Summary
I denne artikkelen beskriver vi en optimalisert prosedyre for å trekke ut og analysere prostaglandiner og andre eikosanoider fra
Abstract
Caenorhabditis elegans fremstår som et kraftig dyr modell for å studere biologi av lipider 1-9. Prostaglandiner er en viktig klasse av eikosanoider, som er lipid-signaler avledet fra flerumettede fettsyrer (PUFAer) 10-14. Disse signalmolekyler er vanskelige å studere på grunn av deres lave overflod og reaktive natur. De karakteristiske trekk ved prostaglandiner er en cyklopentanring struktur plassert inne i fettsyre backbone. Hos pattedyr kan prostaglandiner dannes gjennom cyklooksygenase enzym-avhengige og-uavhengige retninger 10,15. C. elegans syntetiserer et bredt utvalg av prostaglandiner uavhengig av cyclooxygenases 6,16,17. En stor klasse av F-serie prostaglandiner har blitt identifisert, men studiet av eikosanoider er på et tidlig stadium med god plass for nye funn. Her beskriver vi en prosedyre for å trekke ut og analysere prostaglandiner og andre eikosanoider. Ladet lipids er ekstrahert fra massen orm kulturer ved hjelp av en væske-væske ekstraksjon teknikk og analysert ved væskekromatografi koblet til elektrospray ionisering tandem massespektrometri (LC-ESI-MS/MS). Inkludering av deutererte analoger av prostaglandiner, slik som PGF 2 α-d 4 som en intern standard er anbefalt for kvantitativ analyse. Multiple reaksjon overvåking eller MRM kan brukes til å kvantifisere og sammenligne spesifikke typer prostaglandin mellom vill-type og mutante dyr. Kollisjon-indusert nedbrytning eller MS / MS kan brukes til å få informasjon om viktige strukturelle funksjoner. Væskekromatografi massespektrometri (LC-MS) undersøkelse skanninger av et valgt masse-kjeden, f.eks m / z 315-360 kan brukes til å evaluere globale endringer i prostaglandin nivåer. Vi gir eksempler på alle tre analyser. Disse metodene vil gi forskere med et verktøysett for å oppdage nye eikosanoider og opptegning sine metabolske veier.
Introduction
Prostaglandiner (PGS) er en viktig klasse av lipid hormoner som har blitt grundig undersøkt og innblandet i å regulere reproduksjon, immunitet, og utvikling i et bredt spekter av organismer 12-14. PG-er som er ideelt egnet for omfattende systemer biologi analyser fordi de omfatter en serie av lipider avledet fra en felles forløper (e). Den nematode C. elegans er en av de mest brukte modellorganismer å løse grunnleggende spørsmål i genetikk og systembiologi.
Vi har vist at C. elegans syntetiserer F-serien PGs som guide aktive sædceller til oocytter 3,6,16. F-serien PGs stammer fra 20-karbon flerumettede fettsyrer med tre, fire og fem doble obligasjoner, bestående av F1, F2 og F3 klasser, henholdsvis har blitt identifisert 3,16. Disse PGs er syntetisert uavhengig av cyklooksygenase enzymer, men PGF 1α og PGF 2α steroisomerer er fortsatt generated. For kvalitative og kvantitative analyser av C. elegans PGS er LC-MS/MS en kraftig og følsom analytisk teknikk. Før man utfører denne analyse, er det viktig å utvikle en optimal utvinning metoden fordi utførelsen av den analytiske prosess sterkt avhenger av ekstrakt kvalitet. Væske-kromatografi og massespektrometri kan bare gi forventet masse til å belaste forholdet (m / z), samt ønskelige toppform og retensjons-tiden av PG overordnede ion. Metabolsk profilering av PGs i C. elegans er en utfordrende oppgave som krever ulike MS oppkjøp strategier.
LC-MS full skanning eller undersøkelse skanning (Q1 skanning) har fordelen av å sikre at de fleste ioniserbare PGS vil generere en massespektrometrisk respons. Mens undersøkelsen scan gir nyttig informasjon om total profilering av PGs med hensyn til vill-type og mutant C. elegans, deteksjon av mindre PGS er kompromittert på grunn av lav følsomhet. Ikke destomindre, kan LC-MS-undersøkelsen skanning gi en global oversikt over PG-er, og er spesielt nyttig for å analysere mutanter anslås å påvirke metabolismen av en stor populasjon PG.
I metabolitten identifikasjon, er LC-MS/MS analyse av kjemisk syntetiserte PG standarder først utføres for å oppnå deres produkt ion spektra som referanse forbindelser. Disse spektrene kan sammenlignes med hele spekteret av en ukjent metabolitten. Flere reaksjon overvåking (MRM) brukes for forbedret sensitivitet og spesifisitet. En MRM eksperiment oppnås ved å spesifisere den overordnede ion / produkt ion mass overgang av en forbindelse. Ved å kjenne massen og strukturer på det analytter, er det mulig å forutsi teoretisk MRM overganger for mange ukjente metabolitter.
En optimalisert LC-MS/MS metode for profilering isomere PGs i C. elegans har ikke blitt rapportert. Her beskriver vi en utvinning og integrert massespektrometri tilnærming som består av LC-MS og LC-MS / MS metoder for påvisning, kvantifisering, og undersøker C. elegans PG metabolitter. Denne tilnærmingen kan brukes på andre eikosanoider.
Protocol
Protokollen som beskrevet nedenfor er delt inn i tre deler: orm kultur, prostaglandin utvinning, og prostaglandin analyse. Som angitt, er det flere punkter når prøvene kan bli midlertidig lagret ved -80 ° C eller -20 ° C.
En. Worm Kultur
Vi anbefaler ca 6 g blandede scenen ormer for omfattende LC-MS/MS. Dette skal gi nok materiale for påvisning minst seks separate injeksjoner. For kvantifisering av kjente PG-er med MRM i en enkelt injeksjon eller to, 1-2 g er tilstrekkelig. Analyse av ekstrakter fra synkroniserte kulturer som består av et bestemt stadium er også mulig. Opp til fire forskjellige stammer kan dyrkes samtidig. For eksempel, en villtype kontroll-og tre forskjellige mutante stammer.
- Forbered 65 X-Large (16 cm) NGM plater og konsentrerte bakterier for supplerende fôring. Bruk NA22 bakterier for seeding. For å gjøre konsentrerte bakterier for supplerende fôring, Grow minst fire liter NA22 i LB-medium etter 16-24 timer. Spinn ned, fjern supernatanten og resuspender bakterier i 100 ml M9-buffer. 200-400 ml av denne konsentrerte bakteriell løsning kan være nødvendig for hver orm belastning. Oppbevar ved 4 ° C.
- Begynn ormen kulturer på 5 X-store tallerkener. Vokse ormer i ca 3 til 4 generasjoner før platene er fulle av drektige voksne. Konsentrerte bakterier bør legges til platene for å hindre sult, som nødvendig (~ 1 ml / plate og la det tørke helt før du setter lokket).
- Vask drektige hermafroditter av plater med M9 buffer og samle ormer i en 50 ml konisk polypropylen rør.
- Tillat drektige hermaphrodites faller til ro på bunnen (vanligvis omtrent 3-5 min). Fjern supernatanten, inkludert bakterier, egg og larvestadiet ormer. Gjensuspender i 15 ml M9 buffer og forsiktig bland.
- Overfør 200 ul orm suspensjon til hver av 60 sådd NGM platene. Disperse ormer over platene. Hold ormen løsning blandetgodt til alle platene har blitt sådd for å sikre at de får omtrent like mange ormer.
- Supplere med konsentrerte bakterier etter behov (~ 1 ml/plate/12 til 24 timers periode) for å hindre sult. Tillate plater lufttørke før du setter lokkene. Vokse ormer for 2-4 generasjoner, avhengig av det opprinnelige antallet seeded ormer, eller til platene er fulle av drektige voksne.
- Harvest ormen plater en belastning på en gang. Vask ormer på platene med M9 buffer og samles i 50 ml polypropylen rør (f.eks 6 rør). Bruk M9 buffer for å vaske en plate, deretter overføre ormen fylt buffer til neste plate. Etter vask et tall (f.eks. 10.) av plater, overføre ormen fylt buffer til 50 ml tube. Fyll røret til toppen med M9 buffer. Gjenta vasketrinn for resten av platene.
- Som drektige voksne seg på bunnen i 5-6 min, fjern supernatanten (~ 35 ml) og konsolidere inn i ett eller to rør. Fyll rørene til 50 ml med fresh M9 buffer, la stå i 3-5 min, og fjern supernatanten forlate drektige voksne. Gjenta tre ganger eller inntil supernatanten er gjennomsiktig.
- Ved hjelp av en stor bar Pasteur pipette, overføring så mange ormer som mulig til to 15 ml polypropylen koniske rør. Spinn ned ved 1000 RCF (~ 3500 rpm i CentraSL2) i 5 minutter i en klinisk sentrifuge. Fjern supernatanten og gjenta helt til alle ormer er overført og pelletert i det samme røret. Fjern så mye supernatanten som mulig og lagre ormer ved -80 ° C. Gjenta for alle stammer.
2. Prostaglandin Extraction
Reagensene som er nødvendige for ekstraksjon er vist nedenfor. Metoden er modifisert fra det av Golovko og Murphy 17 og omfatter aceton-ekstraksjon, etterfulgt av væske-væske-rensing, noe som forbedrer følsomheten LC-MS/MS. En kule Blender 5 homogenisator blir anvendt ved metoden, selv om lignende resultater kan oppnås med en Douce-homogenisator. Butylated hydroxytoluene (BHT) og fordampning under nitrogen (N2) gass benyttes for å hindre oksidering. Alt glass bør siliconized (Sigmacote) for å redusere lipid binding. Ekstraksjon med organiske løsningsmidler bør utføres i et kjemisk hette.
- Veie en 50 ml polypropylen konisk tube. Overfør omtrent 6,0 g av frosne ormer fra de 15 ml konisk rør lagret ved -80 ° C ved å skjære gjennom røret med en varm barberblad i nærheten av 6.5 ml merket. En metanol-renses spatel kan anvendes for å fjerne den frosne orm pellet fra bunnen av røret. Ved å skjære gjennom pellet for å hente den nedre del, mindre tette larve ormer og gjenværende bakterier fra toppen av pelleten er igjen.
- Overfør de frosne ormer til pre-veide 50 ml konisk tube. Hvis flere prøver blir behandlet, kan du bruke det samme beløpet (6,0 g) av vev for komparative studier. Som ormer tine i en lime, legge til eller fjerne ormer med slikkepott for å oppnå ønsket masse. Valgfritt: annonsed 1,00 ng av PGF 2α-d4 standard som en intern kontroll for ekstraksjonseffektivitet.
- Legg 12 ml iskald 02:01 aceton / saltvann med 0,005% BHT å ormen fjæring og bland godt ved å virvle. Tilsett 1,5 ml av ormen oppslemning til hver av tolv 5 ml stødige plastrør for bruk i Bullet Blender.
- Legg 0,7-0,8 ml av 0,5 mm diameter Ceria stabilisert zirkoniumoksid kuler til hver 5 ml rør. Lukk caps tett og laste de 12 rørene inn i Bullet Blender 5 homogenizer. Kjør blenderen i 3 min på hastighet 8-9 og plassere rørene på is. Pass på å lukke caps svært tett eller innholdet kan renne ut. Sjekk 10 mL av homogenat fra ett rør på et lysbilde med en stereoscope. Det bør være svært få intakte ormer som gjenstår. Gjenta på samme hastighet i et minutt, hvis det er nødvendig.
- Jevnt overføre homogenates til fire 10 ml koniske glass rør ved hjelp av en 9 "Pasteur pipette. Unngå overføring perler. Vask perler fra tre rør sequentially med 1 ml av 01:02 aceton / saltvann inneholdende BHT. Gjenta for andre rør til alle perler er vasket. Overfør den gjenværende oppløsning (~ 4 ml) til 10 ml glass-rør og plassere dem på is.
- Sentrifuger 10 ml glassrør ved 4 ° C i en klinisk sentrifuge ved ~ 1000 xg i 10 min. Overfør supernatanten fra hvert rør til et rent 10 ml glass konisk rør.
- I en kjemisk hette, tilsett et likt volum heksan til hver 10 ml glassrør. For eksempel, tilsett 3,5 ml heksan og 3,5 ml aceton / saltløsning. Vortex ved maksimal hastighet i 30 sek.
- Sentrifuger 10 ml glassrør ved 4 ° C i en klinisk sentrifuge ved ~ 1000 xg i 10 min. Kast den øvre fase inneholder heksan og nøytralt ladede lipider.
- Surgjøre den nedre fase til pH 3,5 ved anvendelse av 2 M maursyre (ca. 100 - 150 ul). Test pH ved hjelp av pH-strips.
- Legg et likt volum kloroform i hvert rør. Vortex ved maksimal hastighet i 30 sek og sentrifugeres rørene ved 4 ° C ina klinisk sentrifuge ved ~ 1000 xg i 10 min.
- Ta av og kast den øvre vannfasen. Sett inn en pipette spissen gjennom eventuelle rester melkeaktig mellomfaseforsinkelsen til nedre kloroform fasen, unngå mellomfaseforsinkelsen. Samle den nedre fase fra hvert av de fire rør til et rent 15 ml konisk glassrør. Inkuber ved -20 ° C i minst 24 timer. På dette punktet, kan ekstraktet oppbevares ved -20 ° C i opptil to uker.
- Ta ekstrakt ut av fryseren og kast de resterende melkeaktig vandig øverste laget, hvis det finnes. Overfør kloroform fase til en merket Teflon-lined ½-Dram hetteglass med en ny Pasteur pipette. I en kjemisk hette, fordamp kloroform løselige fraksjon til tørrhet under en svak strøm av N2 gass. Det tørkede ekstraktet kan oppbevares ved -20 ° C i opptil 2 uker. Et samlet system brukt til PG ekstraksjon og analyse er vist i figur 1.
3. Prostaglandin Analysis
- Forbered lageroppløsninger av individuelle referanse prostaglandiner, slik som PGF eller PGF 2α 2 α-d4 (1 pg / ml) i metanol og fortynnes med metanol: vann (08:02 volum / volum) for å oppnå en arbeidsoppløsning. Tilbered en serie av fortynninger (100, 10, 1, 0,1, 0,01 ng / ml) for å generere en standardkurve.
- Tilsett 200 mL metanol: vann (08:02 volum / volum) til det tørkede C. elegans lipid ekstrakt (s) og bland godt. Hvis mindre enn 6 g orm vev ble ekstrahert, bør det tørkede ekstrakt blir resuspendert i mindre volum metanol: vann-oppløsning.
- Klargjør mobil fase bestående av 0,1% maursyre i vann [A] og acetonitril inneholdende 0,1% maursyre [B].
- Sett opp autosampler ved 4 ° C og plasser prøven hetteglass i en 70-count 1,5 ml hetteglass stativ.
- Ekvilibrere Synergy hydro RP-C18-kolonne med 0.1% maursyre, ved en strømningshastighet på 0,2 ml / min i ca 5 min.
- Injiser prøve (20-50 pl) inn i kolonnen. Utfør gradienteluering starting med 10% B og går opp til 80% B 0-11 min, 80-100% B 11-14 min, og returnere tilbake til 10% B på 16 min. Den totale kjøretid er 20 min. Oppholdstidene av 13 autentiske standarder er vist i tabell 1 til 3. referanse.
- Introduser kolonne avrenning til massespektrometer med en ESI-grensesnittet opererer i det negative ion-modus. Nitrogen benyttes som forstøver og gardin gass (nå = 10). Sammenstøtet gass, kollisjonsenergi, og temperaturen er angitt ved 10, -35 eV og 600 ° C, henholdsvis. Declustering potensial (DP), kollisjon energi (CE), og celle exit potensial (CXP) er satt til -90, -35 og -10, henholdsvis.
- For undersøkelsen skanner (Q1 skanninger), bruker negative ion-modus i massen spekter av m / z 315-360 for de fleste PG-er (fig. 2). Rekkevidden kan endres, avhengig av massen av forbindelsen (e) av interesse. Utdrag ioner fra total ion strøm (TIC) av LC-MS ion chromatograms og avgjøre om utsuted ioner svarer til deprotonert eller addukt-ioner, eller til fragment-ioner.
- For MRM eksperimenter, masse overgang m / z 355/311 blir brukt til å detektere F1 klasse, m / z 353/193 blir brukt til F2-klassen, og m / z 351/193 eller 351/191 anvendes for F3 klasse (Figur 3). MRM blir også brukt til å detektere den interne standard (for eksempel m / z 357/197 for PGF 2α-d4) og for å generere standardkurven. Se Murphy et al. For ytterligere informasjon om PG masse overganger 18.
- For MS / MS eksperimenter, bruke m / z 355 for F1 klassen, m / z 353for F2 klassen, og m / z 351for F3 klasse PGS. C. elegans MS / MS-data for F-serien PGS er tilgjengelig i figur 4 og tabell 2 3,16. MS / MS-data for pattedyr eikosanoider er tilgjengelig på www.lipidmaps.org .
- Behandle de analytiske data ved hjelp av Analyst-programvaren (versjon 1.4.2, Applied Biosystems).
Representative Results
Prøveopparbeidelse ble utført av væske-væske ekstraksjon tilpasset fra Golovko og Murphy 17. Det ga utmerket utvinning av intern standard (PGF 2α-d4). Den generelle ordningen for PG utvinning fra C. elegans er vist i figur 1.. Kromatografiske betingelser som var optimalisert for å gi baseline separasjon av> 30 eicosanoid standarder (Tabell 1 viser 13 standarder). En hydro-RP-kolonne (250 x 2,0 mm ID) med vann og acetonitril inneholdende 0,1% maursyre gav den beste separasjon og følsomhet. Survey skanninger av villtype-og fett-3 mutant ekstrakter vist i figur 2 dokument globale nivåer av ioner i massen området 315-360 atommasseenheter. Fett-3 (wa22) mutantene mangler det meste 20 karbon-PUFA. En F3 klasse PG er uthevet. I figur 3, MRM analyser av et villtype-ekstrakt viser flere PG isomerene av F1 (figur 3A ng>), F2 (Figur 3B) og F3 (Tall 3C og 3D) klasser. Den F3 klasse kan bli detektert med en av to overganger masse, m / z 351/193 eller m / z 351/191. CePGF2 hovedsakelig består av PGF 2α enantiomeren. CePGF1 er sannsynlig å være PGF 1α eller dens enantiomeren. Figur 4 viser kollisjonen-indusert nedbrytning av CePGF2 (RT = 11,8) sammenlignet med PGF2 α standard (RT = 11,8). Små forskjeller i produktet ioner er trolig på grunn av lav CePGF2 overflod og co-eluting forbindelser i ekstraktet.
Figur 1. Skisse av C. elegans PGs utvinning og LC-MS analyser. Legg merke til at aceton / saltvann og kloroform begge har 0.005% BHT å minimere lipid oksidasjon. Se i teksten for flere detaljer.http://www.jove.com/files/ftp_upload/50447/50447fig1large.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større figur.
Figur 2. Survey skanninger av m / z 315-360 av vill type og fett-3 (wa22) mutant ekstrakter. Væskekromatografi oppholdstid (RT) er vist i panel [A]. Utvunnet ioner på RT = 11.3 er vist for villtype [B] og fett-3 (wa22) [C] ekstrakter. En F3 klasse PG med masse m / z 351 er uthevet. CPS, teller / sek, amu, atomic mass unit.
Figure tre. MRM analyser av vill type ekstrakter. F1 klassen PGS er registrert med masse overgang m / z 355/311 [A]. Legg merke til at flere hydrofobe forbindelser (RT> 14 min), som er usannsynlig å være PGS, som også oppdages med denne overgangen. F2 klassen PGs oppdages med masse overgang m / z 353/193 [B]. F3 klasse PGS er registrert med enten masse overgang m / z 351/193 [C] eller m / z 351/191 [D]. Legg merke til at ekstraktene inneholde flere PG isomerer av hver klasse. Tallene tilsvarer PGs vist i Tabell 2. Konsentrasjonen av CePGF2 er 1,8 ng / ml. RT, oppholdstid, CPS, teller / sek.
Figur 4. Kollisjon-indusert nedbrytning av kjemisk synthesized PGF 2α og CePGF2. Piler i panelet [A] indikerer at produktet eller fragmentering ioner deles mellom PGF 2α og CePGF2 (RT = 11,8). Produktfraksjonene ioner ved m / z 309 og m / z 193 genereres fra angitte spaltningsseter (markert a og b), svarer til de strukturene vist på figuren, og er karakteristisk for F-serien PG-er [B]. Cps, teller / sek. Klikk her for å se større figur .
| Standard | RT (min) | [MH] - m / z | Viktige produktet ioner i MS / MS | ||||
| 20-hydroksy-PGE 2 | 9,43 | 367 | 349, 331, 287, 234, 189, 129, 109 | PGF 3 - | 11.26 | 351 | 333, 307, 289, 271, 245, 219, 209, 193, 191, 171, 165, 111 |
| Tromboksan B 2 | 11.66 | 369 | 289, 191, 177, 169, 151 | ||||
| PGF 2 - | 11.80 | 353 | 335, 309, 291, 273, 263, 247, 235, 209, 193, 171, 165, 111 | ||||
| PGF 1 - | 11.79 | 355 | 337, 319 311, 301, 293, 275, 265, 237, 211, 195 | ||||
| Lipoxin B 4 | 12.38 | 351 | 201, 191 189, 165, 155, 115, 107, 71, 59. | ||||
| PGD 2 | 12.56 | 351 | 315, 271 203, 189 | ||||
| 5 (S), 6 (R) - Lipoxin A 4 | 12.83 | 351 | 235, 217, 189, 144, 135, 115, 99, 59. | ||||
| PGA 2 | 14.02 | 333 | 315, 297, 271, 235, 191, 189, 175, 163, 137, 113, 109 | ||||
| Δ12-PGJ 2 | 14.20 | 333 | 271, 189, 123 | ||||
| Leukotrien B 4 | 14.73 | 335 | 181, 109, 93, 71, 69, 59, 57 | ||||
| 15d-Δ 12,14-PGJ 2 | 16.80 | 315 | 297, 271, 217, 203, 158 | ||||
| 5 (S)-HpETE | 17.88 | 335 | 97, 83, 81, 57 |
Tabell 1. Retensjonstider og sentrale produktgrupper ioner av 13 eicosanoid standarder fra LC-MS/MS metoden tre. Over 30 standarder ble brukt til å utvikle LC-MS/MS program. De kromatografiske retensjonstider (RTS) skiller seg, selv blant svært like PGS. Et unntak er PGF 1α og PGF 2α. Likevel, disse PGs er distinguished av sine foreldre ion massene ([MH] - m / z) og kollisjon-indusert nedbrytning spektra (MS / MS).
| Prostaglandin klasse | Nr i Figur 3 | [MH] - m / z | Viktige produktet ioner i MS / MS |
| F1 (CePGF1) | 1 | 355 | 319, 301, 311, 293, 275, 265, 237, 223, 211, 195, 157 |
| F1 | 2 | 355 | 311, 301, 293, 275, 265, 211, 195, 167, 157 |
| F2 (CePGF2) | 3 | 353 | 309, 291, 273, 263, 247, 209, 193, 171, 165, 127 |
| F2 | 4 | 353 | 309, 291, 273, 263, 255, 247, 219, 209, 193, 171, 113 |
| F3 | 5 | 351 | 315, 307, 289, 275, 249, 205, 193, 191, 167, 153, 139 |
| F3 | 6 | 351 | 333, 289, 271, 261, 245, 223, 193, 191, 163 |
Tabell 2. Kollisjon-indusert nedbrytningsprodukt ioner for flere store C. elegans F1, F2, F3 og PG-er som vist i figur 3.. MS / MS av andre mindre rike isomerer blir ikke vist. Disse dataene er fra flere analyser og ikke alle produktet ioner kan være synlig i et gitt løp. Gitt kompleksiteten av ekstraktene, kan enkelte mindre rikelig produktet ioner stammer fra en annen forelder ion med tilsvarende oppholdstid eller resultat fra forstyrrelser. Peak to er trolig en stereoisomer av CePGF1 og topp 4 er sannsynligvis en stereoisomer av CePGF2. Se Edmonds, et al. (2010) for ytterligere data tre.
Discussion
Vi beskriver en prosedyre for eicosanoid ekstraksjon og analyse, med fokus på F-serien PGS. Det er flere deler av prosedyren som kan være problematisk. Først er det viktig at ormen kulturer ikke sulte, som sult kan endre PG metabolisme. For supplerende fôring, er NA22 bakterier anbefalt i stedet for de mer brukte OP50 bakterier fordi NA22 når høyere tetthet. Imidlertid mangler NA22 belastningen antibiotisk resistens, og er mer utsatt for forurensning. Sekund, ormer syntetisere individuelle PG isomerer i lav overflod i forhold til pattedyr vev. Dette kan skyldes delvis til redundans blant de mange isomerer. Vi anbefaler ca 6 gram vev omfattende analyse og sterkere signaler. Mindre vev (1-2 g) kan brukes hvis det tørkede ekstrakt ble resuspendert i mindre metanol: vann-oppløsning for å øke PG konsentrasjon. Imidlertid kan bare én til to injeksjoner utføres. Deteksjonsgrensen på vår LC-MS/MS system er ca 10 pgPGF 2α / ml. En ml tettpakkede blandede scenen ormer (ca 1 g) gir omtrent 25-50 pg av CePGF2. Mer følsom massespektrometri systemer kan redusere mengden av vev som kreves orm for analyse. Tredje, kan forskjeller i PG utvinning effektivitet blant prøvene forårsake variable resultater. Vi har funnet at ekstraksjonseffektiviteten er svært like når vev er ekstrahert i parallell. For å bestemme effektivitet, legger 1,0 ng av PGF 2α-d 4 på homogenisering steg som en intern kontroll. MRM hjelp massen overgang m / z 357/197 blir brukt til å måle PGF 2α-d4 konsentrasjon i forhold til en 1 ng / ml standard løsning. Mengden av PGF 2α-d 4 tapt under ekstraksjonen, blir deretter beregnet.
De kromatografi parametere og masse overganger vi inkluderer kan endres for å oppdage andre PGS og eikosanoider. Til tross for betydelig innsats, har vi ikke vært i stand til å identifisere D-serien eller E-serkaper PGS i ekstrakter 17. Videre har vi ikke oppdaget 8-iso PGF 2α og 8-iso PGE 2 som er karakteristisk for fri radikal-initiert peroksidasjon, som genererer en ikke-selektive blanding av PG stereoisomers 19. Enten ormer syntetisere andre PG typer er ikke kjent. Endocannabinoids og ulike epoxy og hydroksymetabolitter av arakidonsyre og eikosapentaensyre syrer har blitt funnet i C. elegans trekker 5,7,20,21. Vi anbefaler bruk av både MRM og MS / MS sammenlignet med autentiske standarder for kvantifisering og identifisering, henholdsvis. For nye eikosanoider, bør disse analysene kombineres med en sammenlignende studie av fett mutanter, som er mangelfull i PUFA syntetisering av enzymer 22 så vel som et funksjonelt assay, hvis mulig. En påminnelse til å analysere fett mutanter er at ørsmå mengder av flerumettede fettsyrer som finnes i ormer er tilstrekkelig for PG syntese. For eksempel fett-2 (wa17) mutanterhar en liten mengde av D12 desaturase aktivitet (~ 5% av villtypen 22) og disse mutanter fortsatt produserer PG-er 6. fett-3 (wa22) og fett-4 (WA14) mutanter mislykkes i å syntetisere PG-er avledet fra arachidonsyre, og eicosapentaen syre 16 . Vi har også funnet at fete mutanter kompensere for tapet av PUFA klasser med opp-regulere PG syntese fra øvrige klasser. For eksempel fett-3 (wa22) mutanter mislykkes i å syntetisere de fleste PG-er avledet fra 20-karbon-PUFA. I stedet synes de å opp-regulere nye PGs stammer fra 18-karbon flerumettede fettsyrer 16. Til dags dato har vi ikke identifisert en C. elegans belastning som er helt mangelfull i PG syntese. Det er mulig at PGS er avgjørende for vekst og utvikling.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi takker de UAB Målrettet Metabolomics og proteomikk Laboratory, som har vært støttet i en del av UAB Skin Disease Research Center (P30 AR050948 til C. Elmets), UAB-UCSD O'Brien Akutt nyreskade Center (P30 DK079337 til A. Agarwal ) og UAB Lung Health Center (R01 HL114439, R01 HL110950 til JE Blalock). Støtte for massespektrometer var fra en NCRR Delt Instrumentation stipend (S10 RR19261 til S. Barnes). Vi vil også takke Ray Moore for teknisk støtte. C. elegans stammer ble levert av Caenorhabditis Genetics Center, som er finansiert av NIH. Dette arbeidet ble støttet av NIH (R01GM085105 til MAM, inkludert en Arra administrativ supplement).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments | ||||||||||||||
| REAGENTS | |||||||||||||||||
| X-large (16 cm) plates | Fisher Scientific | 0875714 | |||||||||||||||
| E. coli strain NA22 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | NA22 | http://www.cgc.cbs.umn.edu | ||||||||||||||
| Acetone, 399.5% | Fisher Scientific | A928-4 | |||||||||||||||
| Butylated Hydroxytoluene | MP Biomedicals | 101162 | |||||||||||||||
| Hexane, HPLC grade | Fisher Scientific | H302-1 | |||||||||||||||
| Formic acid, 399% | Acros | AC27048-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
| Chloroform, HPLC grade | Acros | AC26832-0010 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
| PGF2α-d4 | Cayman Chemicals | 316010 | Cayman has a wide array of standards available for purchase | ||||||||||||||
| Sterile screw cap self-standing 5 ml tube | Fisher Scientific | 14-222-651 | For use with Bullet Blender | ||||||||||||||
| 0.5 mm zirconium oxide beads | Next >>> Advance | ZrOB05 | |||||||||||||||
| 10 ml glass conical heavy-duty graduated centrifuge tubes | Kimble Kimax | 45200-10 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
| 15 ml glass conical tubes | Corning Pyrex | 8082-15 | Available through Fisher Scientific | ||||||||||||||
| Sigmacote (Siliconizing reagent) | Sigma-Aldrich | SL2-100ML | |||||||||||||||
| Teflon lined capped 1/2 Dram glass vial | Fisher Scientific | V1235C-TFE | |||||||||||||||
| EQUIPMENT | |||||||||||||||||
| CentraSL2 Clinical Centrifuge | Thomas Scientific | 2517N92-TS | |||||||||||||||
| Bullet Blender 5 blue homogenizer | Next >>> Advance | BBY5MB | A 40 ml Dounce homogenizer can be used as an alternative | ||||||||||||||
| Synergi 4 μm Hydro-RP 80 Å LC Column 250 x 2.0 mm | Phenomenenex | 00G-4375-B0 | HPLC Column | ||||||||||||||
| SecurityGuard Cartridges AQ C18 4 x 2.0 mm | Phenomenenex | AJ0-7510 | |||||||||||||||
| SecurityGuard Guard Cartridges Kit | Phenomenenex | KJ0-4282 | |||||||||||||||
| Shimadzu Prominence HPLC with refrigerated auto sampler | Shimadzu Scientific Instruments, Inc. | Any standard HPLC system coupled to a triple quadrupole mass spectrometer should be sufficient | |||||||||||||||
| API 4000 triple quadrupole mass spectrometer | Applied Biosystems/MDS SCIEX | ||||||||||||||||
|
|||||||||||||||||
References
- Watts, J. L. Fat synthesis and adiposity regulation in Caenorhabditis elegans. Trends Endocrinol. Metab. 20, 58-65 (2009).
- Marza, E., Lesa, G. M. Polyunsaturated fatty acids and neurotransmission in Caenorhabditis elegans. Biochem. Soc. Trans. 34, 77-80 (2006).
- Edmonds, J. W., et al. Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction. Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).
- Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans. Genes Dev. 26 (3), 554-566 (2012).
- Kosel, M., et al. Eicosanoid formation by a cytochrome P450 isoform expressed in the pharynx of Caenorhabditis elegans. Biochem. J. 435, 689-700 (2011).
- Kubagawa, H. M., et al. Oocyte signals derived from polyunsaturated fatty acids control sperm recruitment in vivo. Nat Cell Biol. 8, 1143-1148 (2006).
- Lucanic, M., et al. N-acylethanolamine signalling mediates the effect of diet on lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 473, 226-229 (2011).
- Gerisch, B., et al. A bile acid-like steroid modulates Caenorhabditis elegans lifespan through nuclear receptor signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 5014-5019 (2007).
- Edison, A. S. Caenorhabditis elegans pheromones regulate multiple complex behaviors. Curr. Opin. Neurobiol. 19, 378-388 (2009).
- Funk, C. D. Prostaglandins and leukotrienes: advances in eicosanoid biology. Science. 294, 1871-1875 (2001).
- Wang, D., Dubois, R. N. Eicosanoids and cancer. Nat. Rev. Cancer. 10, 181-193 (2010).
- Cha, Y. I., Solnica-Krezel, L., DuBois, R. N. Fishing for prostanoids: deciphering the developmental functions of cyclooxygenase-derived prostaglandins. Dev. Biol. 289, 263-272 (2006).
- Hata, A. N., Breyer, R. M. Pharmacology and signaling of prostaglandin receptors: multiple roles in inflammation and immune modulation. Pharmacol. Ther. 103, 147-166 (2004).
- Sugimoto, Y., Narumiya, S., Ichikawa, A. Distribution and function of prostanoid receptors: studies from knockout mice. Prog. Lipid Res. 39, 289-314 (2000).
- Basu, S. Isoprostanes: novel bioactive products of lipid peroxidation. Free Radic. Res. 38, 105-122 (2004).
- Hoang, H. D., Prasain, J. K., Dorand, D., Miller, M. A. A heterogenous mixture of F-series prostaglandins promotes sperm guidance in the C. elegans reproductive tract. PLoS Genetics. 9 (1), e1003271 (2013).
- Golovko, M. Y., Murphy, E. J. An improved LC-MS/MS procedure for brain prostanoid analysis using brain fixation with head-focused microwave irradiation and liquid-liquid extraction. J. Lipid Res. 49, 893-902 (2008).
- Murphy, R. C., et al. Electrospray ionization and tandem mass spectrometry of eicosanoids. Anal. Biochem. 346, 1-42 (2005).
- Milne, G. L., Yin, H., Morrow, J. D. Human biochemistry of the isoprostane pathway. J. Biol. Chem. 283, 15533-15537 (2008).
- Lehtonen, M., Reisner, K., Auriola, S., Wong, G., Callaway, J. C. Mass-spectrometric identification of anandamide and 2-arachidonoylglycerol in nematodes. Chem. Biodivers. 5, 2431-2441 (2008).
- Kulas, J., Schmidt, C., Rothe, M., Schunck, W. H., Menzel, R. Cytochrome P450-dependent metabolism of eicosapentaenoic acid in the nematode Caenorhabditis elegans. Arch. Biochem. Biophys. 472, 65-75 (2008).
- Watts, J. L., Browse, J. Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).
