Summary
在免疫缺陷小鼠人类肿瘤异种移植是有价值的工具来研究癌症生物学。特定的协议来生成从人肝癌细胞或肿瘤碎片皮下和肝内移植瘤进行了描述。肝再生诱导的受体小鼠肝部分切除术是作为一项战略，以促进肝内移植。
Abstract
在体内肝细胞癌（HCC）的实验模型，概括了人类疾病为研究疾病的病理生理学和新疗法的临床前评价一个宝贵的平台。我们提出了多种方法来产生皮下或原位人类肝癌异种移植物中，可以在各种研究应用中使用的免疫缺陷小鼠。重点是使用从接受手术切除为起点的患者原发肿瘤组织中，我们描述了制备细胞悬液或肿瘤片段的异种移植。我们描述了特定的技术来异种移植这些组织ⅰ）皮下或ii）肝内，无论是由肿瘤细胞或片段的直接植入到肝脏，或间接通过细胞注射入小鼠脾。我们还描述了使用原生小鼠肝脏部分切除术在异种移植时的一种策略诱导的活性肝再生的状态下在受体小鼠可便于原代人肿瘤细胞的肝内移植。这些技术的预期结果如图。所述的协议主要使用人肝癌样本和移植，通常表现强劲少比得到广泛使用，经常引用的文献行之有效的人肝癌细胞系已经被验证。与细胞系的比较中，我们讨论的因素，可能有助于原发性肝癌移植相对较低的机会，在异种移植模型，对可能影响移植瘤生长的动力学技术问题发表意见。我们还建议，应适用，以确保获得准确的移植类似于父肝癌组织方法。
Introduction
肝细胞癌（HCC）是全球第五大最常见的癌症和癌症死亡的北美最迅速增加的原因。肝细胞癌的最普遍的危险因素是肝硬化，最经常是由于慢性病毒性肝炎，酒精滥用，自身免疫性疾病，或遗传性代谢紊乱1发生。
尽管在全球范围内的人群所施加肝癌沉重的疾病负担，肝癌的病理生理了解，相较于其他常见的癌症如大肠癌，乳腺癌或前列腺癌相对较差。例如，特定的分子和细胞事件驱动肿瘤的发生仍有待明确界定2。像大多数其他固体上皮癌，基因组学方法揭示异质性与肝癌3相关的像差。许多研究已经揭示了多种参与细胞增殖，外加信号传导途径的紊乱的活性存活力，分化和血管生成4。此外，癌症干细胞在HCC病理生物学中的作用仍有待阐明5。
与肝癌病理生理的了解有限，为有效的治疗肝癌的医疗设备也仍然相对有限。早期患者肿瘤局限于肝脏是适合采用肿瘤切除或手术切除根治性治疗，但复发是常见的。为病人提供更先进的疾病，化疗和放疗是有限的功效，并主要用于与姑息意图6疾病控制。
高品质的人类肝癌的体内实验模型从而提供了一个宝贵的平台，为急需的基础研究到人类肝癌的病理生理，以及对新的治疗方法的评价。由于与使用的细胞系或高度定义的小鼠模型，PRI的移植比较玛丽人类肿瘤的免疫缺陷小鼠已经成为这类研究的重要工具，因为它们能够扼要人类疾病具有高保真度，同时也捕获的异质性是内和不同的患者之间7,8存在的。为此，我们开发了多种方法来建立人肝癌裸鼠移植免疫缺陷小鼠。虽然大多数已发表的研究涉及肝癌移植瘤的描述使用的行之有效的人肝癌细胞系用于此目的，我们把重点放在优化我们的分析产生手术切除的患者后，立即获得原发性肝癌标本移植。
可能需要为不同的研究应用不同异种移植技术。例如，正在迅速产生肿瘤碎片产生的皮下移植瘤，很容易被监控，并且可能更适合于新型疗法方便本地管理监测肿瘤反应。肝内移植可能是更相关的有关肝微环境在肝癌生物学中的作用研究。从肿瘤细胞悬浮液产生的异种移植物中是必需的肿瘤起始细胞亚群的鉴定和表征，或适用于需要在肿瘤细胞之前，异种移植的体外实验操作。我们就此开发并验证以下协议，建立皮下或肝内移植从初级人类肝癌标本来源的细胞悬液或肿瘤碎片。
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Protocol
该协议的示意图示于图1。
1。人肝癌样本的处理
取得初级人类肝癌标本，并以书面征得患者同意，并与机构研究伦理委员会的批准。这些协议已经进行了在我们的机构与大学健康网络研究伦理委员会批准，符合人类福祉的所有机构，国家和国际准则。
尽快收集新鲜肝癌标本下一次合适的样本已经用于临床目的的外科手术。理想情况下这应该从患者体内取出组织后需要在30分钟内到位。如示于图2中，至少1cm 3的肿瘤的周围得到的样品是最优的，因为肿瘤的中心部分可以是坏死。还没有接收到任何治疗之前，切除诸如放疗，化疗，或消融肿瘤是优选的，为了最大限度地提高的可能性，肿瘤细胞是可行的。处理的主要人体组织按照与生物危险品标准的个人防护协议。进行肿瘤组织和细胞制剂的所有实验室操作使用无菌技术II类生物安全柜。
- 将新鲜的HCC样本中10-25毫升的无血清的Dulbecco改良Eagle培养基/火腿的F12，在4℃并在冰转移到实验室进行立即处理和制备的组织碎片和/或细胞对异种移植到小鼠中。
- 用无菌镊子，将肿瘤样品在一个100毫米×20毫米的培养皿或其它合适的无菌的工作表面。肿瘤样本分成约2-3毫米3用10号手术刀刀片碎片。此时，考虑管理单元冻结或福尔马林固定S而其他实验青梅肿瘤碎片或分析的要求。
- 对肿瘤片段的异种移植中，将一些肝癌片段到含有足够的Matrigel以允许碎片保持淹没一个或多个微量离心管中。置于冰上这些管子。
- 用于制备肿瘤细胞悬浮液，可使用外科手术刀刀片剁碎其余肝癌组织尽可能并用5-10毫升的DMEM-F12的混合在50ml锥形管这取决于组织糜的体积。
- 加胶原酶IV型和分散酶II的最终浓度为200单位/ ml和0.8单位/毫升分别。吸取混合物上下以及用25毫升吸管。
- 密封该管并从步骤1.6孵育混合物在37℃下在5％二氧化碳培养箱中培养30-60分钟取决于肿瘤组织的柔软度。移液器的混合物上下几次每10分钟，以评估酶消化的进展。
- 二后拥塞完成后，通过100微米的细胞过滤通过肿瘤的解决方案。轻轻捣碎用25毫升移液管尖，以使肿瘤细胞的最大数量通过在细胞过滤器的剩余组织。收集应变细胞悬浮在15毫升锥形管中。
- 离心肿瘤细胞悬浮液在1,200 rpm离心5分钟，在4℃下
- 轻轻倒出上清液。取决于颗粒的大小，加2-5毫升冰冷的1X红血细胞（RBC）的裂解缓冲液，轻轻地吹吸，以重悬沉淀。置于冰上5分钟。
- 添加的DMEM-F12的15毫升离心的总体积为1,000 rpm离心5分钟，在4℃下洗出的RBC裂解缓冲液。
- 轻轻倒出上清液，重悬在DMEM-F12的红细胞游离肿瘤细胞沉淀。
- 无论是手动或自动细胞计数器采用台盼蓝染色计数活细胞。
- 将含有所需NUMBE离心机肿瘤细胞等分细胞为如上所述的注塑R，重悬所得的细胞沉淀中加入30μl冰冷的基底膜，并在冰上储存。
选择性：1.11步骤之后，我们经常从大块肿瘤细胞悬浮液耗尽人类CD45 +细胞（白细胞）和/或使用流式细胞术或免疫磁珠纯化的肿瘤细胞亚群。对这些技术的详细方案由相关抗体，珠子，和流式细胞仪的制造商有很好的描述。
注意：该协议如上所述，也可用于处理来自小鼠，以执行连续移植收获的人类肿瘤异种移植物，取代的异种移植物组织为在步骤1.1的初级人HCC组织中。在此情况下，步骤1.11后，我们经常消耗浸润的细胞悬浮液鼠细胞利用抗体对小鼠组织相容性抗原H2K。
2。异种移植
开展符合所有动物的程序与批准的机构动物护理委员会的协议。本文所述的程序已经在按照和遵守所有相关法规和体制机构，规定和准则批准大学健康网络动物保护委员会的特定动物使用协议完成。
设备交付吸入挥发性麻醉剂的小动物应根据动物设施和研究机构的标准作业程序予以确认。开展利用无菌技术和无菌器械的II类生物安全柜的所有外科手术。利用非肥胖糖尿病重症联合免疫缺陷（NOD / SCID）或NOD / SCID /白细胞介素2受体γ链空（NSG）的菌株任一性别的小鼠6-8周龄（杰克逊实验室，缅因州巴港） 9,10。这些老鼠必须被容纳并保持在能够提供适合于免疫缺陷动物无病原体条件的设施。
在腔室中于1L /氧的分供给5％（体积/体积）异氟醚吸入制备小鼠进行手术。维持麻醉，直到有角膜和脚趾反射损耗在动物（S）。对于皮下异种移植，剃一个或多个小区域上的动物（S）的背部和清洗用70％乙醇的皮肤。肝内异种移植，从腋窝下至腹股沟区域剃除动物（S）的腹侧胸部和腹部和清洗，用70％乙醇在皮肤上。
肿瘤片段的2.1皮下植入
- 将麻醉的小鼠易发生，保持吸入异氟醚麻醉组（2％（V / 1升V）/分钟O 2）与喉舌。适用撕裂凝胶，保护动物的眼睛免受外伤。
- 用优碘消毒背部剃光面积（S）手术擦洗后70％的乙醇，最后用聚维酮碘溶液。
- 使用无菌锋利的剪刀做5毫米的皮肤切口。
- 插入一个封闭钝剪刀轻轻插入皮下空间和蔓延轻轻地开发一个口袋大到足以容纳一个肿瘤片段。
- 插入使用无菌细镊子准备步骤1.3到皮下口袋肿瘤片段。
- 关闭使用缝线或夹子皮肤切口。
- 提供术后护理，以如下所述的鼠标。
2.2皮下注射肿瘤细胞
- 准备按照步骤2.1.1和2.1.2中所述的动物。
- 加载的肿瘤细胞在基质胶制备步骤1.13到胰岛素注射器用29 G 1/2针头的悬浮液。
- 将针头插入皮下空间和排出注射器的内容物。推进沿皮下平面针几毫米远神父OM穿刺部位皮肤可以防止肿瘤细胞悬液泄漏出来的穿刺部位后撤出针的。
- 提供术后护理，以如下所述的鼠标。
肿瘤片段的2.3肝内植入
- 在1毫升注射器针头在使用27 G 1/2，管理350μl，以麻醉动物的脖子背部无菌生理盐水皮下注射，以弥补术中流体的损失。镇痛，管理350微升无菌正常生理盐水含丁丙诺啡（0.1毫克/千克）皮下注射对动物的侧面，采用了27G的1/2-英寸的针在1毫升注射器。
- 将鼠标仰卧在预加热垫与位于所述嘴件内以提供维护吸入异氟醚麻醉（2％（体积/ 1升五）/分钟O 2）的鼻子和嘴。
- 延长四肢及它们固定用胶带给作业面优化曝光腹腹部和胸部。
- 下一个放大镜灯进行程序优化的可视化。
- 消毒的腹侧的腹部和胸部的皮肤剃光用聚维酮碘外科擦洗后70％的乙醇，最后用聚维酮碘溶液。
- 使用无菌锋利的剪刀，作一横双边肋缘下皮肤切口并划分肌肉层进入腹膜腔，使整个肝脏足够的曝光。
- 放置一个缝在上面剑突皮肤，并固定用胶带为了喉舌，以便更好地暴露肝脏及周围结构。
- 使用相邻的两个棉签涂药，后到肝脏以使其稳定。
- 做一个切口3毫米的长度和深度用无菌10号解剖刀刀片肝脏的表面上。
- 立即申请的Surgicel和温和的压力，切口部位，以达到止血;后60-90秒删除并继续只有彻底止血已经实现。
- 将肿瘤片段的步骤1.3进入肝脏切口用无菌细镊子或用18号针头。
- 取一小片的Surgicel超过肝脏切开，以防止肿瘤片段的位移，保证持续止血。
- 关闭切口缝合或剪辑。
- 提供如下所述的术后护理
肿瘤细胞通过直接注射到肝脏2.4肝内植入
- 准备在2.3.1的步骤描述2.3.7鼠标在上面。
- 加载的肿瘤细胞悬浮液（在步骤1.13的方法制备）为使用一个29 G 1/2在针的胰岛素用注射器。
- 用棉尖涂药与肝企稳，将胰岛素注射器针头进入肝脏，推进嘴伸入穿刺部位沿包膜下飞机几毫米。
- 轻轻地排出注射器和t中的内容母鸡从肝脏取出针。
- 这里的Surgicel在穿刺部位和应用用棉签轻轻按压，以防止肿瘤细胞悬浮液的泄漏，并实现完全止血。
- 关闭切口缝合或剪辑，并提供如下所述的术后护理。
肿瘤细胞通过注射入脾胃2.5异种移植肝内
- 作为准备步骤2.3.1描述2.3.5鼠标在上面。
- 使用无菌剪刀尖锐，使1厘米左肋下切口进入腹腔。
- 用棉签对颅和动物的右侧反映胃，以揭露脾。
- 通过处理周围的脂肪组织，用无菌细无创伤钳，交付脾插入切口，然后将棉签涂药脾后面以使其稳定。
- 用5-0丝线缝合，地点围绕上述下极脾宽松预绑结。
- 加载的肿瘤细胞悬浮液（在步骤1.13的方法制备）为使用一个29 G 1/2在针的胰岛素用注射器。
- 将胰岛素注射器针头插入脾脏下极，推进它过去的宽松预先系结的水平。
- 慢慢地排出注射器的内容物，从脾脏取出针，并拧紧结，以防止注射肿瘤细胞悬浮液的任何泄漏。
- 更换脾进入腹腔。
- 关闭切口缝合或剪辑，并提供如下所述的术后护理。
2.6部分肝切除术，以促进人类肿瘤组织肝内移植植入
- 作为准备步骤2.3.1描述2.3.7鼠标。
- 用无菌剪刀尖锐，分附着在肝脏的中叶镰状韧带。
- 用棉签，调动绕左叶5-0丝线缝合肝和位置的松脱预先系在一起的结的左叶。推进松散的结尽可能接近朝着左叶胆血管蒂，然后拧紧结。
- 用无菌剪刀，留下一个小树桩，防止结，随后出血打滑切除左叶远端结扎。
- 使用类似的技术，结扎并切除大部分肝脏中叶，避免了胆囊。
- 使用的Surgicel和温和的压力沿肝实质的切割表面棉签涂药，达到完全止血。
- 对于肿瘤片段或肿瘤细胞的异种移植肝内，继续进行步骤2.3.8至2.3.11或2.4.2至2.4.5如上所述。
- 对于肿瘤细胞经脾注射肝内异种移植，使用棉签涂药轻轻地反映胃颅和动物的右侧，exposi纳克脾。继续进行步骤2.5.4至2.5.9如上所述。
- 关闭切口缝合或剪辑，并提供如下所述的术后护理。
2.7术后护理
- 从吸入麻醉喉舌移开鼠标。
- 放置在笼子里的老鼠在大约20分钟的加热灯，直到从麻醉中恢复，并动员全。
- 在第一次手术后2-3天重复上述丁丙诺啡剂量为每8-12小时。
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Representative Results
图3展示了一个皮下人肝癌异种移植物以及肿瘤的组织病理学对应的外观的典型外观。皮下移植瘤的发展和增长可以通过受体小鼠的日常检查来随时监测。异种移植肿瘤和显影之间的时间间隔可能会变化很大取决于组织的类型（肿瘤片段与细胞悬液），源组织（主病人样本，传代的异种移植物，或细胞系），和组织的数量植入（细胞的数目或肿瘤片段的大小）。例如，相当大的异种移植物可能发展从注射5×10 6细胞1-2星期内行之有效的肝癌细胞系的建立，而可能需要6个月类似的异种移植物的发展，从获得的1×10 5细胞从主患者的HCC样本。我们并没有观察到皮下移植瘤形成后6个月implantatio后n个肿瘤样本，并由此牺牲受体小鼠在这个时间点，如果异种移植还没有开发。
图4显示肝内人肝癌移植瘤的典型外观从肿瘤组织中直接植入实现了进入肝脏，以及那些从注射肿瘤细胞达到入脾。肝内移植不能由受体小鼠的一般体检很容易检测到，除非肿瘤是非常大的，或导致腹水或腹胀的发展。虽然可用小动物成像模块，如CT扫描在一些科研院所和可以被用来精确地询问受体小鼠11的肝脏，我们并不认为这对大多数研究者广泛应用，实用，或成本效益的方法。我们已观察到，在这肝内移植瘤发展的速率是类似于在该subcutaneo率我们移植瘤的发展，并同样受到各种变量，如类型，来源和组织的数量植入。基于相同的父组织与用于肝内移植瘤皮下派生移植的性能，我们选择一个时间点的受体小鼠和检查肝脏的牺牲，除非大肝内肿瘤明显证据是在此之前存在。我们已经观察到，除了一个部分切除的所使用的肝内异种移植过程改进实现在小鼠肝脏人类肿瘤组织中植入的可能性，但似乎没有加速异种移植物生长速率。
表1总结了在使用本协议中所述的不同技术主要人肝癌组织中的免疫缺陷小鼠植入后获得的肿瘤细胞植入率。为每个植入的方法，所述肿瘤接受率的分母反映了独特的嗡嗡声一个肝癌样本。这些数据表明，对于原代人HCC组织，皮下植入率不如肝内移植的脾内肿瘤细胞注射或肝内肿瘤片段植入实现的速率，并且该部分切除似乎提高肝内移植。虽然我们已经成功地利用直接的细胞注射到小鼠的肝脏，从良好建立的人肝癌细胞系（数据未示出）产生的肝内移植，未产生使用原代人肝癌样品的任何肝内移植用这种方法，尽管使用部分肝切除的。
图1。协议说明用于处理和制备的HCC样品，以及随后的异种移植选项（插图）的工作流程的示意性概述。
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图2。从肝癌患者肝切除的标本。该患者从未接受任何辅助治疗肿瘤。白框表示附近，是为异种移植获得外围的肿瘤可行的部分。在右上方的比例尺对应于1厘米。
图3。人肝癌细胞异种移植物的皮下注射肿瘤细胞的产生A）的肿瘤可以容易地理解上的动物。B）的右胁腹的肿瘤被认为是牺牲动物后，可从周围组织不同的。C）上肿瘤的组织学证明肝癌的典型特征，包括肝细胞样细胞，核异型性和高核到细胞质的比例，没有汇管区和区orted小梁肝癌板的增加的厚度。比例尺对应于1厘米的面板A和B，以及100微米图 C。 点击这里查看大图 。
图4。肝内肝癌移植，从小鼠肝脏人类肿瘤片段植入生成的）异种移植。脑实质内肿瘤指示的黑色箭头。标尺刻度在照片中从注射人肿瘤细胞的小鼠脾的部分切除后产生厘米B）异种移植物底部。脑实质内肿瘤指示的黑色箭头。比例尺通过肝内移植正在示威保证金相当于1厘米。 三）组织学部分ING肝癌（右下）和邻近的正常小鼠肝脏（左上）的典型特征。比例尺对应于100微米。 点击这里查看大图 。
| 植入网站 | 植入方法 | 肿瘤的接受率 |
| 皮下 | 细胞悬液 | 五十五分之六（10.9％） |
| 肿瘤片段 | 一百三十六分之二十三（16.9％） | |
| 脾 | 细胞悬液 | 3/15（20％）* |
| 细胞悬液+肝部分切除术 | 6/14（42.9％）* | |
| 肝脏 | 肿瘤片段 | 6/13（46.2％） |
| 肿瘤片段+肝部分切除术 2/3（66.7％） | ||
| 细胞悬液 | 不执行 | |
| 细胞悬液+肝部分切除术 | 0/8（100％） | |
| *这产生了肝内肿瘤结节样的比例 | ||
表1中。人肝癌细胞植入率对应不同的植入技术免疫缺陷小鼠。
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Discussion
我们已经描述了多种技术来建立皮下和肝内人类肝癌异种移植物中，可以应用到各种各样的实验问题，并测定免疫缺陷小鼠。而皮下异种移植物已被广泛用于研究肝癌生物学的各个方面，肝内异种移植物在文献中很少描述。此外，大多数研究描述了使用异种移植物的从良好建立的细胞系产生的这些。给定的肿瘤细胞系中模拟人类肿瘤生物学12的限制，我们一直激励，以验证上述利用原代人HCC组织中所描述的技术。虽然不是由于实验组的小样本支持的统计分析，我们的观察结果揭示了主观上对改进的植入率与另外部分切除肿瘤细胞或片段的肝内移植的一个引人注目的趋势。</ P>
在一些研究已严格企图利用主要组织取得成功的皮下植入与获得13-15的患者样本中，只有非常小的比例。我们还观察到原代人肝癌样品的比例，成功地嫁接在使用上面描述的技术的免疫缺陷小鼠的皮下空间被限制为约15％。在人的肝脏，肝癌病灶血供，经肝动脉16,17接受他们的血液供应主要。我们推测，我们和其他人观察原发性肝癌组织中的低植入率可能是新鲜肝癌组织的微环境成他们是异种移植的，没有建立动脉供应的相对缺氧的漏洞所致。肝癌组织在手术切除和异种移植之间的时间间隔快速缺血性坏死的敏感性也可能accouNT的小鼠中实现了低植入率。
用于从肿瘤细胞悬液肝内人类肝癌异种移植物的生成，我们发现，细胞注射入脾脏是技术上有利的办法，结果在从原代人肝癌样品肝移植的优良率。脾脏是一个可以更好地支持肝癌细胞与其他网站在小鼠体内相比，高度血管结构，并从其中肿瘤细胞出现通过脾和门静脉容易地旅行到肝脏。与肝实质，在其中它在技术上是难以直接注入细胞无渗漏或出血比较，脾脏具有容纳被注入的细胞悬浮液的体积的结构能力，并且可以很容易地连接，一旦肿瘤细胞注射已完成。注入细胞悬液直接加入在6-8周龄小鼠的门静脉或肝动脉在技术上并不FEASIBLE。
我们已经利用部分肝切除的受体小鼠，以促进人肝癌组织中的肝内移植。虽然部分肝切除的小鼠模型已被广泛用于研究肝再生18的生物，我们并不知悉描述它与肝内肿瘤异种移植组合的任何报告。由于肝脏再生迅速发生在部分切除后的第一数天，我们推测，肝实质内有丝分裂和血管生成的刺激大大增强表达式将更好地支持的剩余部分内植入脆弱的人类肿瘤组织或细胞的移植和扩散小鼠肝脏，如用小鼠肝脏中的“静止”状态19相比较。在人类中，对肝癌发展的最大的危险因素是先进的肝纤维化或肝硬化，其特点是杂乱无章的再生没有发展dules，并已被概念化由一些慢性肝损伤和再生20的状态。我们已经证明通过激活肝脏再生嫁接人类肝癌组织到小鼠肝脏的技术可能被证明是一个有价值的模型，允许调查肝脏微环境和肝脏再生的机制在肝癌的病理生理作用。
而本文所描述的技术能够产生在免疫缺陷小鼠中的高品质的原代人肝细胞癌异种移植物中，研究者考虑使用这些协议必须考虑该模型的一些局限性。首先，我们的协议包括手术切除的患者组织的，其在实验室中随后的处理之间的延迟最小，但实现仍然是一个挑战高植入率，这表明，可行的实施这些技术需要病人组织采集地接近实验室，或基础设施，可以最大限度地减少在新鲜标本传输延迟。第二，对6-8周龄的免疫缺陷小鼠腹腔内复杂的外科手术必须由受过适当训练的人员，以达到动物的存活数月才进行异种移植物的形成，这些程序和随后的动物护理都是耗费时间和资源。第三，肝内移植瘤的发生和发展不能容易地在不牺牲动物在预定时间点，限制了异种移植物的效用在这个位置对于某些类型的测定如上文所述进行监测。此外，来自于细胞注射入脾脏肝内移植瘤可以表现为多个结节分散在整个肝实质，很难精确地量化在总肿瘤负荷方面。最后，需要注意的是从细胞注射到造成脾脏肝内肿瘤结节可以选择是很重要的结构延续反映细胞，其能够从脾迁移到肝脏和随后的肿瘤启动的特定亚群。
当生成从原代人HCC组织异种移植物，这也很重要，以确认所产生的异种移植物类似的HCC。之前我们已经证实，淋巴瘤可以在不经意间从异种移植人肝癌组织21内的乘客白细胞发展。因此，我们经常耗尽人CD45 +白细胞从原发肿瘤细胞悬液，利用RT-PCR，流式细胞仪，组织病理学评估，及免疫组化法检测移植瘤的典型特征肝癌。当传代建立异种移植物用于进一步的研究中，肿瘤浸润鼠细胞也应使用抗体对小鼠组织相容性抗原H2K耗尽。如果研究中的应用涉及使用肿瘤片段或异种移植物生长的测定中，xenogra的分析FTS在研究终点应包括该肿瘤是由人类白细胞和小鼠细胞浸润的程度进行评估。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
这项工作是由卫生研究第1阶段临床医生，科学家奖（AG），一个加拿大学院和操作格兰特从癌症研究协会（AG）的支持。作者感谢约翰·迪克博士对他的支持这个项目。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Mod. Eagle Medium/Ham’s F12 50/50 Mix x1(DMEM-F12) | WISENT Bioproducts | 319-075-CL | |
| Collagenase TypeIV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Dispase II | Stemcell Technologies | 7923 | |
| Matrigel Matrix | Becton-Dickinson Biosciences | 354234 | |
| 10 % Buffered Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| 0.9 % Saline Solution (NaCl), sterile | House Brand | 1011-L8001 | |
| Betadine surgical scrub | Purdue Pharma | NPN 00158313 | |
| Buprenorphine (Temegesic) NR 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser | ||
| Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | M60302 | |
| Tear-Gel | Novartis Pharmaceuticals | ||
| Frozen section compound | VWR | 95057-838 | |
| Cryomold, Tissue -Tek | Sakura Finetek | 4566 | |
| Precision Glide Needle 18G 1 ½ | Becton-Dickinson Biosciences | 305196 | |
| Precision Glide Needle 27G ½ | Becton-Dickinson Biosciences | 305109 | |
| Insulin syringe, 3/10 cc U-100, 29G½ | Becton-Dickinson Biosciences | 309301 | |
| Surgical blade No.10 | Feather Safety Razor Co. | 08-916-5A | |
| #5-0 Soft silk surgical suture, 3/8" taper point needle | Syneture | VS-880 | |
| Transpore surgical tape | 3M Health care | 1577-1 | |
| Cotton applicator | Medpro | 018-425 | |
| Surgicel, oxidized regenerated cellulose | Ethicon | 1951 | |
| Cell strainer 100 μm nylon | Becton-Dickinson Biosciences | 352360 | |
| Magnification lighting with mobile base | Benson medical Industries Inc. | model: RLM-CLT-120V | |
| Petridish sterile 100x20 mm | Sarstedt | 821474 | |
| Tissue forcep, 1x2 teeth, 4-1/2" | Almedic | A10-302 | |
| Adson dressing forcep 4-3/4" | Almedic | A10-220 | |
| Eye dressing forcep, serrated, straight, 4" | Almedic | A19-560 | |
| Hartman Hemostatic Forceps, curved, 3-1/2" | Almedic | A12-142 | |
| Iris scissor, curved, 4-1/4" | Almedic | A8-690 | |
| Iris scissor, straight, 4-1/2" | Almedic | A8-684 | |
| Olsen-Hegan needle driver, 5-1/2" | Almedic | A17-228 |
References
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