Summary
Tumores humanos transplantados em ratos imunodeficientes são ferramentas valiosas para o estudo da biologia do câncer. Protocolos específicos para gerar xenoenxertos subcutâneos e intra-hepáticos a partir de células de carcinoma hepatocelular humano ou fragmentos do tumor são descritos. A regeneração hepática induzida por hepatectomia parcial em ratos destinatário é apresentado como uma estratégia para facilitar o enxerto intra-hepática.
Abstract
In vivo modelos experimentais de carcinoma hepatocelular (HCC) que recapitulam a doença humana fornecer uma plataforma valiosa para a pesquisa em fisiopatologia da doença e para a avaliação pré-clínica de novas terapias. Nós apresentamos uma variedade de métodos para gerar subcutânea ou ortotópicos xenoenxertos de carcinoma hepatocelular humano em ratinhos imunodeficientes que pode ser utilizado em uma variedade de aplicações de pesquisa. Com um foco sobre o uso de tecido do tumor primário de pacientes submetidos à ressecção cirúrgica como ponto de partida, descrevemos a preparação de suspensões de células ou fragmentos tumorais para xeno. Descrevemos as técnicas específicas para estes tecidos de xenoenxerto i) por via subcutânea, ou ii) intrahepatically, quer por implantação directa de células tumorais ou fragmentos para o fígado, ou indirectamente através de injecção de células no baço do rato. Os requerentes também descrevem a utilização de ressecção parcial do fígado nativo do rato na altura do xeno-enxerto como uma estratégia parainduzir um estado de regeneração hepática ativa no rato destinatário que pode facilitar o enxerto intra-hepática de células tumorais humanas primárias. Os resultados esperados destas técnicas são ilustradas. Os protocolos descritos foram validados utilizando amostras HCC humanos primário e xenotransplantes, que normalmente executam menos robusta do que as linhas de células de carcinoma hepatocelular humano bem estabelecidas que são amplamente utilizados e freqüentemente citados na literatura. Em comparação com linhagens de células, discutimos os fatores que podem contribuir para a relativamente baixa chance de enxerto HCC primário em modelos de xenotransplante e comentar sobre as questões técnicas que podem influenciar a cinética de crescimento de xenotransplante. Sugerimos também os métodos que devem ser aplicados para garantir que xenografts obtidos assemelham-se com precisão os tecidos HCC-pai.
Introduction
O carcinoma hepatocelular (HCC) é o quinto tipo de câncer mais comum no mundo eo mais rapidamente crescente causa de morte por câncer na América do Norte. O fator de risco mais prevalente para HCC é a cirrose hepática, ocorrendo com mais freqüência devido a hepatite crônica viral, abuso de álcool, doença auto-imune, ou distúrbios metabólicos hereditários 1.
Apesar da carga de doença pesada imposta pelo HCC em populações em todo o mundo, a fisiopatologia da HCC é relativamente mal entendido em comparação a outros cânceres comuns como colorretal, de mama ou câncer de próstata. Por exemplo, os eventos moleculares e celulares específicos tumorigenesis condução continuam a ser claramente definidas 2. Como a maioria dos cancros epiteliais sólidos, abordagens genómicas revelaram heterogeneidade nas aberrações associadas com HCC 3. Um certo número de estudos revelaram actividade desordenado de uma variedade de vias de sinalização envolvidos na proliferação celular, survência, diferenciação, e angiogénese 4. Além disso, o papel de células estaminais de cancro no HCC pathobiology ser esclarecido 5.
Com uma compreensão limitada do HCC fisiopatologia, o arsenal de terapias eficazes para HCC também se manteve relativamente limitada. Pacientes em início de carreira com tumores confinados ao fígado são candidatos à terapia curativa com ablação do tumor ou ressecção cirúrgica, embora a recorrência é comum. Para pacientes com doença mais avançada, a quimioterapia ea radioterapia são de eficácia limitada e são usados principalmente para o controle da doença com intenção paliativa 6.
Alta qualidade in vivo modelos experimentais de HCC humana fornecer, assim, uma plataforma valiosa para a pesquisa básica muito necessária para a fisiopatologia da HCC humana, bem como para a avaliação de novas abordagens terapêuticas. Em comparação com a utilização de linhas celulares ou em modelos de rato altamente definidos, xenoenxertos de pritumores Maria humana em ratinhos imunodeficientes surgiram como ferramentas valiosas para tais estudos, uma vez que são capazes de recapitular a doença humana com alta fidelidade reflectindo também a heterogeneidade que se encontra presente no interior e entre os diferentes pacientes 7,8. Para este fim, temos desenvolvido uma variedade de métodos para estabelecer xenoenxertos de carcinoma hepatocelular humano em ratinhos imunodeficientes. Enquanto a maioria dos estudos publicados envolvendo xenografts HCC descrever o uso de linhas de células de carcinoma hepatocelular humano bem estabelecidas para esse fim, temos focado na otimização de nossos ensaios para gerar xenografts de espécimes HCC primários obtidos imediatamente após a ressecção cirúrgica de pacientes.
Podem ser necessárias técnicas xeno diferentes para aplicações diferentes de pesquisa. Por exemplo, xenoenxertos subcutâneos gerados a partir de fragmentos de tumor são geradas rapidamente, são facilmente monitorizados, podendo ser mais apropriado para a administração local de novas terapias com convenientemonitoramento da resposta do tumor. Xenoenxertos intrahepáticos podem ser mais relevantes para os estudos relacionados com o papel do microambiente hepática em biologia HCC. Xenoenxertos gerados a partir de suspensões de células tumorais são necessários para a identificação e caracterização de subconjuntos de células de iniciação do tumor ou para experiências que requerem a manipulação in vitro de células tumorais antes de xenotransplante. Assim, temos desenvolvido e validado os seguintes protocolos para estabelecer subcutânea ou intra-hepáticos a partir de xenoenxertos de suspensões de células ou fragmentos de tumores derivados das amostras de carcinoma hepatocelular humano primárias.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Uma visão geral esquemática do protocolo é apresentado na Figura 1.
1. Processamento das Amostras HCC Humano
Obter espécimes HCC humana primárias com o consentimento do paciente por escrito e com a aprovação do conselho de ética em pesquisa institucional. Estes protocolos têm sido realizados em nossa instituição com a aprovação do Conselho de Ética de Pesquisa University Health Network, em conformidade com todas as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano.
Coletar amostras de CHC frescos o mais rápido possível após o procedimento cirúrgico, uma vez amostras adequadas sejam tomadas para fins clínicos. Idealmente, esta deverá ter lugar dentro de 30 minutos após a retirada do tecido do paciente. Tal como ilustrado na Figura 2, uma amostra de, pelo menos, 1 cm 3 obtidos a partir da periferia do tumor é o ideal, como a parte central do tumor pode ser necrótico.Os tumores que não receberam qualquer tratamento antes de ressecção tais como a radiação, quimioterapia, ou ablação são preferidos, a fim de maximizar a probabilidade de que as células tumorais são viáveis. Lidar com tecidos humanos primários, de acordo com os protocolos de proteção individual padrão para material de risco biológico. Realize todas as manipulações laboratoriais de tecidos tumorais e preparações de células em uma cabine de segurança biológica classe II usando técnicas assépticas.
- Colocar a amostra HCC fresco em 10-25 ml Modified Eagle Médium F12 / 's Ham de Dulbecco isento de soro, a 4 ° C e transferir em gelo para o laboratório para processamento imediato e preparação de fragmentos de tecidos e / ou células de xeno-enxerto em ratinhos.
- Utilizando fórceps estéreis, colocar a amostra de tumor em 100 mm x 20 mm numa caixa de Petri ou outra superfície de trabalho estéril adequado. Dividir a amostra tumoral em fragmentos de cerca de 2-3 mm 3, usando uma lâmina de bisturi cirúrgico No.10. Neste ponto, considere o snap-congelamento ou de fixação de formalina some fragmentos do tumor para outros experimentos ou análises, conforme necessário.
- Para fragmentos de tumor de xeno-enxerto, colocar alguns dos fragmentos de HCC em um ou mais tubos de microcentrífuga contendo Matrigel suficiente para permitir que os fragmentos de permanecer submerso. Mantenha estes tubos no gelo.
- Para a preparação de uma suspensão de células de tumor, utilizar a lâmina de bisturi cirúrgico para picar o tecido HCC remanescente tanto quanto possível e misturar-se com 5-10 ml de DMEM-F12 em um tubo de 50 ml, dependendo do volume do tecido moído.
- Adicionar colagenase tipo IV e dispase II a concentrações finais de 200 unidades / ml e 0,8 unidades / ml, respectivamente. Pipeta a mistura para cima e para baixo bem com uma pipeta de 25 ml.
- Veda-se o tubo e incubar a mistura a partir do passo 1.6 a 37 ° C numa incubadora de dióxido de carbono a 5% durante 30-60 minutos, dependendo da suavidade do tecido do tumor. Pipeta a mistura para cima e para baixo algumas vezes a cada 10 minutos para avaliar o progresso da digestão enzimática.
- Depois de digestion estiver concluída, passar a solução tumor através de um filtro de células 100 m. Suavemente triturar o tecido remanescente no filtro celular utilizando uma ponta de pipeta de 25 ml, ao permitir que o número máximo de células tumorais para passar. Coletar a suspensão de células tensas em um tubo cônico de 15 ml.
- Centrifugar a suspensão de células do tumor a 1.200 rpm durante 5 min a 4 ° C.
- Delicadamente, decantar o sobrenadante. Dependendo do tamanho da pílula, adicionar 2-5 mL de gelo frio 1x de glóbulos vermelhos (RBC) de tampão de lise e suavemente pipetar para cima e para baixo para ressuspender o sedimento. Mantenha no gelo por 5 min.
- Adicionar DMEM-F12 para um volume total de 15 ml e centrifugar a 1000 rpm durante 5 min a 4 ° C para lavar o tampão de lise dos glóbulos vermelhos.
- Delicadamente, decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento RBC-livre de células tumorais em DMEM-F12.
- Contar as células viáveis utilizando a exclusão de azul de tripano, manualmente ou com um contador de células automatizado.
- Alíquotas de células de tumor de centrífuga contendo o desejado number de células por injecção, tal como descrito acima, ressuspender o sedimento de células resultante em 30 mL de gelo-Matrigel frio, e armazenar em gelo.
Opcional: Depois do passo 1.11, rotineiramente depleção das células humanas CD45 + (leucócitos) a partir da suspensão de células de tumor em massa e / ou purificar os subconjuntos de células tumorais utilizando a citometria de fluxo ou esferas imunomagnéticas. Os protocolos detalhados para estas técnicas são bem descritos pelos fabricantes dos anticorpos relevantes, grânulos, e citómetros de fluxo.
Nota: O protocolo descrito acima podem também ser utilizadas para efectuar a xenoenxertos de tumores humanos colhidos a partir de ratinhos, a fim de realizar o transplante em série, substituindo o tecido de xenoenxerto para o tecido HCC humana primária no passo 1.1. Nesta situação, após o passo 1.11, rotineiramente esgotar células infiltrantes de murino a partir da suspensão das células usando um anticorpo contra o antigénio de rato histocompatibilidade H2K.
2.Xeno
Realizar todos os procedimentos com animais, em conformidade com os protocolos aprovados pelo Comitê de cuidados com os animais institucional. Os procedimentos aqui descritos foram cumpridos ao abrigo de algum Uso de Animais protocolo aprovado pelo Comitê Animal Care da University Health Network, nos termos e de conformidade com todas as agências relevantes regulatórios e institucionais, regulamentos e diretrizes.
Equipamentos para a entrega de agentes anestésicos voláteis inalatórios para animais de pequeno porte devem ser utilizados de acordo com os procedimentos operacionais padrão do biotério e instituto de pesquisa. Realizar todos os procedimentos cirúrgicos, utilizando técnica asséptica e instrumentos esterilizados em uma cabine de segurança biológica classe II. Utilizar não obesos imunodeficiência combinada severa diabético (NOD / SCID) ou NOD / SCID / interleucina 2 do receptor gama cadeia nulos (NSG) estirpes de ratinhos de ambos os sexos, em 6-8 semanas de idade (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) 9,10. Estescamundongos devem ser alojados e mantidos em um local capaz de proporcionar condições isentos de agentes patogénicos adequados para animais imunodeficientes.
Preparar para cirurgia ratos numa câmara fornecer a 5% (v / v) de isoflurano inalado em 1 L / min de oxigénio. Manter a anestesia até que haja perda de reflexo corneal e dedo do pé no animal (s). Para xeno subcutânea, raspar uma ou mais pequenas áreas no dorso do animal (s) e limpar a pele com etanol a 70%. Para xeno intra-hepática, raspar o tórax e abdômen ventral do animal (s) a partir da axila até a região inguinal e limpar a pele com etanol 70%.
2.1 implante subcutâneo de fragmentos do tumor
- Colocar o rato anestesiado deitado, mantém a anestesia por inalação de isoflurano (2% (v / v) em 1 L / min de O2) com um bocal. Aplicar Tear-Gel para proteger os olhos do animal de lesão traumática.
- Esterilizar a zona dorsal rapada (s) com Betadinelimpeza cirúrgica seguido de etanol a 70% e por fim com uma solução de povidona-iodo.
- Faça uma incisão na pele 5 milímetros usando uma tesoura afiada estéreis.
- Inserir uma tesoura sem corte fechou suavemente no espaço subcutâneo e espalhar com cuidado para desenvolver um bolso grande o suficiente para acomodar um fragmento de tumor.
- Insira o fragmento de tumor preparada no passo 1.3 na bolsa subcutânea usando uma pinça fina estéreis.
- Feche a incisão na pele com suturas ou grampos.
- Prestar cuidados no pós-operatório para o mouse, conforme descrito abaixo.
2.2 A injecção subcutânea de células tumorais
- Prepare o animal conforme descrito nos passos 2.1.1 e 2.1.2.
- Carregar a suspensão de células de tumor em Matrigel preparados no passo 1.13 a uma seringa de insulina com uma 29 G 1/2 em agulha.
- Inserir a agulha no espaço subcutâneo e descarregar o conteúdo da seringa. Avançando a agulha alguns milímetros ao longo do plano subcutâneo distância from o local da punção da pele impede a fuga de suspensão de células do tumor para fora do local da punção após a retirada da agulha.
- Prestar cuidados no pós-operatório para o mouse, conforme descrito abaixo.
2.3 Implantação de fragmentos do tumor intra-hepática
- Usando um 27 G 1/2 na agulha em uma seringa de 1 ml, administrar 350 mL de estéril por via subcutânea normal de solução salina no dorso do pescoço do animal anestesiado para compensar as perdas de fluido intra-operatórias. Para analgesia, administrar 350 ul de solução salina estéril normal contendo buprenorfina (0,1 mg / kg) por via subcutânea no flanco do animal, usando um 1/2-in agulha 27 G e seringa de 1 ml.
- Colocar o rato supina sobre um tapete de pré-aquecida, com o nariz e a boca posicionado dentro do bocal para proporcionar manutenção da anestesia por inalação de isoflurano (2% (v / v) em 1 L / min de O2).
- Estenda as pernas e prenda-os com fita adesiva a superfície de operação para otimizar a exposição deabdômen ventral e tórax.
- Realize o procedimento em uma lente de aumento para otimizar a visualização.
- Esterilizar a pele rapada no abdómen e do tórax ventral com limpeza cirúrgica Betadine seguido de etanol a 70% e por fim com uma solução de povidona-iodo.
- Usando uma tesoura afiada estéreis, fazer uma incisão na pele subcostal bilateral transversal e dividir as camadas musculares para entrar na cavidade peritoneal para permitir a exposição adequada de todo o fígado.
- Coloque um ponto na pele acima do apêndice xifóide e prendê-lo para o bocal com fita adesiva, de modo a permitir uma melhor exposição do fígado e estruturas adjacentes.
- Use dois aplicadores com ponta de algodão adjacentes e posterior ao fígado para estabilizá-lo.
- Fazer uma incisão de 3 mm de comprimento e profundidade na superfície do fígado usando uma lâmina de bisturi número 10 estéril.
- Aplique imediatamente Surgicel e pressão suave para o local da incisão para alcançar a hemostasia; remover após 60-90 sege prosseguir somente se a hemostasia completa foi alcançada.
- Coloque um fragmento de tumor passo 1.3 na incisão do fígado com uma pinça fina estéreis ou com uma agulha de 18 G.
- Aplicar um pequeno pedaço de Surgicel sobre a incisão no fígado para impedir o deslocamento do fragmento de tumor e garantir a hemostase continuação.
- Feche a incisão com suturas ou grampos.
- Prestar cuidados no pós-operatório, conforme descrito abaixo
2.4 Implantação intra-hepática de células tumorais através de injecção directa no fígado
- Prepare o mouse como descrito nos passos 2.3.1 a 2.3.7 supra.
- Carregar a suspensão de células tumorais (preparado no passo 1.13) para uma seringa de insulina usando um 29 G 1/2 em agulha.
- Com o fígado estabilizado usando um aplicador de algodão-ponta, insira a agulha de seringa de insulina no fígado e promover a ponta alguns milímetros fora do local da punção longo de um plano subcapsular.
- Suavemente descarregar o conteúdo da seringa e tuando remover a agulha do fígado.
- Local Surgicel sobre o local da punção e aplique uma leve pressão com um aplicador com ponta de algodão para evitar a fuga de suspensão de células do tumor e para alcançar a hemostasia completa.
- Feche a incisão com suturas ou clipes e fornecer cuidados pós-operatórios, conforme descrito abaixo.
2.5 xeno intra-hepática de células tumorais via injeção no Baço
- Prepare o mouse conforme descrito nos passos 2.3.1 a 2.3.5 supra.
- Usando uma tesoura afiada estéreis, fazer um 1 cm à esquerda incisão subcostal para entrar na cavidade peritoneal.
- Use um aplicador com ponta de algodão para refletir o estômago cranial e para o lado direito do animal, a fim de expor o baço.
- Ao manipular os tecidos adiposos circundantes com uma pinça atraumática finas estéreis, entregar o baço na incisão e colocar um aplicador com ponta de algodão atrás do baço para estabilizá-lo.
- Usando 5-0 fio de seda, lugarum nó pré-amarrado solto em torno do baço acima do pólo inferior.
- Carregar a suspensão de células tumorais (preparado no passo 1.13) para uma seringa de insulina usando um 29 G 1/2 em agulha.
- Insira a agulha de seringa de insulina para o pólo inferior do baço e avançá-lo passado, o nível do nó pré-amarrado solto.
- Descarregam-se lentamente o conteúdo da seringa, retirar a agulha do baço, e apertar o nó para evitar qualquer fuga da suspensão de células de tumor injectadas.
- Substituir o baço para a cavidade peritoneal.
- Feche a incisão com suturas ou clipes e fornecer cuidados pós-operatórios, conforme descrito abaixo.
2.6 hepatectomia parcial para Facilitar intra-hepática enxerto de tecido tumoral Humano
- Prepare o mouse conforme descrito nos passos 2.3.1 a 2.3.7.
- Com uma tesoura afiada estéreis, dividir o ligamento falciforme ligado ao lóbulo médio do fígado.
- Usando um aplicador com ponta de algodão, mobilizaro lobo esquerdo do fígado e a posição de um nó pré-atado solta de seda de sutura 5-0 em torno do lóbulo esquerdo. Avançar o nó frouxo o mais próximo possível para o pedículo Bilio-vascular do lobo esquerdo e apertar o nó.
- Extirpar o lóbulo esquerdo distal à ligadura com uma tesoura estéril, deixando um pequeno toco para evitar o deslizamento do nó e hemorragia subseqüente.
- Utilizando uma técnica similar, ligadura e ressecar a maioria do lóbulo médio do fígado, evitando a vesícula.
- Use Surgicel e uma leve pressão com um aplicador com ponta de algodão ao longo das superfícies de corte do parênquima hepático de hemostasia completa.
- Para xeno intra-hepática de um fragmento de tumor ou células de tumor, prosseguir com os passos 2.3.8 a 2.3.11 ou 2.4.2 a 2.4.5, tal como descrito acima.
- Para xeno intra-hepática de células tumorais através da injeção do baço, utilizam aplicadores com ponta de algodão para refletir cuidadosamente o estômago cranial e para o lado direito do animal, exposing do baço. Continuar com passos 2.5.4 a 2.5.9, tal como descrito acima.
- Feche a incisão com suturas ou clipes e fornecer cuidados pós-operatórios, conforme descrito abaixo.
2.7 Cuidados no pós-operatório
- Retire o mouse a partir do bocal anestesia inalatória.
- Posicione o mouse em uma gaiola sob uma lâmpada de calor por aproximadamente 20 min até a recuperação da anestesia e mobilizar plenamente.
- Repetir a dose de buprenorfina cada 8-12 horas durante os primeiros 2-3 dias pós-operatórios.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
A Figura 3 demonstra a aparência típica de um xenoenxerto de carcinoma hepatocelular humano por via subcutânea e a aparência histopatológica correspondente do tumor. O desenvolvimento e o crescimento de xenoenxertos subcutâneos pode ser prontamente monitorizada por análise diária de ratos receptores. O intervalo de tempo entre xeno e desenvolvimento de um tumor pode variar muito, dependendo do tipo de tecido (fragmento do tumor vs suspensão de células), a fonte de tecido (amostra primária paciente, xenoenxerto passados, ou linha de célula), e a quantidade de tecido implantado ( número de células ou o tamanho do fragmento do tumor). Por exemplo, xenoenxertos consideráveis podem desenvolver a partir da injecção de 5 x 10 6 de células de uma linha celular de carcinoma hepatocelular bem estabelecida dentro de 1-2 semanas, enquanto que 6 meses pode ser necessária para o desenvolvimento de um xenoenxerto semelhante a partir de 1 x 10 5 células obtidas a partir de uma amostra de paciente HCC primário. Não observamos formação de xenotransplante subcutânea depois de 6 meses após implantation da amostra do tumor, e assim sacrificar ratinhos receptores neste ponto de tempo se xenoenxertos não se desenvolveram.
A Figura 4 mostra as aparências típicos de intrahepáticos xenoenxertos de carcinoma hepatocelular humano obtidos a partir da implantação directa de tecido de tumor no fígado, bem à obtida pela injecção de células tumorais para o baço. Xenoenxertos intra-hepáticos não pode ser facilmente detectada por meio de exame físico geral do rato destinatário, a menos que o tumor é extremamente grande, ou tem como resultado o desenvolvimento de ascite ou distensão abdominal. Embora as modalidades de imagem pequenos animais, tais como tomografia computadorizada estão disponíveis em alguns institutos de pesquisa e poderia ser utilizada para interrogar com precisão o fígado de camundongos destinatário 11, não consideramos esta uma abordagem amplamente aplicável, prático, ou de baixo custo para a maioria dos investigadores. Temos observado que a taxa à qual xenoenxertos intra desenvolver é similar à velocidade à qual subcutáneonos xenoenxertos desenvolver, e é igualmente afetado por variáveis como o tipo, origem e quantidade de tecido implantado. Com base no comportamento de xenoenxertos subcutâneos derivados a partir do mesmo tecido pai que é utilizado para xenoenxertos intra-hepática, que seleccionar um ponto de tempo para o sacrifício do rato receptor e exame do fígado, a menos que uma evidência clara de um grande tumor intra-hepática está presente antes deste. Temos observado que a adição de uma hepatectomia parcial para o procedimento de xeno intra usado aumenta a probabilidade de obtenção de enxerto de tecido de tumor humano no fígado do rato, mas não parece acelerar a taxa de crescimento do xenoenxerto.
A tabela 1 resume as taxas de enxertia tumorais obtidos após a implantação de fragmentos de CCH humano primárias em camundongos imunodeficientes, utilizando as diferentes técnicas descritas neste protocolo. Para cada método de implantação, o denominador da taxa de take tumor reflete um zumbido único uma amostra de HCC. Estes dados demonstram que, para os tecidos de carcinoma hepatocelular humano primário, as taxas de enxertia subcutâneos são inferiores às taxas de enxerto intra-hepática alcançados pela injeção de células tumorais interna do baço ou intra-hepática implantação fragmento do tumor, e que hepatectomia parcial parece aumentar o enxerto intra-hepática. Embora nós utilizamos com sucesso a injecção directa em células do fígado do rato para gerar xenoenxertos intra-hepáticos a partir de linhas bem estabelecidos HCC humanas de células (dados não mostrados), que não geraram nenhum xenoenxertos intra-hepática com este método, utilizando amostras de HCC humanas primárias, apesar da utilização de uma hepatectomia parcial .
Figura 1. Visão esquemática do protocolo ilustrando fluxo de trabalho para o processamento e preparação de amostra HCC, bem como opções xeno subseqüentes (no detalhe).
544fig2.jpg "/>
Figura 2. Fígado espécime de ressecção de um paciente com carcinoma hepatocelular. Este paciente não recebeu nenhuma terapia adjuvante para o tumor. A caixa branca indica uma porção viável do tumor junto da periferia, que se obteve por xeno. Barra de escala no canto superior direito corresponde a 1 cm.
Figura 3. Hepatocelular humano Carcinoma xenoenxerto gerado a partir da injecção subcutânea de células tumorais. A) O tumor pode ser facilmente apreciado, no flanco direito do animal. B) O tumor é visto para ser distinta dos tecidos circundantes depois de sacrificar o animal. C) A histologia do tumor demonstra características típicas de carcinoma hepatocelular, incluindo as células de hepatócitos-like com atipia nuclear e relação núcleo-to-citoplasmática elevada, ausência de tratos portais e disttrabéculas orted com o aumento da espessura das placas hepatocelulares. Barra de escala corresponde a 1 cm de painéis A e B, e 100 mm no painel C. Clique aqui para ver maior figura .
Figura 4. Intrahepáticos xenoenxertos de carcinoma hepatocelular humano. UM) Xenoenxerto gerado a partir da implantação de um fragmento de tumor humano no fígado do rato. Tumor intraparenquimatosa indicado pela seta preta. Escala de régua na parte inferior da fotografia em B) Xenoenxerto cm. Gerado a partir da injeção de células tumorais humanas no baço do rato após hepatectomia parcial. Tumor intraparenquimatosa indicado pela seta preta. Barra de escala corresponde a 1 cm. Secção C) Histologia através margem de intrahepatic demonstrat xenoenxertoção características típicas de carcinoma hepatocelular humano (canto inferior direito) e ao lado de fígado de rato normal (superior esquerdo). Barra de escala corresponde a 100 mm. Clique aqui para ver maior figura .
| Implantação do Site | Método de implantação | Tumor Faça Taxa |
| subcutâneo | suspensão de células | 6/55 (10,9%) |
| fragmento de tumor | 23/136 (16,9%) | |
| baço | suspensão de células | 3/15 (20%) * |
| suspensão celular + hepatectomia parcial | 6/14 (42,9%) * | |
| fígado | fragmento de tumor | 6/13 (46,2%) |
| fragmento de tumor + hepatectomia parcial 2/3 (66,7%) | ||
| suspensão de células | não realizada | |
| suspensão celular + hepatectomia parcial | 0/8 (0%) | |
| * Proporção de amostras que renderam nódulos tumorais intra | ||
Tabela 1. Taxas de enxertia Humanos HCC em ratos imunodeficientes correspondentes a diferentes técnicas de implantação.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nós descrevemos uma variedade de técnicas para estabelecer subcutânea e intra xenoenxertos de carcinoma hepatocelular humano em ratinhos imunodeficientes que pode ser aplicado a uma ampla variedade de questões experimentais e ensaios. Enquanto xenoenxertos subcutâneos têm sido amplamente utilizados para o estudo de vários aspectos da biologia HCC, xenoenxertos intra raramente são descritos na literatura. Além disso, a maioria dos estudos que descrevem a utilização de xenoenxertos geraram estes a partir de linhas celulares bem estabelecidas. Dadas as limitações de linhas celulares de cancro em modelar a biologia do tumor humano 12, fomos motivados para validar as técnicas descritas acima, usando tecidos de carcinoma hepatocelular humano primários. Apesar de não ser apoiada por análise estatística devido ao pequeno tamanho das amostras dos grupos experimentais, as nossas observações subjetivamente revelar uma tendência irresistível para a melhoria das taxas de enxertia com a adição de hepatectomia parcial à implantação intra-hepática de células tumorais ou fragmentos. </ P>
Os poucos estudos que tenham rigorosamente tentaram utilizar tecidos primários têm conseguido enxerto subcutâneo sucesso com apenas uma pequena proporção das amostras de pacientes obtidos 13-15. Observamos, também, que a percentagem de amostras de HCC humanas primárias que enxertar com sucesso no espaço subcutâneo de ratos imunodeficientes, utilizando as técnicas descritas acima é limitada a aproximadamente 15%. No fígado humano, lesões HCC são hipervascular, recebendo seu suprimento de sangue predominantemente através da artéria hepática 16,17. Especula-se que a baixa taxa de enxerto de tecidos de carcinoma hepatocelular primário e que outros já observados podem ser o resultado da vulnerabilidade dos tecidos frescos para o HCC hipoxia relativa do micro-ambiente no qual eles são xenoenxertado, sem abastecimento arterial estabelecida. A susceptibilidade dos tecidos HCC a necrose isquêmica rápida no intervalo entre ressecção cirúrgica e xeno também pode ACCOUnt para a baixa taxa de enxerto obtida em ratinhos.
Para a geração dos intra-hepáticos xenoenxertos de carcinoma hepatocelular humano a partir de suspensões de células tumorais, verificou-se que a injecção de células no baço é uma abordagem técnica favorável que resulta em taxas superiores de enxerto a partir de amostras de fígado de HCC humanas primárias. O baço é uma estrutura altamente vascularizada que podem melhor apoiar as células de carcinoma hepatocelular, em comparação com outras partes do corpo do rato, ea partir do qual as células tumorais parecem facilmente viajar para o fígado através das veias do baço e do portal. Em comparação com o parênquima do fígado, no qual, é tecnicamente difícil de injectar directamente células sem fugas ou hemorragia, o baço tem a capacidade estrutural para acomodar o volume de suspensão de células, que é injectada, e pode ser facilmente ligado uma vez que a injecção de células tumorais está completo. A injecção de suspensão de células, directamente na veia portal ou artéria hepática em ratos com 6-8 semanas de idade não é tecnicamente feasvel.
Utilizamos hepatectomia parcial em ratos beneficiários para facilitar o enxerto intra-hepática dos tecidos HCC humanos. Embora modelos do rato da hepatectomia parcial têm sido amplamente utilizados para estudar a biologia da regeneração hepática 18, não temos conhecimento de quaisquer relatórios descrevendo-o em combinação com xenotransplante tumor intra-hepática. Uma vez que a regeneração do fígado ocorre rapidamente dentro dos primeiros dias seguintes hepatectomia parcial, especulamos que a expressão significativamente aumentada dos estímulos mitogénicos e angiogénicos dentro do parênquima hepático seria melhor suportar o enxerto e proliferação de tecido de tumor humano vulnerável ou células implantadas no interior da porção restante do o fígado do rato, em comparação com um fígado do rato no seu "descanso" estado 19. Nos seres humanos, o maior factor de risco para o desenvolvimento de carcinoma hepatocelular é avançada fibrose ou cirrose hepática, a qual é caracterizada pelo desenvolvimento de nenhuma regenerativa desorganizadodules, e que foi conceituado por alguns como um estado de lesão hepática crônica e regeneração 20. As técnicas que foram demonstrados para enxertar tecidos de carcinoma hepatocelular humano no fígado do rato, activando a regeneração do fígado pode vir a ser um modelo útil para permitir a investigação sobre o papel do microambiente hepática e fígado mecanismos regenerativos na patofisiologia da HCC.
Embora as técnicas aqui descritas são capazes de gerar alta qualidade xenoenxertos de carcinoma hepatocelular humano primárias em ratinhos imunodeficientes, investigadores contemplando a utilização destes protocolos deve considerar algumas limitações do modelo. Em primeiro lugar, nossos protocolos de incorporar o mínimo de atraso entre a ressecção cirúrgica do tecido do paciente e seu posterior processamento em laboratório, ainda alcançar altas taxas de enxertia manteve-se um desafio, o que sugere que a implementação viável destas técnicas requer proximidade do local de coleta do tecido do paciente para olaboratório ou de infra-estrutura que podem minimizar os atrasos na transferência de espécimes frescos. Em segundo lugar, os procedimentos cirúrgicos intra-abdominais complexas em 6-8 semanas de idade camundongos imunodeficientes devem ser realizadas por pessoal com formação adequada, a fim de alcançar a sobrevivência dos animais durante vários meses antes de formar xenografts; estes procedimentos e posterior cuidados com os animais são tanto tempo e recursos. Em terceiro lugar, o desenvolvimento e progressão de xenoenxertos intra-hepáticos não pode ser facilmente monitorizada sem sacrificar os animais em intervalo de tempo pré-determinados, o que limita a utilidade dos xenoenxertos nesta localização para alguns tipos de ensaios como descrito acima. Além disso, xenografts intra derivados de injeção de células no baço pode apresentar-se como múltiplos nódulos espalhados por todo o parênquima hepático que são difíceis de quantificar com precisão em termos de carga tumoral total. Finalmente, é importante observar que os nódulos de tumor intra resultantes da injecção de células no baço pode seleccionartivamente reflectir subpopulações específicas de células que são capazes de migração a partir do baço para a iniciação do tumor e do fígado subsequente.
Quando a geração de xenoenxertos de tecidos de carcinoma hepatocelular humano primários, mas também é importante para confirmar que os xenotransplantes resultantes assemelham-se HCC. Nós já demonstrou que linfomas podem inadvertidamente desenvolver a partir de leucócitos passageiros dentro xenotransplantadas tecidos HCC humana 21. Temos, assim, esgotar rotineiramente CD45 + leucócitos humanos a partir de suspensões de células tumorais primárias e utilizar RT-PCR, citometria de fluxo, avaliação histopatológica e imunohistoquímica para analisar xenografts para características típicas do CHC. Quando passaging xenografts estabelecidos para novos estudos, as células murinas infiltrantes de tumor também deve ser esgotado usando um anticorpo contra o antígeno de histocompatibilidade rato H2k. Se o pedido de pesquisa envolve a utilização de fragmentos do tumor ou a medição do crescimento de xenoenxerto, a análise do xenograSTF no final do estudo deve incluir uma avaliação do grau em que os tumores são infiltradas por leucócitos humanos e de células de camundongo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde Fase 1 Clínico-Scientist Award (AG) de e uma subvenção de funcionamento da Sociedade de Pesquisa do Câncer (AG). Os autores agradecem ao Dr. John Dick por seu apoio a este projeto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Mod. Eagle Medium/Ham’s F12 50/50 Mix x1(DMEM-F12) | WISENT Bioproducts | 319-075-CL | |
| Collagenase TypeIV | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Dispase II | Stemcell Technologies | 7923 | |
| Matrigel Matrix | Becton-Dickinson Biosciences | 354234 | |
| 10 % Buffered Formalin solution | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| 0.9 % Saline Solution (NaCl), sterile | House Brand | 1011-L8001 | |
| Betadine surgical scrub | Purdue Pharma | NPN 00158313 | |
| Buprenorphine (Temegesic) NR 0.3 mg/ml | Reckitt Benckiser | ||
| Isoflurane USP, 99.9 %, inhalation anesthetic | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | M60302 | |
| Tear-Gel | Novartis Pharmaceuticals | ||
| Frozen section compound | VWR | 95057-838 | |
| Cryomold, Tissue -Tek | Sakura Finetek | 4566 | |
| Precision Glide Needle 18G 1 ½ | Becton-Dickinson Biosciences | 305196 | |
| Precision Glide Needle 27G ½ | Becton-Dickinson Biosciences | 305109 | |
| Insulin syringe, 3/10 cc U-100, 29G½ | Becton-Dickinson Biosciences | 309301 | |
| Surgical blade No.10 | Feather Safety Razor Co. | 08-916-5A | |
| #5-0 Soft silk surgical suture, 3/8" taper point needle | Syneture | VS-880 | |
| Transpore surgical tape | 3M Health care | 1577-1 | |
| Cotton applicator | Medpro | 018-425 | |
| Surgicel, oxidized regenerated cellulose | Ethicon | 1951 | |
| Cell strainer 100 μm nylon | Becton-Dickinson Biosciences | 352360 | |
| Magnification lighting with mobile base | Benson medical Industries Inc. | model: RLM-CLT-120V | |
| Petridish sterile 100x20 mm | Sarstedt | 821474 | |
| Tissue forcep, 1x2 teeth, 4-1/2" | Almedic | A10-302 | |
| Adson dressing forcep 4-3/4" | Almedic | A10-220 | |
| Eye dressing forcep, serrated, straight, 4" | Almedic | A19-560 | |
| Hartman Hemostatic Forceps, curved, 3-1/2" | Almedic | A12-142 | |
| Iris scissor, curved, 4-1/4" | Almedic | A8-690 | |
| Iris scissor, straight, 4-1/2" | Almedic | A8-684 | |
| Olsen-Hegan needle driver, 5-1/2" | Almedic | A17-228 |
References
- El-Serag, H. B.
- Li, Y., Tang, Z. Y., Hou, J. X. Hepatocellular carcinoma: insight from animal models. Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 32-43 (2012).
- Tateishi, R., Omata, M. Hepatocellular carcinoma in 2011: Genomics in hepatocellular carcinoma--a big step forward. Nat. Rev. Gastroenterol Hepatol. 9, 69-70 (2012).
- Hoshida, Y., et al. Molecular classification and novel targets in hepatocellular carcinoma: recent advancements. Semin. Liver Dis. 30, 35-51 (2010).
- Ji, J., Wang, X. W. Clinical implications of cancer stem cell biology in hepatocellular carcinoma. Semin. Oncol. 39, 461-472 (2012).
- Villanueva, A., Hernandez-Gea, V., Llovet, J. M. Medical therapies for hepatocellular carcinoma: a critical view of the evidence. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. , (2012).
- Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin. Transl. Oncol. 12, 473-480 (2010).
- Sausville, E. A., Burger, A. M. Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development. Cancer Res. 66, 3351-3354 (2006).
- Shultz, L. D., et al. Multiple defects in innate and adaptive immunologic function in NOD/LtSz-scid mice. J. Immunol. 154, 180-191 (1995).
- Ohbo, K., et al. Modulation of hematopoiesis in mice with a truncated mutant of the interleukin-2 receptor gamma chain. Blood. 87, 956-967 (1996).
- Fiebig, T., et al. Three-dimensional in vivo imaging of the murine liver: a micro-computed tomography-based anatomical study. PLoS One. 7, e31179 (2012).
- Masters, J. R. Human cancer cell lines: fact and fantasy. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 233-236 (2000).
- Yamashita, T., et al. EpCAM-positive hepatocellular carcinoma cells are tumor-initiating cells with stem/progenitor cell features. Gastroenterology. 136, 1012-1024 (2009).
- Ma, S., et al. miR-130b Promotes CD133(+) liver tumor-initiating cell growth and self-renewal via tumor protein 53-induced nuclear protein 1. Cell Stem Cell. 7, 694-707 (2011).
- Yang, Z. F., et al. Significance of CD90+ cancer stem cells in human liver cancer. Cancer Cell. 13, 153-166 (2008).
- Park, Y. N., et al. Neoangiogenesis and sinusoidal "capillarization" in dysplastic nodules of the liver. Am. J. Surg. Pathol. 22, 656-662 (1998).
- Sigurdson, E. R., Ridge, J. A., Kemeny, N., Daly, J. M. Tumor and liver drug uptake following hepatic artery and portal vein infusion. J. Clin. Oncol. 5, 1836-1840 (1987).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3, 1167-1170 (2008).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration after partial hepatectomy: critical analysis of mechanistic dilemmas. Am. J. Pathol. 176, 2-13 (2010).
- Zhang, D. Y., Friedman, S. L.
- Chen, K., Ahmed, S., Adeyi, O., Dick, J. E., Ghanekar, A. Human solid tumor xenografts in immunodeficient mice are vulnerable to lymphomagenesis associated with Epstein-Barr virus. PLoS One. 7, e39294 (2012).
