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Immunodeficient चूहों में चमड़े के नीचे और Intrahepatic मानव hepatocellular कार्सिनोमा Xenografts की पीढ़ी

Published: September 25, 2013 doi: 10.3791/50544
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 1,3
1Toronto General Research Institute, University Health Network, 2Department of Pathology, University Health Network, 3Division of General Surgery, University Health Network

Summary

Immunodeficient चूहों में मानव ट्यूमर xenografts कैंसर जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए मूल्यवान उपकरण हैं. मानव hepatocellular कार्सिनोमा कोशिकाओं या ट्यूमर के टुकड़े से चमड़े के नीचे और intrahepatic xenografts उत्पन्न करने के लिए विशिष्ट प्रोटोकॉल में वर्णित हैं. प्राप्तकर्ता चूहों में आंशिक hepatectomy से प्रेरित जिगर उत्थान intrahepatic engraftment की सुविधा के लिए एक रणनीति के रूप में प्रस्तुत किया है.

Abstract

Vivo में मानव रोग पुनरावृत्ति कि hepatocellular कार्सिनोमा (एचसीसी) की प्रयोगात्मक मॉडल रोग pathophysiology में अनुसंधान के लिए और उपन्यास के उपचारों के preclinical मूल्यांकन के लिए एक मूल्यवान मंच प्रदान करते हैं. हम अनुसंधान आवेदनों की एक किस्म में उपयोग किया जा सकता है कि immunodeficient चूहों में चमड़े के नीचे या orthotopic मानव एचसीसी xenografts उत्पन्न करने के तरीकों की एक किस्म प्रस्तुत करते हैं. एक शुरुआती बिंदु के रूप में शल्य लकीर के दौर से गुजर रोगियों से प्राथमिक ट्यूमर के ऊतक के उपयोग पर ध्यान देने के साथ, हम xenografting के लिए सेल निलंबन या ट्यूमर के टुकड़े की तैयारी का वर्णन है. माउस तिल्ली में कोशिकाओं के इंजेक्शन द्वारा परोक्ष रूप से या द्वितीय) intrahepatically, या तो ट्यूमर कोशिकाओं या टुकड़े के प्रत्यक्ष आरोपण से जिगर में, या, हम इन ऊतकों मैं) subcutaneously xenograft के लिए विशेष तकनीक का वर्णन. हम भी एक रणनीति के रूप में xenografting के समय में देशी माउस जिगर का आंशिक लकीर के उपयोग का वर्णनप्राथमिक मानव ट्यूमर कोशिकाओं के intrahepatic engraftment सुविधा हो सकती है कि प्राप्तकर्ता माउस में सक्रिय जिगर उत्थान का एक राज्य प्रेरित. इन तकनीकों का अपेक्षित परिणाम सचित्र हैं. वर्णित प्रोटोकॉल आम तौर पर कम मजबूती के साथ साहित्य में व्यापक रूप से इस्तेमाल किया और अक्सर उद्धृत कर रहे हैं कि अच्छी तरह से स्थापित मानव एचसीसी सेल लाइनों से प्रदर्शन जो प्राथमिक मानव एचसीसी नमूनों और xenografts, का उपयोग मान्य किया गया है. सेल लाइनों के साथ इसकी तुलना में, हम xenotransplantation मॉडल में प्राथमिक एचसीसी engraftment की अपेक्षाकृत कम मौका योगदान और xenograft विकास के कैनेटीक्स को प्रभावित कर सकते हैं कि तकनीकी मुद्दों पर टिप्पणी कर सकते हैं, जो कारकों पर चर्चा की. हम यह भी प्राप्त xenografts सही जनक एचसीसी ऊतकों जैसे लगते हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए लागू किया जाना चाहिए कि तरीकों का सुझाव.

Introduction

Hepatocellular कार्सिनोमा (एचसीसी) दुनिया भर में पांचवां सबसे आम कैंसर और उत्तरी अमेरिका में कैंसर से मौत का सबसे तेजी से बढ़ रही है कारण है. एचसीसी के लिए सबसे अधिक प्रचलित जोखिम कारक सबसे अक्सर कारण क्रोनिक वायरल हैपेटाइटिस, शराब दुरुपयोग, autoimmune रोग, या वंशानुगत चयापचय संबंधी विकार 1 के लिए होने वाली, लीवर सिरोसिस है.

दुनिया भर में आबादी पर एचसीसी द्वारा लगाए गए भारी रोग बोझ के बावजूद, एचसीसी के pathophysiology अपेक्षाकृत खराब ऐसी कोलोरेक्टल, स्तन, या प्रोस्टेट कैंसर के रूप में अन्य आम कैंसर की तुलना में समझा जाता है. उदाहरण के लिए, tumorigenesis ड्राइविंग विशिष्ट आणविक और सेलुलर घटनाओं को स्पष्ट रूप से 2 से परिभाषित किया जाना है. अधिकांश अन्य ठोस उपकला कैंसर की तरह, जीनोमिक दृष्टिकोण एचसीसी 3 के साथ जुड़े aberrations में विविधता का पता चला है. अध्ययन का एक नंबर सेल प्रसार, सुर में शामिल संकेत दे रास्ते की एक किस्म की अव्यवस्थित गतिविधि से पता चला हैvival, भेदभाव, और angiogenesis 4. इसके अलावा, एचसीसी pathobiology में कैंसर स्टेम सेल की भूमिका 5 स्पष्ट किया जाना बना रहता है.

एचसीसी pathophysiology के एक सीमित समझ के साथ, एचसीसी के लिए प्रभावी उपचार का साधन भी अपेक्षाकृत सीमित रह गया है. पुनरावृत्ति आम है, हालांकि जिगर तक ही सीमित ट्यूमर के साथ प्रारंभिक अवस्था रोगियों, ट्यूमर पृथक या शल्य लकीर का उपयोग उपचारात्मक उपचार के लिए उम्मीदवार हैं. अधिक उन्नत रोग, कीमोथेरेपी और विकिरण के साथ रोगियों के लिए सीमित प्रभाव के हैं और उपशामक इरादे 6 के साथ रोग नियंत्रण के लिए मुख्य रूप से इस्तेमाल कर रहे हैं.

मानव एचसीसी के विवो प्रयोगात्मक मॉडल में उच्च गुणवत्ता के इस प्रकार उपन्यास चिकित्सकीय दृष्टिकोण के मूल्यांकन के लिए और साथ ही मानव एचसीसी के pathophysiology में बहुत आवश्यक बुनियादी अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान मंच प्रदान करते हैं. सेल लाइनों या अत्यधिक परिभाषित माउस मॉडल का उपयोग, पंचायती राज के xenografts के साथ तुलना के रूप मेंउन्होंने यह भी 7,8 के भीतर और विभिन्न रोगियों के बीच मौजूद है कि विविधता पर कब्जा है, जबकि उच्च निष्ठा के साथ मानव रोग recapitulating में सक्षम हैं के बाद से immunodeficient चूहों में मैरी मानव ट्यूमर इस तरह के अध्ययन के लिए मूल्यवान उपकरण के रूप में उभरा है. यह अंत करने के लिए, हम immunodeficient चूहों में मानव एचसीसी xenografts स्थापित करने के तरीकों की एक किस्म विकसित की है. एचसीसी xenografts शामिल प्रकाशित अध्ययन के बहुमत इस उद्देश्य के लिए अच्छी तरह से स्थापित मानव एचसीसी सेल लाइनों का उपयोग का वर्णन करते हैं, हम तुरंत रोगियों से शल्य लकीर के बाद प्राप्त प्राथमिक एचसीसी नमूनों से xenografts उत्पन्न करने के लिए हमारे assays के अनुकूलन पर ध्यान केंद्रित किया है.

विभिन्न xenografting तकनीक विभिन्न अनुसंधान अनुप्रयोगों के लिए आवश्यक हो सकता है. उदाहरण के लिए, ट्यूमर के टुकड़े से उत्पन्न चमड़े के नीचे xenografts, तेजी से उत्पन्न कर रहे हैं आसानी से निगरानी कर रहे हैं, और सुविधाजनक के साथ उपन्यास चिकित्सा विज्ञान के स्थानीय प्रशासन के लिए अधिक उपयुक्त हो सकता हैट्यूमर प्रतिक्रिया की निगरानी. Intrahepatic xenografts एचसीसी जीव विज्ञान में यकृत microenvironment की भूमिका से संबंधित अध्ययन के लिए और अधिक प्रासंगिक हो सकता है. ट्यूमर सेल निलंबन से उत्पन्न Xenografts ट्यूमर की शुरुआत सेल सबसेट की पहचान और लक्षण वर्णन के लिए या पूर्व xenotransplantation को ट्यूमर कोशिकाओं के इन विट्रो जोड़तोड़ में आवश्यकता के प्रयोगों के लिए आवश्यक हैं. हम इस प्रकार विकसित की है और प्राथमिक मानव एचसीसी नमूनों से निकाली गई कोशिका निलंबन या ट्यूमर के टुकड़े से चमड़े के नीचे या intrahepatic xenografts स्थापित करने के लिए निम्नलिखित प्रोटोकॉल पुष्टि की है.

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Protocol

प्रोटोकॉल का एक योजनाबद्ध सिंहावलोकन चित्र 1 में प्रस्तुत किया है.

1. मानव एचसीसी नमूने के प्रसंस्करण

लिखित रोगी सहमति से और संस्थागत अनुसंधान नैतिकता बोर्ड के अनुमोदन के साथ प्राथमिक मानव एचसीसी नमूने प्राप्त. इन प्रोटोकॉल मानव कल्याण के लिए सभी, संस्थागत, राष्ट्रीय और अंतरराष्ट्रीय दिशा निर्देशों के अनुपालन में विश्वविद्यालय स्वास्थ्य नेटवर्क रिसर्च एथिक्स बोर्ड से मंजूरी के साथ हमारी संस्था में बाहर किया गया है.

एक बार उपयुक्त नमूने नैदानिक ​​प्रयोजनों के लिए ले लिया गया है शल्य प्रक्रिया के बाद जितनी जल्दी हो सके ताजा एचसीसी नमूनों ले लीजिए. आदर्श रूप में इस मरीज से ऊतक को हटाने के बाद 30 मिनट के भीतर जगह ले जाना चाहिए. चित्रा 2 में सचित्र रूप में ट्यूमर के मध्य भाग परिगलित हो सकता है, के रूप में ट्यूमर की परिधि से प्राप्त कम से कम 1 सेमी 3 का एक नमूना, इष्टतम है.पूर्व में इस तरह के विकिरण, रसायन चिकित्सा, या पृथक रूप में लकीर के लिए कोई इलाज नहीं मिला है कि ट्यूमर ट्यूमर कोशिकाओं व्यवहार्य हैं कि मौका अधिकतम करने के लिए पसंद कर रहे हैं. Biohazardous सामग्री के लिए मानक व्यक्तिगत सुरक्षा प्रोटोकॉल के अनुसार प्राथमिक मानव ऊतकों को संभाल. सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग कर एक वर्ग द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट में ट्यूमर ऊतकों और सेल तैयारी के सभी प्रयोगशाला जोड़तोड़ प्रदर्शन.

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10-25 मिलीलीटर सीरम मुक्त Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम / हाम F12 में ताजा एचसीसी नमूना प्लेस और तत्काल प्रसंस्करण और चूहों में xenografting के लिए ऊतक टुकड़े और / या कोशिकाओं की तैयारी के लिए प्रयोगशाला में बर्फ पर स्थानांतरण.
  2. बाँझ संदंश का प्रयोग, एक 100 मिमी x 20 मिमी पेट्री डिश या अन्य उपयुक्त बाँझ काम की सतह में ट्यूमर नमूना जगह है. एक नं .10 शल्य चिकित्सा स्केलपेल ब्लेड का उपयोग लगभग 2-3 मिमी 3 के टुकड़ों में ट्यूमर नमूना फूट डालो. इस बिंदु पर, स्नैप ठंड या formalin फिक्सिंग है पर विचारआवश्यकता के रूप में ome ट्यूमर अन्य प्रयोगों के लिए टुकड़े या विश्लेषण करती है.
  3. ट्यूमर के टुकड़े की xenografting के लिए, टुकड़े जलमग्न रहने के लिए अनुमति के लिए पर्याप्त Matrigel युक्त एक या एक से अधिक microcentrifuge ट्यूबों में एचसीसी के टुकड़े से कुछ जगह है. बर्फ पर इन ट्यूबों रखें.
  4. एक ट्यूमर सेल निलंबन की तैयारी के लिए, शेष एचसीसी ऊतक जितना संभव कीमा और कीमा बनाया हुआ ऊतक की मात्रा के आधार पर एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में DMEM-F12 के 5-10 मिलीलीटर के साथ मिश्रण करने के लिए शल्य चिकित्सा स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करें.
  5. मिलीलीटर 200 इकाइयों / के अंतिम सांद्रता में collagenase प्रकार चतुर्थ और dispase द्वितीय जोड़ें और 0.8 इकाइयों / क्रमशः एमएल. एक 25 एमएल पिपेट का उपयोग अच्छी तरह से ऊपर और नीचे मिश्रण पिपेट.
  6. ट्यूब को सील करने और ट्यूमर के ऊतक की कोमलता के आधार पर 30-60 मिनट के लिए एक 5% कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर कदम 1.6 से मिश्रण सेते हैं. Enzymatic पाचन की प्रगति का आकलन करने के लिए और कुछ ही समय में हर 10 मिनट नीचे मिश्रण पिपेट.
  7. डी के बादGestion एक 100 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से ट्यूमर समाधान पारित, पूरा हो गया है. धीरे के माध्यम से पारित करने के लिए ट्यूमर कोशिकाओं की अधिकतम संख्या को सक्षम करने के लिए एक 25 एमएल पिपेट टिप का उपयोग सेल झरनी पर शेष ऊतक सानी. एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में तनावपूर्ण सेल निलंबन लीजिए.
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1200 rpm पर ट्यूमर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र
  9. धीरे सतह पर तैरनेवाला छानना. गोली के आकार पर निर्भर करता है, बर्फ के ठंडे 1x लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) की मिलीलीटर बफर lysis और धीरे से ऊपर विंदुक और नीचे गोली resuspend को 2-5 जोड़ें. 5 मिनट के लिए बर्फ पर रखें.
  10. आरबीसी lysis बफर बाहर धोने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 1000 rpm पर 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र की कुल मात्रा को DMEM-F12 जोड़ें.
  11. धीरे सतह पर तैरनेवाला छानना और DMEM-F12 में आरबीसी मुक्त ट्यूमर सेल गोली resuspend.
  12. या तो स्वयं या एक स्वचालित सेल काउंटर साथ trypan नीले बहिष्कार का उपयोग व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना.
  13. वांछित numbe युक्त अपकेंद्रित्र ट्यूमर सेल aliquotsऊपर वर्णित के रूप में इंजेक्शन के लिए कोशिकाओं के आर, जिसके परिणामस्वरूप सेल ठंडा Matrigel की 30 μl में गोली, और बर्फ पर दुकान resuspend.

वैकल्पिक: कदम 1.11 के बाद, हम नियमित रूप से थोक ट्यूमर सेल निलंबन से मानव CD45 + कोशिकाओं (ल्यूकोसाइट्स) गिरेगा और / या प्रवाह cytometry या immunomagnetic मोती का उपयोग ट्यूमर कोशिकाओं के सबसेट शुद्ध. इन तकनीकों के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल अच्छी तरह से प्रासंगिक एंटीबॉडी, मोती, और प्रवाह cytometers के निर्माताओं से वर्णित हैं.

नोट: प्रोटोकॉल ऊपर वर्णित भी 1.1 चरण में प्राथमिक मानव एचसीसी ऊतक के लिए xenograft ऊतक प्रतिस्थापन, धारावाहिक प्रत्यारोपण प्रदर्शन करने के क्रम में चूहों से काटा मानव ट्यूमर xenografts पर कार्रवाई करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस स्थिति में, कदम 1.11 के बाद, हम नियमित माउस उतक अनुरूपता प्रतिजन H2k के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग सेल निलंबन से murine कोशिकाओं घुसपैठ और गिरेगा.

2.Xenografting

संस्थागत पशु की देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के साथ अनुपालन में सभी पशु प्रक्रियाओं का संचालन. यहाँ बताया प्रक्रियाओं सभी प्रासंगिक विनियामक और संस्थागत एजेंसियों, नियमों, और दिशा निर्देशों के अनुसार और अनुपालन में विश्वविद्यालय स्वास्थ्य नेटवर्क पशु की देखभाल समिति द्वारा अनुमोदित एक विशिष्ट पशु उपयोग प्रोटोकॉल के तहत पूरा किया गया है.

छोटे जानवरों को inhalational अस्थिर संवेदनाहारी एजेंटों की डिलीवरी के लिए उपकरण जानवरों की सुविधा और अनुसंधान संस्थान के मानक संचालन प्रक्रियाओं के अनुसार किया जाना चाहिए. एक वर्ग द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट में सड़न रोकनेवाला तकनीक और बाँझ उपकरणों का उपयोग सभी सर्जिकल प्रक्रियाओं को पूरा. गैर मोटे मधुमेह गंभीर संयुक्त इम्यूनो उपयोग (इशारा / SCID) या उम्र के 6-8 सप्ताह में या तो सेक्स के चूहों का इशारा / SCID / इंटरल्यूकिन 2 रिसेप्टर गामा श्रृंखला बातिल (एनएसजी) उपभेदों (जैक्सन प्रयोगशाला, बार हार्बर, इ) 9,10. इनचूहों immunodeficient पशुओं के लिए उपयुक्त रोगज़नक़ मुक्त स्थितियां प्रदान करने में सक्षम एक सुविधा में रखे और बनाए रखा जाना चाहिए.

1 एल / ऑक्सीजन की मिनट में 5% (v / v) साँस Isoflurane की आपूर्ति एक कक्ष में सर्जरी के लिए चूहों को तैयार है. कार्निया और पैर की अंगुली पलटा का नुकसान जानवर (ओं) में जब तक वहाँ संज्ञाहरण बनाए रखें. चमड़े के नीचे xenografting के लिए, जानवर (ओं) की पीठ पर एक या अधिक छोटे क्षेत्रों दाढ़ी और 70% इथेनॉल के साथ त्वचा को साफ. Intrahepatic xenografting के लिए, नीचे वंक्षण क्षेत्र को axillae से पशु (ओं) के उदर छाती और पेट दाढ़ी और 70% इथेनॉल के साथ त्वचा को साफ.

ट्यूमर टुकड़े का 2.1 चमड़े के नीचे आरोपण

  1. एक मुखपत्र साथ inhalational isoflurane संज्ञाहरण (2% (v / v) 1 एल में / मिनट ओ 2) को बनाए रखने, प्रवण anesthetized माउस रखें. घाव चोट से पशु की आंखों की रक्षा के लिए आंसू जेल लागू करें.
  2. Betadine साथ पृष्ठीय मुंडा क्षेत्र (ओं) जीवाणुरहितशल्य साफ़ 70% इथेनॉल के द्वारा पीछा किया और अन्त में povidone आयोडीन समाधान के साथ.
  3. बाँझ तेज कैंची का उपयोग कर एक 5 मिमी त्वचा चीरा.
  4. धीरे चमड़े के नीचे अंतरिक्ष में एक बंद कुंद कैंची डालें और एक ट्यूमर टुकड़ा समायोजित करने के लिए एक काफी बड़े जेब विकसित करने के लिए धीरे फैल गया.
  5. बाँझ ठीक संदंश का उपयोग चमड़े के नीचे जेब में 1.3 चरण में तैयार ट्यूमर टुकड़ा डालें.
  6. टांके या क्लिप का उपयोग त्वचा चीरा बंद करें.
  7. नीचे वर्णित के रूप में माउस को पश्चात देखभाल प्रदान.

ट्यूमर कोशिकाओं के 2.2 चमड़े के नीचे इंजेक्शन

  1. कदम 2.1.1 और 2.1.2 में वर्णित के रूप में पशु की तैयारी.
  2. सुई में एक 29 जी 1/2 के साथ एक इंसुलिन सिरिंज में कदम 1.13 में तैयार Matrigel में ट्यूमर कोशिकाओं के निलंबन लोड करें.
  3. चमड़े के नीचे अंतरिक्ष में सुई डालने और सिरिंज की सामग्री का निर्वहन. दूर चमड़े के नीचे विमान के साथ सुई कई मिलीमीटर fr आगे बढ़नेओम त्वचा पंचर साइट सुई की वापसी पर पंचर साइट से बाहर ट्यूमर सेल निलंबन के रिसाव को रोकता है.
  4. नीचे वर्णित के रूप में माउस को पश्चात देखभाल प्रदान.

ट्यूमर टुकड़े का 2.3 Intrahepatic आरोपण

  1. 1 मिलीलीटर सिरिंज पर सुई में एक 27 जी 1/2 का प्रयोग, intraoperative द्रव नुकसान की भरपाई के लिए anesthetized जानवर की गर्दन की पीठ में बाँझ सामान्य नमक समाधान subcutaneously के 350 μl प्रशासन. Analgesia के लिए, एक 1 मिलीलीटर सिरिंज पर एक 27 जी 1/2-in सुई का प्रयोग, subcutaneously जानवर की दिशा में बाँझ सामान्य नमक युक्त buprenorphine (0.1 मिलीग्राम / किग्रा) के 350 μl प्रशासन.
  2. रखरखाव inhalational isoflurane संज्ञाहरण (2% (v / v) 1 एल में / मिनट ओ 2) वितरित करने के मुखपत्र के अंदर तैनात नाक और मुंह से एक पूर्व गर्म पैड पर माउस लापरवाह रखें.
  3. अंगों का विस्तार करने और जोखिम का अनुकूलन करने के लिए ऑपरेटिंग सतह के लिए टेप के साथ उन्हें सुरक्षितउदर पेट और छाती.
  4. दृश्य अनुकूलन करने के लिए एक आवर्धक दीपक के तहत प्रक्रिया करते हैं.
  5. और अन्त में povidone आयोडीन समाधान के साथ 70% इथेनॉल द्वारा पीछा Betadine शल्य साफ़ साथ उदर पेट और छाती पर मुंडा त्वचा जीवाणुरहित.
  6. बाँझ तेज कैंची का प्रयोग, एक अनुप्रस्थ द्विपक्षीय subcostal त्वचा चीरा बनाने और पूरे जिगर की पर्याप्त जोखिम अनुमति देने के लिए peritoneal गुहा में प्रवेश करने की मांसपेशी परतों विभाजित करते हैं.
  7. असिरूप प्रक्रिया ऊपर त्वचा में एक सिलाई प्लेस और जिगर और आसपास के ढांचे के बेहतर प्रदर्शन की अनुमति देने के क्रम में टेप के साथ मुखपत्र के लिए यह सुरक्षित.
  8. यह स्थिर करने के लिए जिगर के दो कपास इत्तला दे दी आसन्न applicators और पीछे का प्रयोग करें.
  9. एक बाँझ सं 10 स्केलपेल ब्लेड का उपयोग जिगर की सतह पर लंबाई और गहराई में एक चीरा 3 मिमी बनाओ.
  10. तुरंत Surgicel और रक्तस्तम्भन प्राप्त करने के लिए चीरा साइट पर कोमल दबाव लागू होते हैं, 60-90 सेकंड के बाद हटा देंऔर पूरा रक्तस्तम्भन हासिल किया गया है केवल तभी आगे बढ़ें.
  11. बाँझ ठीक संदंश के साथ या एक 18 जी सुई के साथ जिगर चीरा में एक ट्यूमर टुकड़ा कदम 1.3 रखें.
  12. ट्यूमर टुकड़ा के विस्थापन को रोकने और निरंतर रक्तस्तम्भन सुनिश्चित करने के लिए जिगर चीरा पर Surgicel का एक छोटा सा टुकड़ा लागू करें.
  13. टांके या क्लिप के साथ चीरा बंद करें.
  14. जैसा कि नीचे वर्णित पश्चात देखभाल प्रदान

जिगर में डायरेक्ट इंजेक्शन के माध्यम से ट्यूमर कोशिकाओं के 2.4 Intrahepatic आरोपण

  1. ऊपर 2.3.7 के लिए कदम 2.3.1 में वर्णित के रूप में माउस की तैयारी.
  2. सुई में एक 29 जी 1/2 का उपयोग कर एक इंसुलिन सिरिंज में ट्यूमर सेल निलंबन (कदम 1.13 में तैयार) लोड.
  3. जिगर एक कपास टिप applicator का उपयोग कर स्थिर हो साथ, जिगर में इंसुलिन सिरिंज सुई डालने और टिप एक subcapsular विमान के साथ पंचर साइट परे कुछ मिलीमीटर अग्रिम.
  4. धीरे सिरिंज और टी की सामग्री का निर्वहनमुर्गी जिगर से सुई को हटा दें.
  5. जगह पंचर साइट पर Surgicel और ट्यूमर सेल निलंबन के रिसाव को रोकने के लिए और पूरी रक्तस्तम्भन प्राप्त करने के लिए एक कपास इत्तला दे दी applicator के साथ कोमल दबाव लागू होते हैं.
  6. टांके या क्लिप के साथ चीरा बंद करें और नीचे के रूप में वर्णित पश्चात की देखभाल प्रदान करते हैं.

प्लीहा में इंजेक्शन के माध्यम से ट्यूमर कोशिकाओं के 2.5 Intrahepatic Xenografting

  1. ऊपर 2.3.5 के लिए कदम 2.3.1 में वर्णित के रूप में माउस की तैयारी.
  2. बाँझ तेज कैंची का प्रयोग, एक 1 सेमी peritoneal गुहा में प्रवेश करने के subcostal चीरा छोड़ दिया करते हैं.
  3. तिल्ली का पर्दाफाश करने के क्रम में cranially और जानवर दाएं लिए पेट को प्रतिबिंबित करने के लिए एक कपास इत्तला दे दी applicator का प्रयोग करें.
  4. बाँझ ठीक atraumatic संदंश के साथ आसपास वसा ऊतकों से निपटने के द्वारा, चीरा में तिल्ली देने और इसे स्थिर करने के लिए तिल्ली के पीछे एक कपास इत्तला दे दी applicator जगह है.
  5. 5-0 रेशम सीवन, जगह का उपयोगनिचले छोर ऊपर तिल्ली के चारों ओर एक ढीला पूर्व बंधे गाँठ.
  6. सुई में एक 29 जी 1/2 का उपयोग कर एक इंसुलिन सिरिंज में ट्यूमर सेल निलंबन (कदम 1.13 में तैयार) लोड.
  7. तिल्ली के निचले पोल में इंसुलिन सिरिंज सुई डालें और ढीली पूर्व बंधे गाँठ का स्तर पिछले अग्रिम.
  8. धीरे धीरे, सिरिंज की सामग्री का निर्वहन तिल्ली से सुई को निकालने, और इंजेक्शन ट्यूमर सेल निलंबन के किसी भी रिसाव को रोकने के लिए गाँठ कस लें.
  9. Peritoneal गुहा में तिल्ली बदलें.
  10. टांके या क्लिप के साथ चीरा बंद करें और नीचे के रूप में वर्णित पश्चात की देखभाल प्रदान करते हैं.

मानव ट्यूमर के ऊतक के Intrahepatic engraftment सुकर 2.6 आंशिक hepatectomy

  1. 2.3.7 के लिए कदम 2.3.1 में वर्णित के रूप में माउस की तैयारी.
  2. बाँझ तेज कैंची के साथ, जिगर की औसत पालि से जुड़ी दात्राकार बंधन विभाजित करते हैं.
  3. एक कपास इत्तला दे दी applicator का उपयोग कर, लामबंदबाईं पालि के आसपास 5-0 रेशम सीवन के जिगर और स्थिति एक ढीला पूर्व बंधे गाँठ की बाईं पालि. बाईं पालि की bilio संवहनी डंडी की दिशा में संभव के रूप में बंद ढीली गाँठ अग्रिम और गाँठ कस लें.
  4. गाँठ और बाद में रक्तस्राव की फिसलन को रोकने के लिए एक छोटे से स्टंप छोड़ रहा है, बाँझ कैंची का उपयोग संयुक्ताक्षर के लिए बाईं पालि बाहर का आबकारी.
  5. एक ऐसी ही तकनीक का उपयोग करना, ligate और पित्ताशय की थैली से परहेज, जिगर की औसत पालि के बहुमत बांटना.
  6. इस्तेमाल की Surgicel और पूरा रक्तस्तम्भन प्राप्त करने के लिए जिगर पैरेन्काइमा की कटौती सतहों साथ एक कपास इत्तला दे दी applicator के साथ कोमल दबाव.
  7. एक ट्यूमर टुकड़ा या ट्यूमर कोशिकाओं के intrahepatic xenografting के लिए, जैसा कि ऊपर वर्णित 2.4.5 के लिए कदम 2.3.11 या 2.4.2 के लिए 2.3.8 के साथ आगे बढ़ना.
  8. प्लीहा इंजेक्शन के माध्यम से ट्यूमर कोशिकाओं की intrahepatic xenografting के लिए, exposi, धीरे cranially और जानवर दाएं लिए पेट को प्रतिबिंबित करने के लिए कपास इत्तला दे दी applicators उपयोगतिल्ली एनजी. जैसा कि ऊपर वर्णित 2.5.9 के लिए कदम 2.5.4 के साथ आगे बढ़ें.
  9. टांके या क्लिप के साथ चीरा बंद करें और नीचे के रूप में वर्णित पश्चात की देखभाल प्रदान करते हैं.

2.7 पश्चात की देखभाल

  1. Inhalational संज्ञाहरण मुखपत्र से माउस निकालें.
  2. संज्ञाहरण से बरामद किया और पूरी तरह से जुटाने तक लगभग 20 मिनट के लिए एक गर्मी दीपक के नीचे एक पिंजरे में माउस रखें.
  3. पहले 2-3 पश्चात दिन में buprenorphine खुराक हर 8-12 घंटे दोहराएँ.

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Representative Results

चित्रा 3 एक चमड़े के नीचे मानव एचसीसी xenograft और ट्यूमर की इसी histopathological उपस्थिति की विशिष्ट उपस्थिति को दर्शाता है. चमड़े के नीचे xenografts के विकास और वृद्धि तत्काल प्राप्तकर्ता चूहों की दैनिक परीक्षा द्वारा नजर रखी जा सकती है. एक ट्यूमर का xenografting और विकास के बीच समय अंतराल (ऊतक के प्रकार (सेल निलंबन बनाम ट्यूमर टुकड़ा), ऊतक के स्रोत (प्राथमिक रोगी नमूना, passaged xenograft, या सेल लाइन), और प्रत्यारोपित ऊतक की मात्रा के आधार पर बहुत भिन्न हो सकते हैं कोशिकाओं की संख्या या ट्यूमर टुकड़ा के आकार). 6 महीने प्राप्त 1 x 10 5 कोशिकाओं से एक समान xenograft के विकास के लिए आवश्यक हो सकता है, जबकि उदाहरण के लिए, बड़े आकार का xenografts, 1-2 हफ्तों के भीतर एक अच्छी तरह से स्थापित एचसीसी सेल लाइन के 5 x 10 6 कोशिकाओं के इंजेक्शन से विकास हो सकता है एक प्राथमिक रोगी एचसीसी नमूना से. हम implantatio के बाद 6 महीने की तुलना में बाद में चमड़े के नीचे xenograft गठन नहीं मनाया हैट्यूमर का नमूना के एन, और xenografts विकसित नहीं किया है, इस प्रकार यह timepoint पर प्राप्तकर्ता चूहों बलिदान.

चित्रा 4 जिगर में ट्यूमर के ऊतक के प्रत्यक्ष आरोपण से हासिल intrahepatic मानव एचसीसी xenografts के ठेठ दिखावे को दर्शाता है के रूप में अच्छी तरह से तिल्ली में ट्यूमर कोशिकाओं के इंजेक्शन से हासिल की हैं. ट्यूमर बहुत बड़ी है या जलोदर या पेट फैलावट के विकास में हुई है, जब तक Intrahepatic xenografts आसानी प्राप्तकर्ता माउस के सामान्य शारीरिक परीक्षा से नहीं पाया जा सकता है. ऐसे सीटी स्कैन के रूप में छोटे पशु इमेजिंग रूपात्मकता कुछ शोध संस्थानों में उपलब्ध हैं और सही प्राप्तकर्ता चूहों 11 के जिगर से पूछताछ करने के लिए उपयोग किया जा सकता है, हम इस सबसे जांचकर्ताओं के लिए एक व्यापक रूप से लागू व्यावहारिक, या लागत प्रभावी दृष्टिकोण पर विचार नहीं है. हम intrahepatic xenografts का विकास दर है जिस पर subcutaneo जिस दर पर करने के लिए इसी तरह की है कि मनायाहमें विकसित Xenografts, और इसी तरह के प्रकार, स्रोत, और प्रत्यारोपित ऊतक की मात्रा के रूप में चर से प्रभावित है. एक बड़े intrahepatic ट्यूमर के स्पष्ट सबूत यह पहले से मौजूद है, जब तक intrahepatic xenografts के लिए इस्तेमाल किया है कि के रूप में एक ही माता पिता के ऊतकों से निकाली गई उपचर्म xenografts के प्रदर्शन के आधार पर हम प्राप्तकर्ता माउस और जिगर की परीक्षा के बलिदान के लिए एक timepoint का चयन करें. हम प्रयोग किया जाता intrahepatic xenografting प्रक्रिया के लिए एक आंशिक hepatectomy के अलावा माउस जिगर में मानव ट्यूमर के ऊतक के engraftment को प्राप्त करने की संभावना को बेहतर बनाता है, लेकिन xenograft विकास की दर को तेज करने के लिए नहीं लगता है कि देखा है.

तालिका 1 इस प्रोटोकॉल में वर्णित विभिन्न तकनीकों का उपयोग immunodeficient चूहों में प्राथमिक मानव एचसीसी ऊतकों के आरोपण के बाद हासिल ट्यूमर engraftment दरों का सार. प्रत्येक आरोपण विधि के लिए, ट्यूमर ले दर का हर एक अद्वितीय गुंजन को दर्शाता है एक एचसीसी नमूना. इन आंकड़ों प्राथमिक मानव एचसीसी ऊतकों के लिए, चमड़े के नीचे engraftment दरों intrasplenic ट्यूमर सेल इंजेक्शन या intrahepatic ट्यूमर टुकड़ा आरोपण द्वारा प्राप्त intrahepatic engraftment की दरों को नीचा कर रहे हैं, को दिखाना है कि, और कहा कि आंशिक hepatectomy intrahepatic engraftment बढ़ाने के लिए प्रकट होता है. हम सफलतापूर्वक अच्छी तरह से स्थापित मानव एचसीसी सेल लाइनों (नहीं दिखाया डेटा) से intrahepatic xenografts उत्पन्न करने के लिए माउस जिगर में प्रत्यक्ष सेल इंजेक्शन का उपयोग किया है, यद्यपि हम आंशिक hepatectomy के उपयोग के बावजूद प्राथमिक मानव एचसीसी नमूनों का उपयोग इस विधि के साथ किसी भी intrahepatic xenografts उत्पन्न नहीं है .

चित्रा 1
चित्रा 1. प्रसंस्करण और एचसीसी नमूना की तैयारी के साथ ही बाद में xenografting विकल्प (इनसेट) के लिए कार्यप्रवाह illustrating प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध सिंहावलोकन.

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चित्रा 2. Hepatocellular कार्सिनोमा के साथ एक रोगी से जिगर लकीर नमूना. इस मरीज ​​के ट्यूमर के लिए किसी भी सहायक चिकित्सा प्राप्त नहीं हुआ था. व्हाइट बॉक्स xenografting के लिए प्राप्त हुई थी जो परिधि के पास ट्यूमर का एक व्यावहारिक हिस्से को इंगित करता है. शीर्ष सही पर स्केल बार 1 सेमी से मेल खाती है.

चित्रा 3
चित्रा 3. ट्यूमर कोशिकाओं के चमड़े के नीचे इंजेक्शन से उत्पन्न मानव hepatocellular कार्सिनोमा xenograft. ए) ट्यूमर को आसानी से ट्यूमर पशु त्याग के बाद आसपास के ऊतकों से अलग देखा जा रहा है जानवर. बी) के सही दिशा में सराहना की जा सकती. सी) ट्यूमर के ऊतक विज्ञान परमाणु atypia और उच्च परमाणु से cytoplasmic अनुपात, पोर्टल इलाकों के अभाव, और जिले के साथ hepatocyte की तरह कोशिकाओं सहित hepatocellular कार्सिनोमा के विशिष्ट सुविधाओं को दर्शाता हैhepatocellular प्लेटों की वृद्धि की मोटाई के साथ orted trabeculae. स्केल बार 1 पैनल ए में सेमी और बी, और पैनल सी में 100 माइक्रोन से मेल खाती है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
चित्रा 4. Intrahepatic मानव hepatocellular कार्सिनोमा xenografts. माउस जिगर में एक मानव ट्यूमर टुकड़ा के आरोपण से उत्पन्न) xenograft. Intraparenchymal ट्यूमर काला तीर द्वारा संकेत दिया. आंशिक hepatectomy निम्नलिखित माउस तिल्ली में मानव ट्यूमर कोशिकाओं के इंजेक्शन से उत्पन्न सेमी. बी) xenograft में तस्वीर के तल पर शासक की स्केल. Intraparenchymal ट्यूमर काला तीर द्वारा संकेत दिया. स्केल बार 1 सेमी से मेल खाती है. सी) प्रोटोकॉल अनुभाग intrahepatic xenograft demonstrat के मार्जिन के माध्यम से(ठीक नीचे) मानव hepatocellular कार्सिनोमा और आसन्न सामान्य माउस जिगर (ऊपर बाएं) के विशिष्ट सुविधाओं आईएनजी. स्केल बार 100 माइक्रोन से मेल खाती है. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें .

आरोपण साइट आरोपण विधि ट्यूमर दर ले
त्वचा के नीचे सेल निलंबन 6/55 (10.9%)
ट्यूमर टुकड़ा 23/136 (16.9%)
तिल्ली सेल निलंबन 3/15 (20%) *
सेल निलंबन + आंशिक hepatectomy 6/14 (42.9%) *
जिगर ट्यूमर टुकड़ा 6/13 (46.2%)
ट्यूमर टुकड़ा + आंशिक hepatectomy 2/3 (66.7%)
सेल निलंबन प्रदर्शन नहीं
सेल निलंबन + आंशिक hepatectomy 0/8 (0%)
* Intrahepatic ट्यूमर पिंड झुकेंगे कि नमूने के अनुपात

तालिका 1. विभिन्न आरोपण तकनीक को इसी immunodeficient चूहों में मानव एचसीसी engraftment दरों.

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Discussion

हम प्रयोगात्मक प्रश्नों और assays की एक विस्तृत विविधता के लिए लागू किया जा सकता है कि immunodeficient चूहों में चमड़े के नीचे और intrahepatic मानव एचसीसी xenografts की स्थापना के लिए विभिन्न तकनीकों का वर्णन किया है. चमड़े के नीचे xenografts व्यापक रूप से एचसीसी जीव विज्ञान के विभिन्न पहलुओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, intrahepatic xenografts शायद ही कभी साहित्य में वर्णित हैं. इसके अलावा, xenografts के उपयोग का वर्णन पढ़ाई के बहुमत अच्छी तरह से स्थापित सेल लाइनों से इन उत्पन्न किया है. मानव ट्यूमर जीव विज्ञान 12 मॉडलिंग में कैंसर कोशिका लाइनों की सीमाओं को देखते हुए, हम प्राथमिक मानव एचसीसी ऊतकों का उपयोग करके उपरोक्त वर्णित तकनीकों को मान्य करने के लिए प्रेरित किया गया है. कारण प्रयोगात्मक समूहों का छोटा सा नमूना आकार के लिए सांख्यिकीय विश्लेषण के द्वारा समर्थित नहीं है, हमारी टिप्पणियों आत्मगत ट्यूमर कोशिकाओं या टुकड़े के intrahepatic दाखिल करने से आंशिक hepatectomy के अलावा के साथ सुधार engraftment दरों की दिशा में एक सम्मोहक की प्रवृत्ति का पता चलता है. </ P>

कड़ाई से प्राथमिक ऊतकों का उपयोग करने का प्रयास किया है, जो कुछ अध्ययनों 13-15 प्राप्त मरीज ​​के नमूनों की केवल एक बहुत छोटे से अनुपात के साथ सफल चमड़े के नीचे engraftment हासिल किया है. हम भी सफलतापूर्वक ऊपर वर्णित तकनीकों का उपयोग immunodeficient चूहों के चमड़े के नीचे अंतरिक्ष में मिला देना कि प्राथमिक मानव एचसीसी नमूनों का अनुपात लगभग 15% तक सीमित है कि मनाया है. मानव जिगर में, एचसीसी घावों यकृत धमनी 16,17 के माध्यम से मुख्य रूप से उनके रक्त की आपूर्ति प्राप्त करने, hypervascular हैं. हम और दूसरों को देखा है कि प्राथमिक एचसीसी ऊतकों की कम engraftment दर वे स्थापित धमनी की आपूर्ति के बिना, xenografted हैं जिसमें microenvironment के सापेक्ष हाइपोक्सिया के लिए ताजा एचसीसी ऊतकों की असुरक्षा की वजह से हो सकता है कि अटकलें. शल्य लकीर और xenografting के बीच के अंतराल में तेजी से इस्कीमिक परिगलन के लिए एचसीसी के ऊतकों की संवेदनशीलता भी accou सकता हैचूहों में हासिल की कम engraftment दर के लिए NT.

ट्यूमर सेल निलंबन से intrahepatic मानव एचसीसी xenografts की पीढ़ी के लिए, हम तिल्ली में कोशिकाओं के इंजेक्शन प्राथमिक मानव एचसीसी नमूनों से जिगर engraftment की बेहतर दरों में यह परिणाम है कि एक तकनीकी रूप से अनुकूल दृष्टिकोण है कि मिल गया है. तिल्ली बेहतर माउस शरीर में अन्य साइटों की तुलना में एचसीसी कोशिकाओं का समर्थन कर सकते हैं जो एक अत्यधिक vascularized संरचना है, और ट्यूमर कोशिकाओं को आसानी से प्लीहा और पोर्टल नसों के माध्यम से जिगर में यात्रा करने के लिए दिखाई देते हैं, जहां से. यह सीधे रिसाव या नकसीर बिना कोशिकाओं इंजेक्षन करने के लिए तकनीकी रूप से कठिन है जो में जिगर पैरेन्काइमा, साथ इसकी तुलना में, तिल्ली इंजेक्शन है कि सेल निलंबन की मात्रा को समायोजित करने के लिए संरचनात्मक क्षमता है, और आसानी से ligated जा सकता है एक बार ट्यूमर सेल इंजेक्शन पूरा हो गया है. सीधे 6-8 सप्ताह पुराने चूहों में पोर्टल शिरा या यकृत धमनी में सेल निलंबन इंजेक्शन तकनीकी रूप से FeAs नहीं हैible.

हम मानव एचसीसी ऊतकों की intrahepatic engraftment की सुविधा के लिए प्राप्तकर्ता चूहों में आंशिक hepatectomy का उपयोग किया है. आंशिक hepatectomy के माउस मॉडल व्यापक रूप से जिगर पुनर्जनन 18 की जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, हम intrahepatic ट्यूमर xenotransplantation साथ संयोजन में यह वर्णन किसी भी रिपोर्ट की जानकारी नहीं है. जिगर उत्थान आंशिक hepatectomy के बाद पहले कुछ दिनों में तेजी से होता है, हम जिगर पैरेन्काइमा भीतर mitogenic और वाहिकाजनक उत्तेजनाओं की बहुत बढ़ाया अभिव्यक्ति बेहतर के शेष भाग में प्रत्यारोपित कमजोर मानव ट्यूमर के ऊतक या कोशिकाओं के engraftment और प्रसार का समर्थन करेगी कि अनुमान लगाया माउस जिगर अपने "विश्राम" राज्य के 19 में एक माउस जिगर के साथ तुलना में. मनुष्यों में एचसीसी के विकास के लिए सबसे बड़ा जोखिम कारक बेतरतीब पुनर्योजी नहीं की विकास की विशेषता है जो जिगर तंतुमयता या सिरोसिस, उन्नत हैdules, और जो जीर्ण जिगर की चोट और उत्थान 20 के एक राज्य के रूप में कुछ लोगों द्वारा की अवधारणा किया गया है. हम जिगर उत्थान सक्रिय द्वारा माउस जिगर में मानव एचसीसी ऊतकों टीका लगाना करने के लिए प्रदर्शन किया है कि तकनीक एचसीसी के pathophysiology में यकृत microenvironment और जिगर पुनर्योजी तंत्र की भूमिका की जांच की अनुमति के लिए एक मूल्यवान मॉडल साबित हो सकता है.

यहाँ बताया तकनीक immunodeficient चूहों में उच्च गुणवत्ता प्राथमिक मानव एचसीसी xenografts पैदा करने में सक्षम हो रहे हैं, इन प्रोटोकॉल का उपयोग पर विचार जांचकर्ताओं मॉडल की कुछ सीमाएं विचार करना चाहिए. सबसे पहले, हमारे प्रोटोकॉल अभी तक एक चुनौती बनी हुई है उच्च engraftment दर को प्राप्त करने के लिए रोगी के ऊतकों की शल्य लकीर और प्रयोगशाला में इसके बाद के प्रसंस्करण के बीच कम से कम देरी शामिल है, यह इन तकनीकों का व्यवहार्य कार्यान्वयन के लिए मरीज के ऊतकों संग्रह साइट की निकटता की आवश्यकता है कि पता चलता हैताजा नमूनों के हस्तांतरण में देरी को कम कर सकते हैं कि प्रयोगशाला, या बुनियादी सुविधाओं. Xenografts फार्म से पहले दूसरा, 6-8 सप्ताह पुराने immunodeficient चूहों पर जटिल intraabdominal सर्जिकल प्रक्रियाओं के कई महीनों के लिए पशुओं के अस्तित्व को प्राप्त करने के क्रम में समुचित रूप से प्रशिक्षित कर्मियों द्वारा किया जाना चाहिए, इन प्रक्रियाओं और बाद में जानवरों की देखभाल समय दोनों कर रहे हैं और गहन संसाधन. तीसरा, intrahepatic xenografts के विकास और प्रगति के लिए आसानी से ऊपर उल्लिखित के रूप में assays के कुछ प्रकार के लिए इस स्थान में xenografts की उपयोगिता सीमित पूर्व निर्धारित timepoints पर जानवरों के त्याग के बिना नजर रखी जा नहीं सकते हैं. इसके अलावा, तिल्ली में कोशिकाओं के इंजेक्शन से ली गई intrahepatic xenografts ठीक कुल ट्यूमर बोझ के संदर्भ में अंदाजा लगाना मुश्किल है कि जिगर पैरेन्काइमा भर में बिखरे हुए के रूप में कई पिंड मौजूद हो सकता है. अंत में, यह तिल्ली में कोशिकाओं के इंजेक्शन से उत्पन्न intrahepatic ट्यूमर पिंड का चयन कर सकते हैं महत्वपूर्ण हैively जिगर और बाद में ट्यूमर दीक्षा के लिए तिल्ली से पलायन करने में सक्षम हैं कि कोशिकाओं के विशिष्ट subpopulations दर्शाते हैं.

प्राथमिक मानव एचसीसी ऊतकों से xenografts पैदा करते हैं, तो यह परिणामस्वरूप xenografts एचसीसी जैसे लगते हैं, इसकी पुष्टि करने के लिए भी महत्वपूर्ण है. हम पहले से lymphomas अनजाने xenotransplanted मानव एचसीसी ऊतकों 21 भीतर यात्री leukocytes से विकसित कर सकते हैं कि प्रदर्शन किया है. हम इस प्रकार नियमित प्राथमिक ट्यूमर सेल निलंबन से मानव CD45 + leukocytes गिरेगा और आरटी पीसीआर का उपयोग, cytometry, histopathological मूल्यांकन प्रवाह, और एचसीसी के विशिष्ट विशेषताओं के लिए xenografts परख immunohistochemistry. आगे के अध्ययन के लिए स्थापित xenografts passaging, जब ट्यूमर घुसपैठ murine कोशिकाओं को भी माउस उतक अनुरूपता प्रतिजन H2k के खिलाफ एक एंटीबॉडी का उपयोग कर समाप्त हो जाना चाहिए. अनुसंधान आवेदन ट्यूमर के टुकड़े का उपयोग करें या xenograft विकास की माप, xenogra का विश्लेषण शामिल हैंअध्ययन समापन बिंदु पर FTS ट्यूमर मानव leukocytes और चूहे की कोशिकाओं से घुसपैठ कर रहे हैं जो करने के लिए डिग्री के एक आकलन में शामिल करना चाहिए.

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Disclosures

लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषित.

Acknowledgments

इस काम के स्वास्थ्य अनुसंधान चरण 1 clinician के वैज्ञानिक पुरस्कार (एजी) के एक कनाडाई संस्थानों और कैंसर रिसर्च सोसायटी (एजी) से एक ऑपरेटिंग अनुदान द्वारा समर्थित किया गया. लेखक इस परियोजना के अपने समर्थन के लिए डॉ. जॉन डिक के लिए आभारी हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco’s Mod. Eagle Medium/Ham’s F12 50/50 Mix x1(DMEM-F12) WISENT Bioproducts 319-075-CL
Collagenase TypeIV Sigma-Aldrich C5138
Dispase II Stemcell Technologies 7923
Matrigel Matrix Becton-Dickinson Biosciences 354234
10 % Buffered Formalin solution Sigma-Aldrich HT501128
0.9 % Saline Solution (NaCl), sterile House Brand 1011-L8001
Betadine surgical scrub Purdue Pharma NPN 00158313
Buprenorphine (Temegesic) NR 0.3 mg/ml Reckitt Benckiser
Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic Pharmaceutical Partners of Canada Inc. M60302
Tear-Gel Novartis Pharmaceuticals
Frozen section compound VWR 95057-838
Cryomold, Tissue -Tek Sakura Finetek 4566
Precision Glide Needle 18G 1 ½ Becton-Dickinson Biosciences 305196
Precision Glide Needle 27G ½ Becton-Dickinson Biosciences 305109
Insulin syringe, 3/10 cc U-100, 29G½ Becton-Dickinson Biosciences 309301
Surgical blade No.10 Feather Safety Razor Co. 08-916-5A
#5-0 Soft silk surgical suture, 3/8" taper point needle Syneture VS-880
Transpore surgical tape 3M Health care 1577-1
Cotton applicator Medpro 018-425
Surgicel, oxidized regenerated cellulose Ethicon 1951
Cell strainer 100 μm nylon Becton-Dickinson Biosciences 352360
Magnification lighting with mobile base Benson medical Industries Inc. model: RLM-CLT-120V
Petridish sterile 100x20 mm Sarstedt 821474
Tissue forcep, 1x2 teeth, 4-1/2" Almedic A10-302
Adson dressing forcep 4-3/4" Almedic A10-220
Eye dressing forcep, serrated, straight, 4" Almedic A19-560
Hartman Hemostatic Forceps, curved, 3-1/2" Almedic A12-142
Iris scissor, curved, 4-1/4" Almedic A8-690
Iris scissor, straight, 4-1/2" Almedic A8-684
Olsen-Hegan needle driver, 5-1/2" Almedic A17-228

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References

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Ahmed, S. U., Zair, M., Chen, K., Iu, M., He, F., Adeyi, O., Cleary, S. P., Ghanekar, A. Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice. J. Vis. Exp. (79), e50544, doi:10.3791/50544 (2013).

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