° C i minst 24 timmar. Vid denna punkt kan extraktet förvaras vid -20 ° C i upp till två veckor.
- Ta utdrag ur frysen och kasta den överblivna milky vattenhaltiga övre skiktet, om sådant finns. Överför kloroformfasen till en märkt Teflon-fodrade ½-Dram glasflaska med en ny Pasteurpipett. I ett dragskåp, indunsta kloroform lösliga fraktionen till torrhet under ett försiktigt flöde av N2-gas. Det torkade extraktet kan lagras vid -20 ° C i upp till 2 veckor. En övergripande schema som användes för PG extraktion och analys visas i figur 1.
Tre. Prostaglandin Analys
- Förbered lagerlösningar av enskilda referensvärden prostaglandiner, såsom PGF 2α eller PGF 2 α-d4 (1 | ig / ml) i metanol och späd med metanol: vatten (08:02 vol / vol) för erhållande av en arbetslösning. Bered en serie av utspädningar (100, 10, 1, 0,1, 0,01 ng / ml) för att generera en standardkurva.
- Lägg 200 | il metanol: vatten (08:02 vol / vol) till den torkade C. elegans lipidextrakt (er) och blanda väl. Om mindre än 6 g mask vävnad extraherades, bör det torkade extraktet återsuspenderas i mindre volym metanol: vattenlösning.
- Förbered mobil fas bestående av 0,1% myrsyra i vatten [A] och acetonitril innehållande 0,1% myrsyra [B].
- Ställ upp autosamplern vid 4 ° C och placera provflaskor i en 70-count 1,5 ml injektionsflaska rack.
- Jämvikta Synergy hydro RP-C18-kolonn med 0,1% myrsyra vid en flödeshastighet av 0,2 ml / min under ca 5 min.
- Injicera provet (20-50 | il) in i kolonnen. Utför start gradientelueringing med 10% B och gå upp till 80% B 0-11 min, 80-100% B kl 11-14 min, och återvänder tillbaka till 10% B på 16 min. Den totala körtiden är 20 min. Retentionstiderna för 13 autentiska standarder visas i tabell 1 för referens 3.
- Introducera kolonnutflödet i masspektrometern använder ett operativsystem ESI gränssnitt i negativ jon-läge. Kväve användes som en nebulisator och gardin gas (CUR = 10). Kollisionen gas, kollisionsenergi, och temperaturen ställs in på 10, -35 eV och 600 ° C, respektive. Declustering potential (DP), kollision energi (CE), och cellen exit potential (CXP) är inställd på -90, -35 och -10, respektive.
- För undersökningen skanningar (Q1 skannar), använder negativ jon-läget i massan intervallet m / z 315 till 360 för de flesta PGs (Figur 2). Intervallet kan ändras, beroende på massan av föreningen (er) av intresse. Utdrag joner från total jonström (TIC) i LC-MS jonkromatogram och avgöra om utvinningted joner motsvarar deprotonerade eller addukt joner, eller till fragmentjoner.
- För MRM experiment, m / z massa övergång 355/311 används för att detektera den F1 klassen, m / z 353/193 används för F2 klassen, och m / z 351/193 eller 351/191 används för F3 klassen (Figur 3). MRM används också för att detektera den interna standarden (till exempel, m / z 357/197 för PGF 2α-d4) och för att generera standardkurvan. Se Murphy et al. För ytterligare information om PG massa övergångar 18.
- För MS / MS-experiment, använda m / z 355 för F1 klassen, m / z 353for F2 klassen, och m / z 351for F3 klass PGs. C. elegans MS / MS-data för F-seriens PG finns i figur 4 och tabell 2 3,16. MS / MS-data för däggdjursceller eikosanoider finns på www.lipidmaps.org .
- Behandla de analytiska data med hjälp Analyst programvara (Version 1.4.2, Applied Biosystems).
Representative Results
Provberedning utfördes genom vätske-vätskeextraktion anpassas från Golovko och Murphy 17. Det gav utmärkt återhämtning av den interna standarden (PGF 2α-d4). Det allmänna systemet för PG extraktion från C. elegans visas i Figur 1. Kromatografiska förhållanden var optimerad för att ge baslinjen separation av> 30 eikosanoid standarder (Tabell 1 visar 13 standarder). En Hydro-RP-kolonn (250 x 2,0 mm id) med vatten och acetonitril innehållande 0,1% myrsyra som den bästa separation och känslighet. Survey skanningar av vildtyp och fett-3 mutanta extrakt visas i figur 2 dokument globala nivåer av joner i massan intervallet 315-360 atommassenheter. Fett-3 (wa22) mutanter saknar mest 20-kol-PUFA. En F3 klass PG är markerad. I figur 3, MRM analyser av en vildtyp extrakt visa flera PG isomererna av F1 (Figur 3A ng>), F2 (figur 3B), och F3 (figur 3C och 3D) klasser. Den F3 klass kan detekteras med endera av två massa övergångar, m / z 351/193 eller m / z 351/191. CePGF2 huvudsakligen består av PGF 2α enantiomeren. CePGF1 är sannolikt PGF 1α eller dess enantiomer. Figur 4 visar kollisionen-inducerad nedbrytning av CePGF2 (RT = 11,8) jämfört med PGF2 α standarden (RT = 11,8). Mindre skillnader i produkt joner är sannolikt på grund av lågt CePGF2 överflöd och co-eluting föreningar i extraktet.
Figur 1. Skiss av C. elegans PGs utvinning och LC-MS-analyser. Observera att aceton / saltlösning och kloroform båda har 0,005% BHT att minimera lipidoxidation. Se texten för mer information.http://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig1large.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.
Figur 2. Survey skanningar av m / z 315 till 360 av vild-typ och fett-3 (wa22) mutanta extrakt. Vätskekromatografi retentionstid (RT) visas i panel [A]. Extraherade joner vid RT = 11,3 visas för vildtyp [B] och fett-3 (wa22) [C] extrakt. En F3 klass PG med massan m / z 351 är markerat. CPS pulser / sek; AMU atommassenheter.
Fig.ure 3. MRM analyser av vildtyp extrakt. F1 klass PGs detekteras med mass övergång m / z 355/311 [A]. Lägg märke till att flera hydrofoba föreningar (RT> 14 min), vilket är osannolikt att PGs, även detekteras med denna övergång. F2 klass PGs detekteras med massa övergång m / z 353/193 [B]. F3 klass PGs upptäcks med antingen massa övergång m / z 351/193 [C] eller m / z 351/191 [D]. Lägg märke till att extrakten innehåller multipla PG isomerer av varje klass. Siffrorna motsvarar PGs visas i tabell 2. Koncentrationen av CePGF2 är 1,8 ng / ml. RT, retentionstid; cps pulser / sek.
Figur 4. Kollision-inducerad sönderdelning av kemiskt synthesized PGF 2α och CePGF2. Pilar i panelen [A] påvisar att produkten eller fragmentering joner delas mellan PGF 2α och CePGF2 (RT = 11,8). Produktkoderna joner vid m / z 309 och m / z 193 genereras från indikerade spjälkningsställen (markerade a och b), motsvarar de visade strukturerna, och är kännetecknande för F-seriens PG [B]. CPS pulser / sek. Klicka här för att visa en större bild .
| Standard | RT (min) | [MH] - m / z | Nyckelprodukt joner i MS / MS | ||||
| 20-hydroxi-PGE 2 | 9,43 | 367 | 349, 331, 287, 234, 189, 129, 109 | PGF 3 - | 11,26 | 351 | 333, 307, 289, 271, 245, 219, 209, 193, 191, 171, 165, 111 |
| Tromboxan B 2 | 11,66 | 369 | 289, 191, 177, 169, 151 | ||||
| PGF 2 - | 11,80 | 353 | 335, 309, 291, 273, 263, 247, 235, 209, 193, 171, 165, 111 | ||||
| PGF 1 - | 11,79 | 355 | 337, 319.311, 301, 293, 275, 265, 237, 211, 195 | ||||
| Lipoxin B 4 | 12,38 | 351 | 201, 191.189, 165, 155, 115, 107, 71, 59 | ||||
| PGD 2 | 12,56 | 351 | 315, 271.203, 189 | ||||
| 5 (S), 6 (R) - lipoxin A 4 | 12,83 | 351 | 235, 217, 189, 144, 135, 115, 99, 59 | ||||
| PGA 2 | 14.02 | 333 | 315, 297, 271, 235, 191, 189, 175, 163, 137, 113, 109 | ||||
| Δ12-PGJ 2 | 14,20 | 333 | 271, 189, 123 | ||||
| Leukotrien B 4 | 14.73 | 335 | 181, 109, 93, 71, 69, 59, 57 | ||||
| 15d-Δ 12,14-PGJ 2 | 16,80 | 315 | 297, 271, 217, 203, 158 | ||||
| 5 (S)-HPETE | 17.88 | 335 | 97, 83, 81, 57 |
Tabell 1. Uppehållstider och viktiga joner produkt av 13 eikosanoid standarder från LC-MS/MS metod 3. Över 30 standarder användes för att utveckla LC-MS/MS programmet. De kromatografiska retentionstiderna (RT) som drivs avviker, även bland mycket likartade PGs. Ett undantag är PGF 1α och PGF 2α. Trots dessa PGs är distinguished av deras massa moderjon ([MH] - m / z) och kollision-inducerad nedbrytning spektra (MS / MS).
| Prostaglandin klass | Nr i figur 3 | [MH] - m / z | Nyckelprodukt joner i MS / MS |
| F1 (CePGF1) | 1 | 355 | 319, 301, 311, 293, 275, 265, 237, 223, 211, 195, 157 |
| F1 | 2 | 355 | 311, 301, 293, 275, 265, 211, 195, 167, 157 |
| F2 (CePGF2) | 3 | 353 | 309, 291, 273, 263, 247, 209, 193, 171, 165, 127 |
| F2 | 4 | 353 | 309, 291, 273, 263, 255, 247, 219, 209, 193, 171, 113 |
| F3 | 5 | 351 | 315, 307, 289, 275, 249, 205, 193, 191, 167, 153, 139 |
| F3 | 6 | 351 | 333, 289, 271, 261, 245, 223, 193, 191, 163 |
Tabell 2. Kollision-inducerade nedbrytningsprodukt joner för flera stora C. elegans F1, F2 och F3 PGs visas i figur 3. MS / MS av andra mindre rikliga isomerer visas inte. Dessa data är från flera analyser och inte alla produkter joner kan synas i en viss körning. Med tanke på komplexiteten av extrakten kan vissa mindre rikliga produkt jonerna härrör från en annan förälder jon med liknande retentionstid eller resultat från störningar. Topp 2 är sannolikt en stereoisomer av CePGF1 och topp 4 är sannolikt en stereoisomer av CePGF2. Se Edmonds et al. (2010) för ytterligare data 3.
Discussion
Vi beskriver ett förfarande för eikosanoid extraktion och analys, med fokus på F-seriens PG. Det finns flera delar av förfarandet som kan vara problematisk. Först är det viktigt att masken kulturer inte svälta, eftersom svält kan förändra PG metabolism. För kompletterande utfodring, är NA22 bakterier rekommenderas i stället för de vanligaste OP50 bakterier eftersom NA22 når högre densitet. Dock saknar NA22 stammen antibiotikaresistens och är mer mottagliga för kontaminering. Det andra, maskar syntetisera enskilda PG isomerer i låg förekomst i förhållande till däggdjursvävnader. Detta kan delvis bero på att övertalighet bland de många isomerer. Vi rekommenderar ca 6 g vävnad för omfattande analys och starkare signaler. Mindre vävnad (1-2 g) kan användas om det torkade extraktet återsuspenderas i mindre metanol: vatten lösning för att öka PG koncentration. Dock kan endast en till två injektioner utföras. Detektionsgränsen för vårt LC-MS/MS systemet är ca 10 pgPGF 2α / ml. En ml av tätt packade blandade stadium maskar (ca 1 g) ger ungefär 25-50 pg av CePGF2. Mer känsliga masspektrometri system kan minska mängden av masken vävnad som erfordras för analys. Tredje, kan skillnader i PG extraktionsverkan bland prover orsaka varierande resultat. Vi har funnit att extraktionseffektivitet är mycket lika när vävnader extraheras parallellt. För att bestämma effektiviteten, tillsätt 1,0 ng PGF 2α-d4 vid homogeniseringssteget som en intern kontroll. MRM användning av mass-övergång m / z 357/197 används för att mäta PGF 2α-d4 koncentration i förhållande till en 1 ng / ml standardlösning. Mängden PGF 2α-d4 förlorad under extraktion beräknas sedan.
De kromatografiska parametrarna och övergångar massa vi inkludera kan ändras för att upptäcka andra PGs och eikosanoider. Trots stora ansträngningar har vi inte kunnat identifiera D-serien eller E-Sertalet PGS i extrakten 17. Vidare har vi upptäckt inte 8-iso PGF 2α och 8-iso PGE 2 som är karakteristiska för fri radikal-initierad peroxidation, som alstrar ett icke-selektivt blandning av PG stereoisomerer 19. Vare maskar syntetisera andra PG typer är inte känd. Endocannabinoids och olika epoxi och hydroxy metaboliter av arakidonsyra och eikosapentaensyra syror har hittats i C. elegans extraherar 5,7,20,21. Vi rekommenderar användning av både MRM-och MS / MS jämfört med autentiska standarder för kvantifiering och identifiering, respektive. För nya eikosanoider, bör dessa analyser kombineras med en jämförande studie av fett mutanter, som har brist på PUFA syntetiserande enzymer 22, samt en funktionell analys, om möjligt. En varning för att analysera fett mutanter är att små mängder av PUFA finns i maskar är tillräckliga för PG-syntes. Till exempel, fett-2 (wa17) mutanterhar en liten mängd av D12 desaturasaktivitet (~ 5% av vild typ 22) och dessa mutanter fortfarande producera PGs 6. fett-3 (wa22) och fett-4 (WA14) mutanter misslyckas med att syntetisera PGs härledda från arakidonsyra och eikosapentaensyra syror 16 . Vi har också funnit att fett mutanter kompensera för förlusten av PUFA klasser med upp-reglera PG syntes från övriga klasser. Till exempel, fett-3 (wa22) mutanter misslyckas med att syntetisera de flesta PGs härrör från 20-kol PUFA. Istället verkar de upp-reglera nya PGs härrör från 18-carbon PUFAs 16. Hittills har vi inte identifierat ett C. elegans stam som är helt bristfällig i PG-syntes. Det är möjligt att PGs är väsentliga för tillväxten eller utvecklingen.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Vi tackar de UAB Riktade Metabolomics och proteomik Laboratory, som har stöd i del av UAB Skin Disease Research Center (P30 AR050948 till C. Elmets), UAB-UCSD O'Brien Acute Kidney Injury Center (P30 DK079337 till A. Agarwal ) och UAB Lung Health Center (R01 HL114439, R01 HL110950 till JE Blalock). Stöd för masspektrometer var från en NCRR Shared Instrumentation bidrag (S10 RR19261 till S. Barnes). Vi tackar även Ray Moore för teknisk support. C. elegans stammar lämnades av Caenorhabditis Genetics Center, som finansieras av NIH. Detta arbete stöddes av NIH (R01GM085105 till MAM, inklusive en Arra administrativ tillägg).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||
| REAGENTS | |||||||||||||||||
| X-large (16 cm) plates | Fisher Scientific | 0875714 | |||||||||||||||
| E. coli strain NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | NA22 | http://www.cgc.cbs.umn.edu | ||||||||||||||
| Acetone, 399.5% | Fisher Scientific | A928-4 | |||||||||||||||
| Butylated Hydroxytoluene | MP Biomedicals | 101162 | |||||||||||||||
| Hexane, HPLC grade | Fisher Scientific | H302-1 | |||||||||||||||
| Formic acid, 399% | Acros | AC27048-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
| Chloroform, HPLC grade | Acros | AC26832-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
| PGF2α-d4 | Cayman Chemicals | 316010 | Cayman has a wide array of standards available for purchase | ||||||||||||||
| Sterile screw cap self-standing 5 ml tube | Fisher Scientific | 14-222-651 | For use with Bullet Blender | ||||||||||||||
| 0.5 mm zirconium oxide beads | Next >>> Advance | ZrOB05 | |||||||||||||||
| 10 ml glass conical heavy-duty graduated centrifuge tubes | Kimble Kimax | 45200-10 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
| 15 ml glass conical tubes | Corning Pyrex | 8082-15 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
| Sigmacote (Siliconizing reagent) | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |||||||||||||||
| Teflon lined capped 1/2 Dram glass vial | Fisher Scientific | V1235C-TFE | |||||||||||||||
| EQUIPMENT | |||||||||||||||||
| CentraSL2 Clinical Centrifuge | Thomas Scientific | 2517N92-TS | |||||||||||||||
| Bullet Blender 5 blue homogenizer | Next >>> Advance | BBY5MB | A 40 ml Dounce homogenizer can be used as an alternative | ||||||||||||||
| Synergi 4 μm Hydro-RP 80 Å LC Column 250 x 2.0 mm | Phenomenenex | 00G-4375-B0 | HPLC Column | ||||||||||||||
| SecurityGuard Cartridges AQ C18 4 x 2.0 mm | Phenomenenex | AJ0-7510 | |||||||||||||||
| SecurityGuard Guard Cartridges Kit | Phenomenenex | KJ0-4282 | |||||||||||||||
| Shimadzu Prominence HPLC with refrigerated auto sampler | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | Any standard HPLC system coupled to a triple quadrupole mass spectrometer should be sufficient | |||||||||||||||
| API 4000 triple quadrupole mass spectrometer | Applied Biosystems/MDS SCIEX | ||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||
References
- Watts, J. L. Fat synthesis and adiposity regulation in Caenorhabditis elegans. Trends Endocrinol. Metab. 20, 58-65 (2009).
- Marza, E., Lesa, G. M. Polyunsaturated fatty acids and neurotransmission in Caenorhabditis elegans. Biochem. Soc. Trans. 34, 77-80 (2006).
- Edmonds, J. W., et al. Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction. Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).
- Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans. Genes Dev. 26 (3), 554-566 (2012).
- Kosel, M., et al. Eicosanoid formation by a cytochrome P450 isoform expressed in the pharynx of Caenorhabditis elegans. Biochem. J. 435, 689-700 (2011).
- Kubagawa, H. M., et al. Oocyte signals derived from polyunsaturated fatty acids control sperm recruitment in vivo. Nat Cell Biol. 8, 1143-1148 (2006).
- Lucanic, M., et al. N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 473, 226-229 (2011).
- Gerisch, B., et al. A bile acid-like steroid modulates Caenorhabditis elegans lifespan through nuclear receptor signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5014-5019 (2007).
- Edison, A. S. Caenorhabditis elegans pheromones regulate multiple complex behaviors. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 378-388 (2009).
- Funk, C. D. Prostaglandins and leukotrienes: advances in eicosanoid biology. Science. 294, 1871-1875 (2001).
- Wang, D., Dubois, R. N. Eicosanoids and cancer. Nat. Rev. Cancer. 10, 181-193 (2010).
- Cha, Y. I., Solnica-Krezel, L., DuBois, R. N. Fishing for prostanoids: deciphering the developmental functions of cyclooxygenase-derived prostaglandins. Dev. Biol. 289, 263-272 (2006).
- Hata, A. N., Breyer, R. M. Pharmacology and signaling of prostaglandin receptors: multiple roles in inflammation and immune modulation. Pharmacol. Ther. 103, 147-166 (2004).
- Sugimoto, Y., Narumiya, S., Ichikawa, A. Distribution and function of prostanoid receptors: studies from knockout mice. Prog. Lipid Res. 39, 289-314 (2000).
- Basu, S. Isoprostanes: novel bioactive products of lipid peroxidation. Free Radic. Res. 38, 105-122 (2004).
- Hoang, H. D., Prasain, J. K., Dorand, D., Miller, M. A. A heterogenous mixture of F-series prostaglandins promotes sperm guidance in the C. elegans reproductive tract. PLoS Genetics. 9 (1), e1003271 (2013).
- Golovko, M. Y., Murphy, E. J. An improved LC-MS/MS procedure for brain prostanoid analysis using brain fixation with head-focused microwave irradiation and liquid-liquid extraction. J. Lipid Res. 49, 893-902 (2008).
- Murphy, R. C., et al. Electrospray ionization and tandem mass spectrometry of eicosanoids. Anal. Biochem. 346, 1-42 (2005).
- Milne, G. L., Yin, H., Morrow, J. D. Human biochemistry of the isoprostane pathway. J. Biol. Chem. 283, 15533-15537 (2008).
- Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes. Chem. Biodivers. 5, 2431-2441 (2008).
- Kulas, J., Schmidt, C., Rothe, M., Schunck, W. H., Menzel, R. Cytochrome P450-dependent metabolism of eicosapentaenoic acid in the nematode Caenorhabditis elegans. Arch. Biochem. Biophys. 472, 65-75 (2008).
- Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
