Summary
Mitoz geçiren kanser hücrelerinde fenantridin PJ-34 sitotoksik aktivite canlı konfokal görüntüleme ile gerçek zamanlı olarak belgelenmiştir. PJ-34 eradike insan meme kanseri MDA-MB-231 mitoz İlave sentrozom barındıran hücreler. Normal iki odak mitoz farklı olarak, ekstra-sentrozom PJ-34 varlığında iki kutup mili kümelenmiş değildi.
Abstract
Güçlü PARP1 inhibitörleri olarak hareket fenantren türevleri mitoz çoklu-centrosomal insan kanser hücrelerinde Sürnümerer centrosomes en iki odak kümeleme engelledi. Fenantridin PJ-34 molekülü en güçlü idi. İlave sentrozom Declustering çoklu centrosomal hücrelerindeki mitotik yetmezliği ve hücre ölümüne neden olur. En katı insan kanser ekstra centrosomes yüksek olay var. PJ-34 aktivitesi canlı bir insan meme kanseri sentrozom oldukça bol olduğu floresan γ-tubulin kodlayan vektörler ve floresan histon H2b mevcut için transfekte edilmiş MDA-MB-231 hücrelerinin konfokal görüntüleme ile gerçek zamanlı olarak belgelenmiştir kromozomlar. Anormal kromozomlar düzenlemeler ve declustered centrosomes temsil eden de-kümelenmiş γ-tubulin odakları PJ-34 ile tedavi sonrası transfekte MDA-MB-231 hücrelerinde tespit edildi. Iki mil kutuplarda un-kümelenmiş ekstra centrosomes kendi hücre ölümü öncesinde. Bu sonuçlar, FO bağlantılıR, ilk kez İlave sentrozom mitoz de-kümeleme ve hücre ölümüne yol açan mitotik yetmezliği olan insan kanser hücreleri, PJ-34 arasında en son tespit edilen özel sitotoksik aktivitesi. Iki centrosomes ve iki odak iğ ile mitoz geçiren normal hücrelere zarar vermeden sabit hücreler, çok centrosomes ile PJ-34 özel ortadan kanser hücrelerinin konfokal görüntüleme tarafından gözlemlenen önceki bulgulara göre. PJ-34 Bu sitotoksik aktivite diğer güçlü PARP1 inhibitörleri tarafından paylaşılan değildi ve PARP1 inhibisyon bağımsızlığını düşündüren, PARP1 eksik MEF barındıran extracentrosomes gözlendi. Konfokal görüntüleme Canlı mitoz sırasında hücrelerin ortadan kaldırılması yeni moleküller belirlenmesi için yararlı bir araç sundu.
Introduction
Fenantren, PJ-34 de dahil olmak üzere PARP1 inhibitörleri, elde edilen stres koşulları (inme ya da miyokard infarktüsü) 1 altında enerji tüketen PARP1 aracılı DNA-onarım ile oluşturulan apoptotik hücre ölüm pasif hücreleri korumak için tasarlanmıştır. Ancak, son zamanlarda biz PJ-34, bu uyaran PARP1 inhibe göre iki kat daha yüksek konsantrasyonda, sadece insan kanser hücrelerinin 2,3 hücre ölümüne neden olabilir keşfetti. Hücrenin daha hızlı yayılması olduğu, hücrelerin daha verimli ortadan kaldırılması oldu. PJ-34 sitotoksik aktivite ekstra centrosomes mitoz 2 de-kümeleme bağlandı. Birçok insan kanser hücreleri liman 4,5 multicentrosomes. Etkili bir mitoz iki sentrozom barındıran hareketsiz hücreler ya da iyi huylu proliferatif hücrelerin zarar vermeden 72-96 saat içinde, bu hücrelerin ortadan 20 uM PJ-34 ile supernümere sentrozom liman insan meme kanseri hücreleri, MDA-MB-231, inkübasyonu
Bipolar centrosome montaj mitoz 4,5 bipolar mili oluşumu için çok önemlidir. Bu nedenle, ikiden fazla centrosomes ile hücre iki kutup 4-9 kendi ekstra centrosomes kümeleme, bir güçlükle anlaşılan moleküler mekanizması geliştirdik. Kendi centrosomes bipolar montaj hatası tutuklamalar G2 / M tutuklama hücre döngüsü ve hücre ölümüne yol açan 4,5 mitotik başarısızlığı bu çok kutuplu bozuk iğ ve anormal kromozomlar ayrışmaya neden olabilir. Ekstra centrosomes de-kümeleme altında yatan moleküler mekanizmalar yoğun incelenmiştir <> 10 destek. Sağlıklı dokuları 5,10 korurken bu ölüm mekanizması anlamak kanser hücrelerinin özel ortadan kaldırılması sağlayacaktır.
Bu nedenle, mitotik felaket hücre ölümü geçiren bileşiklerin konfokal görüntüleme İlave sentrozom kümeleme etkileyen molekülleri tanımlamak için kullanılabileceğini göstermektedir, insan katı cancers.Our sonuç geniş etkili olabileceği seçici bir kanser tedavisinde yeni bir mod, teklif mitoz 2,3, ilaç adayları hedef bu bileşiklerin kanser render.
Biz sabit ve canlı insan kanser hücreleri (mitoz ekstra-centrosomes yüksek çıkması ile) karşı normal hücreler tarayarak fenantridin PJ-34 sitotoksik aktivite belgeledi. Bir adım insan kanser hücrelerinde PJ-34 sitotoksik aktivitesini tanımlamak için kullanılan görüntüleme yöntemleri adım açıklama aşağıda yer almaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Hücre Kültürü hazırlanması
MDA-MB-231 hücreleri, ATCC (American Type Culture Collection) satın alındı ve sıvı azot içinde saklandı.
- Dulbeco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM),% 10 at serumu,% 1 L-glutamin ve% 1 Penstrep-Amfoterisin B içeren 10 ml tam ortam içinde 92 mm çapında Petri kabındaki Tohum 10 6, MDA-MB-231 hücrelerinin hücre Veren 80-100 yaklaşık% izdiham çoğalmaya.
- Çanak kültür ortamı çıkarın ve atın.
- % 0.25 'lik serum tüm izlerini silmek için (w / v) Tripsin-EDTA çözeltisi ile kısa bir hücre tabakası yıkayın.
- Hücre tabakası (genellikle 5-15 dakika içinde) dağılana kadar ters mikroskop hücreleri çanak ve gözlemlemek için tripsin-EDTA çözeltisi 2.0 ml ilave edilir.
- 18 ml tam büyüme ortamı ekleyin ve yavaşça pipet hücreleri tarafından aspire. Bir tüp aktarın.
- 1.200 rpm hücre süspansiyonu santrifüj.
- Cu 24 ml hücre pelet yeniden askıyaorta LTURE.
- 35 mm cam alt yemekleri (25% izdiham yaklaşık) ve inkübatör yer (% 5 CO 2, 37 ° C) hücre süspansiyonu 2 ml ekleyin.
- Çözümler:
- Hücre proliferasyonu için tam ortam:% 10 FBS DMEM,% 1 antibiyotik (100 birim / ml penisilin G, 100 ug / ml streptomisin, Pen-Strep-Ampho çözeltisi) ve 2 mM L-glutamin.
- % 0.25 tripsin-EDTA ihtiva Tripsin-EDTA solüsyonu,.
- Yemekleri:
92 mm çapında Petri kapları.
35 mm çapında poli-D-lizin kaplı cam alt kültür tabaklarında.
2. Canlı Konfokal Görüntüleme için Hücreleri hazırlanması
- Tohum 2 x 10 1 'de belirtildiği gibi 2 ml komple ortam içinde cam alt kültür kapları içinde 5 MDA-MB-231 hücreleri. Hücre kültürü% 60-70 izdiham (çanak başına 3-4 x 10 5 hücre yaklaşık) ulaştığında, transfeksiyon devam.
- Iki plazmit dekoderi ile hücrelerin transfekteüretim protokolü takip, lipozomal transfeksiyon reaktif Jet-PI kullanarak füzyon proteinleri γ-tubulin-GFP (centrosomes floresan tespiti için) ve Histon-KIRMIZI (H2b-KIRMIZI, kromozom floresan tespiti için) ing. Kısaca, 100 ul NaCl (150 mM) ile bir boru her bir plazmit 2 ug karıştırın. Ikinci bir tüp içinde 100 ul NaCl (150 mM) ile transfeksiyon reaktifi (100 ul) karıştırın ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika inkübe edin. Daha sonra iki çözüm, karışım (hafif vorteks kullanarak) birleştirmek ve çevirme özelliği. Oda sıcaklığında 30 dakika süreyle inkübe edilir.
- Transfeksiyon karışımı İnkübasyon sırasında, bir kez PBS ile yıkayın ve hücrelerin herhangi bir ek ile sıcak DMEM, 2 ml (37 ° C) hücre orta yerine.
- Yavaşça DMEM hücrelere transfeksiyon karışımı eklenir ve daha sonra 8 saat boyunca (37 ° C,% 5 CO2) inkübatör hücreleri döndürür.
- 24 inkübasyondan 8 saat sonra, 2 ml komple ortam ile DMEM değiştirmek ve inkübatör hücrelerin inkübesa.
- 24 saat transfeksiyondan sonra, 2 ml komple ortam 20 uM PJ-34 içeren hücrelerin orta yerine.
- İlave 18 saat (37 ° C,% 5 CO2) için hücreler inkübe edin.
- % 5 CO 2 ve 37 ° C'de hücreleri tutarak görüntüleme odasında en az 16 saat süreyle konfokal görüntüleme yaşamak Konu hücreleri
- Buna paralel olarak, aşağıdaki gibi floresan mikroskopi kullanılarak transfeksiyon etkinliği 36 saat sonrası transfeksiyon inceleyin:
- Tohum 2 x 10 1 lamel çukur başına 2 ml komple ortam içinde içeren 6 oyuklu plaka 5, MDA-MB-231 hücreleri.
- 2.2-2.5 bölümlerde belirtildiği gibi hücrelere transfekte.
- 36 saat transfeksiyondan soğuk metanol içinde inkübe edilerek, bir lamel üzerine monte edilmiş, transfekte edilmiş hücreleri sabitleştirmek: aseton (1:1) çözeltisi, 7 dakika, -20 ° C
- Sabitleme çözüm aspire ve bir kimyasal kaputu kurumaya monte hücreleri ile lamel sağlar.
- DAPI Altın antifade reaktif uzatmak ve inci izin uygulayınE lamel 6 saat boyunca karanlıkta kurumasını bekleyin.
- Floresan mikroskop altında slayt inceleyin ve hücrelerin toplam nüfusun (DAPI DNA boyama) gelen transfekte hücreleri (kırmızı ve yeşil sinyalleri) yüzdesini hesaplar. 100-200 hücre sayılmıştır zaman arzu edilen transfeksiyon yüzdesi% 20-40 kadardır.
3. Canlı Konfokal Görüntüleme Tarayıcı Ayarları Teknik Parametreler
- Tarama modu XYZT; İğne [havadar] 1.00; Zoom 3.5, Çözünürlük 8 bit; Lazer DPSS 561 nm, Argon, görünür lazer 488 nm, Lazer O / Ne görünür 633 nm; Amaç HCX PL APO CS 63X 1.40 YAĞ UV; Sayısal diyafram 1.4; Kırılma endeksi 1.52; hızı 700 Hz tarama.
- Görüntü 3 boyutlu sunum IMARIS görüntüleme yazılımı 7.0 ile hazırlanmıştır.
4. Sabit Hücreler Mitoz konfokal Görüntüleme
- Tohum 2 x 10 5, MDA-MB-231 göğüs kanseri hücreleri (ATCC), normal fare embriyonik fibroblastlar (MEF) veya eksik PARP1 ME2 ml tam orta 6-plaka cam lamelleri F (, Dr Francoise Dantzer tarafından hazırlanan PARP - - /). Lameller, 2 saat boyunca kurutuldu ve 6-çanak her iyi yerleştirilen steril DD su ile yıkama ile takip edilerek,% 96 etanol ile yıkanmıştır.
- Orta PJ-34 (10-30 mcM) ekleyin ve gerekli süre (genellikle en fazla 96 saat) için hücreler kuluçkaya yatmaktadır.
- Bir kez PBS ile yıkayın lamelleri (fosfat tamponlu tuz), ve buz gibi soğuk metanol ile inkübasyon kullanarak hücreleri gidermek: aseton (1:1) çözeltisi, 7 dakika, -20 ° C
- Sabitleme çözüm aspire ve lamelleri kimyasal kaputu kurumaya izin (bu aşamada, lamelleri birkaç hafta -20 ° C tutulabilir).
- Hücre zarının geçirgen hale getirilmekte ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBST içinde% 10, NDS (normal eşek serumu) ('engelleyici bir çözüm') ile hücrelerin engellemek için PBST (PBS% 0.1 Tween-20 ile takviye edilmiş) ile bir kere lamelleri yıkayın.
- Birincil antibodi ile permeabilize sabit hücreleri inkübeoda sıcaklığında 2 saat için ES (iğ ve sentrozom boyama için). Anti-α tübülin (1:250 seyreltme) ve anti-γ tübülin (1:200 seyreltme) antikorları takip olarak bloke çözelti içinde seyreltilir. Birincil antikorlar, şöyle uygulanır: 6-plaka kapağı (kapağın baş aşağı) üzerinde her bir lamel için çözüm engelleme antikorların bir karışımı, 100 ul (bir damla) uygulanmaktadır. Yavaşça antikorlar damla lamel koymak, numaralı seribaşı hücreleri açılan karşı karşıya. Oda sıcaklığında 2 saat için de antikorların bakan lamelleri inkübe edin.
- Kuyularda geri lamelleri yerleştirin ve PBST ile hücreleri 3 kez yıkayın. Daha sonra, floresan ikincil antikorlarla lamelleri hücrelerin etiketlenmesi için 4.6 'de tarif edilen aynı prosedürü kullanmak. , Karanlıkta, 1 saat, RT, ikincil antikorlar ile lamelleri hücreleri inkübe edin. Antikorlar aşağıdaki gibi engelleme çözümü seyreltilir: ve Alexa Fluor 568 (1:1,000 seyreltme Alexa Fluor 488 (yeşil 1:1,000 seyreltme);kırmızı).
- Kullanarak lamelleri DAPI (kromozomlar boyama için) ile Altın antifade reaktif uzatmak ve kuruması için karanlıkta oda sıcaklığında gece inkübe monte edin.
- Konfokal mikroskobu ile kapak fişleri inceleyin.
5. Hücre Canlılık ATP üretimi ile ölçülür
ATP üretimi bir lüminesan ATP tespit kiti kullanılarak ölçülür.
- 96 oyuklu plaka, her bir 800 ul ortam içinde yaklaşık olarak 20.000 hücre tohum hücreleri. Üç boş bir kuyu ortamı arka lüminesans belirlenmesi için kullanılmalıdır.
- Yaklaşık 10 mcM 100 mcM ATP standart seyreltme serisi hazırlayın ve buz üzerinde tutmak.
- Her bir kuyucuğa 50 ul deterjan ekleyin ve orbital çalkalayıcı, 700 rpm'de 5 dakika boyunca plaka sallayın.
- Kit 'substrat tampon' 5 ml 'liyofilize yüzey' bir sulandırın her flakon.
- Oyuklara sulandırılmış substrat çözeltisinin 50 ul ekle ve sallayınorbital çalkalayıcı, 700 rpm, 5 dakika süreyle plaka.
- 10 dakika karanlıkta plaka tutun.
- ELISA mikro okuyucu tarafından her kuyunun lüminesans ölçün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PJ-fenantridin 34 1 çözelti, kararlı suda (Şekil 1). Daha önceki sonuçlar hücre ölümünü ortaya ve PJ-34 ile tedavi edilen sabit çoklu centrosomal kanser hücrelerinin çeşitli ekstra-sentrozom de kümelenmiş. Aksine, normal hızla çoğalan hücrelerde 2,3 etkilenmedi. Centrosomes sabit ekstra centrosomal hücreleri 2 centrine1 ve γ-tubulin karşı antikor çift etiketleme tarafından tespit edilmiştir.
Burada, PJ-34 sitotoksik aktivite canlı konfokal mikroskopi kullanılarak gerçek zamanda bu canlı ekstra centrosomal hücrelerinde belgelenmiştir. , Insan meme kanseri İlave sentrozom 4,5 yüksek bir olay (>% 50), MDA-MB-231 hücrelerinin, canlı γ-tübülin-GFP (transfekte edilmiş hücreleri üzerinde duruldu konfokal görüntüleme ile en az 16 saat süre ile tarandı floresan γ-tubulin odaklar 2 etiketlenmesi) ve histon H2b-KIRMIZI (floresan Labe ileKromozomların ling). Altı ila on canlı transfekte hücreler her bir deney paralel olarak tarandı. Centrin1 ile transfekte edilmiş hücrelerde γ-tubulin odaklarının çift immün teknik olarak mümkün oldu.
Dağınık γ-tubulin odaklar ve anormal kromozomlar düzenleme nadiren mitoz rastgele seçilen tedavi edilmemiş MDA-MB-231 hücrelerinde tespit edildi. Ekstra centrosomes bifokal kümeleme temsil γ-tubulin odaklar, bir bifokal kümeleme canlı işlenmemiş MDA-MB-231 hücreleri (Şekil 2) çoğunda belgelenmiştir, aksine, centrosomes ve kromozomların anormal düzenleme un-kümelenmiş canlı tespit edildi transfekte edilmiş MDA-MB-231 PJ-34 (20 mikron), ve hücre ölümü (Şekil 3) ile sona eren bu hücrelerde mitoz ile kuluçkaya yatırılmış hücreler. Bu hücreler, 18 PJ-34 ile inkübe edilmiş, - 24 saat tarama işleminden önce ve ek 16 saat için (Şekil 3), tarama sırasında. Hücre de gerçek zamanlı dokümantasyonmitoz sırasında ATH güçlü bir mitoz sırasında çok kutuplu bir mili olan, insan malign hücrelerin sayısını ve pj-34 (20 uM) 2 ile inkübe edilen hücrelerde hücre ölümü yüzdesi arasında bir pozitif korelasyon daha önce tanımlandığı destekler.
PJ-34 güçlü bir önleyicisi, 1 PARP1 olarak görev üstlenmektedir. Bu nedenle, mitotik yetmezliği ile bağlantılı hücre ölümüne neden olan PARP1 inhibisyonu olasılığını incelenmiştir. Canlı görüntüleme farklı olarak, sabit MDA-MB-231 hücreleri görüntüleme ve böylece insan kanser hücre çizgileri, çeşitli PARP1 inhibitörlerinin etkilerinin istatistiksel analiz sağlayarak, hücre kültürleri hücrelerin büyük bir nüfusun incelenmesi gerekmektedir. (Şekil 4) PJ-34 aktivitesi, normal olarak diğer güçlü olmayan fenantren PARP1 inhibitörleri veya PARP1 yetersizliğine sahip hücrelerin - (- /), fare embriyonik fibroblastlar (MEF), örneğin, normal ve PARP1 () aktivitesi ile karşılaştırılmıştır. PARP1 eksik MEF liman mitoz çoklu-centrosomes, ama hayır vardırT tümör hücreleri 11. Bu hücreler Dr Francoise Dantzer, Strazburg, Fransa tarafından hazırlanmıştır.
(- / -) Normal Sabit ve PARP1 MEF olarak 2 önce bildirilen sırasıyla kendi iğ ve centrosomes etiketli α-ve γ-tubulin,, için immunolabeled edildi. Incelenen hücre kültürleri ABT-888 ve AG01469, PARP1 enzimatik aktivitesini inhibe ve BSI-201 de dahil olmak üzere PJ-34 veya diğer güçlü olmayan fenantren PARP1 inhibitörleri, görünüşe göre PARP1 bağlayıcı zayıflatan bir bileşik ile tedavi edildi DNA 12-14 çentikli. Konsantrasyonları inhibe PARP1 aktivite (Şekil 4) normal MEF engelli test PARP1 inhibitörleri hiçbiri. Buna karşılık, PJ-34 doza bağımlı PARP1 in γ-tubulin odaklar, iğ bozulma ve hücre ölümü un-kümeleme neden (- / -) MEF (Şekil 4A ve B). Bu PJ-34 ile tedavi normal bir MEF gözlenmedi (FigürE 4B) veya PARP1 olarak, (- / -) EMB ile tedavi edilen phenenthrene PARP1 inhibitörleri ABT-888 ve AG014699 (Şekil 4C). (- / -) EMB normal EMB PARP1 daha PJ-34 aktivitesine daha dirençli olduğu, ancak 20 uM aşan konsantrasyonlarda PJ-34 normal, MEF zarar ki not edilmelidir.
Aslında PJ-34 eradike PARP1 daha yüksek konsantrasyonlarda PJ-34 ile inkübe MEF (- - /) kendi PARP1 eksikliği ve multifokal iğ oluşumu ve PARP1 hücre yok etme arasındaki ilişki rağmen MEF (- - /) (- / -) MEF ve PARP1 inhibisyon (Şekil 4A) PARP1 engellenmesi için gerekli olan, ekstra-centrosomes PARP1 de-kümeleme arasında nedensel bir bağlantı ile uyumlu değildi. PARP1 yılında PJ-34 sitotoksik aktivitesi (- / -) MEF daha çok centrosomal hücreleri 2 ekstra centrosomes de-kümeleme ajan (olarak faaliyet ile açıklanabilir Ek Bilgiler "/> Şekil 3,. Un-kümelenmiş γ-tubulin etiketli ekstra centrosomes ile mitoz bir rasgele seçilen MDA-MB-231 hücre içinde hücre ölümünün bir canlı konfokal görüntüleme belgeler. MDA-MB-231 hücrelerinin tarama işleminden önce ve canlı konfokal görüntüleme, 16 saat boyunca 24 saat boyunca PJ-34 ile inkübe edildi. PJ-34 γ-tübülin-GFP (yeşil, γ-tubulin odaklar ve sentrozom) ve H2b-kırmızı (kırmızı, kromozom) ifade vektörleri ile transfeksiyondan 24 saat sonra uygulandı. 
Şekil 1. Fenantridin PJ-34-N-(6-okso-5 ,6-dihidro-phenanthridin-2-il)-N, N-dimetil-asetamit elde edildi. 
Şekil 2. Mitoz bir rasgele seçilen canlı MDA-MB-231 hücre dışı centrosomes Bi-odak kümeleme. A. Üst panel:. Γ-tübülin-GFP ile transfekte Alt panel, rasgele seçilen bir canlı MDA-MB-231 hücre olarak etiketlenir, sentrozom: histon H2b-KIRMIZI ile transfekte edilmiş bir rasgele seçilen, MDA-MB-231 hücre mitoz sırasında kromozom yeniden düzenleme. rasgele seçilen bir kült tespit kümelenmiş ekstra centrosomes B. Bi-odak mitozdör MDA-MB-231 hücre. Ve histon H2b-KIRMIZI (etiketleme kromozomlar, kırmızı); Hücreler iki γ-tubulin-GFP (yeşil etiketleme γ-tubulin odaklar) tarafından transfekte edildi. Transfeksiyondan 48 saat sonra, hücreler 16 saat için canlı bir konfokal görüntüleme maruz bırakıldı. Altı hücreler her bir deney paralel olarak tarandı. Dört farklı deneyler yapıldı. Ek Bilgiler Ayrıca bkz. büyük rakam görmek için buraya tıklayın . 
Şekil 3,. Ekstra-centrosomes de-kümeleme PJ-34 ile tedavi canlı MDA-MB-231 hücrelerinde hücre ölümü öncesinde. Hücre ölümü ile sona erdi dağınık centrosomes (solda 1. çerçeve) (ile mitoz bir rasgele seçilen canlı MDA-MB-231 hücre 2 nci ve 3 üncü kare). Bu ceve (histon H2b-kırmızı, ll rastgele γ-tübülin-GFP (yeşil sentrozom dahil etiketleme γ-tubulin odaklar) ifade vektörleri ile transfeksiyondan 24 saat sonra uygulanır PJ-34 (20 uM) ile 24 saat boyunca kuluçkaya bir hücre kültüründe seçildi etiketleme kromozomlar, kırmızı). Hücre canlı konfokal görüntüleme ile 16 saat tarandığı. Altı hücreler her bir deney paralel olarak tarandı. Üç farklı deneyler yapıldı. Ek Bilgiler Ayrıca bkz. büyük rakam görmek için buraya tıklayın . 
Şekil 4. PARP1 PJ-34 arasında bir sitotoksik aktivitesi (- / -), fare embriyonik fibroblastlar. N hesaplanan multifokal iğ A. (Sol) yüzdesiormal (siyah çizgi) ve Parp1 - / - belirtilen konsantrasyonlarda PJ-34 ile 48 saat boyunca kuluçkaya yatırılmıştır (gri çizgi) MEF. Çok kutuplu iğ yüzde 3 farklı deneylerde tespit 20 toplam iğ dışında hesaplanmıştır. (Sağ) kontrol tedavi edilmemiş hücrelerin hayatta kalma göre PJ-34 (20 mcM) ile 72 saat inkübe hücre kültürlerinde saptanan hücre sağkalım İndirimli (- / - Normal (siyah çizgi) ve Parp1 (gri çizgi) MEF). Hücre yaşama hücrelerin ATP üretimi (protokol 5) ile analiz edilmiştir. Belirtilen, 48 saat boyunca tedavi mitoz MEF (kontrol), ya da PJ-34 ile inkübe -. 3 farklı deneylerde her bir hücre hattı boyunca 4 ölçümlerin ortalama değerleri rastgele seçilmiş sabit Normal B. Mil sunulan ve Parp1 edilir - / konsantrasyonları. PJ-34 çok kutuplu iğ neden oldu. Hücreler, sabit permeabilize ve için immunolabeled edildi α-ve γ-tubulin (yeşil iğ etiketlenmesi ve sırasıyla centrosomes kırmızı etiketleme,). Kromozomlar DAPI reaktif (mavi) ile işaretlendi. . 3 farklı deney Temsilcisi sonuçları C. Güçlü olmayan fenantren PARP1 inhibitörleri PARP1 içinde centrosomes kümeleme etkilemedi (- / -) MEF. Rastgele seçilmiş normal iğ ve Parp1 - / - MEF sunulmaktadır; işlenmemiş MEF (kontrol) veya MEF olmayan fenantren PARP inhibitörleri, AG01469 (20 mcM) veya ABT888 (20 mcM) ile 48 saat tedavi. Kromozomlar DAPI reaktif (mavi) ile etiketlenir. Benzer sonuçlar 3 farklı deneylerde elde edilmiştir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Büyük rakam görmek için buraya tıklayın . 
Büyük rakam görmek için buraya tıklayın .
Şekil 2B. Ek Şekil. Iki odak kümelenmiş γ-tubulin ekstra centrosomes γ-tubulin-GFP ifade vektörleri ile transfekte sonra canlı konfokal görüntüleme, 48 saat ile 16 saat tarandığı etiketli ve ile anafaz bir rasgele seçilen MDA-MB-231 hücre H2b-KIRMIZI (etiketleme γ-tubulin odaklar ve centrosomes sabit hücrelerinde (yeşil) ve kromozomların H2b histon etiketleme (kırmızı), sırasıyla).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Konfokal görüntüleme mitoz sırasında canlı çok centrosomal hücreleri (Şekil 3 ve Ek bilgileri) PJ-34 sitotoksik etkisinin gerçek zamanlı belgeler temin yaşıyor. Bu PJ-34 5-9 Mitotik Afet hücre ölümünün indüksiyon düşündüren, ekstra centrosomes de-kümeleme ve hücre ölümüne insan kanser hücrelerinde PJ-34 sitotoksisite atfederek ilk canlı belgelerine oldu. Bunun aksine, süper numerary sentrozom iki odak kümeleme iki focali kümelenmiş ilave sentrozom (Şekil 2, ek bilgi), normal mitoz canlı işlenmemiş MDA-MB-231 hücrelerinde gözlenmiştir.
Bu sonuçlara göre, transfekte hücrelerin konfokal görüntüleme mitoz 5,9,15,16 sırasında transfekte hücrelerinde ekstra centrosomes kümeleme karışan proteinlerin translokasyon tespit için yararlı olabilir yaşıyor. Çoklu Centros PJ-34 etkilenen proteinlerin tespitiOMAL hücreleri ekstra centrosomes de-kümeleme aktive ölüm mekanizmaları anlamak için bazı ipuçları sağlayabilir.
Canlı hücrelerde mitoz sırasında gerçek zamanlı bilgi veren canlı konfokal görüntüleme, avantajı da çeşitli sınırlamalar bağlıdır. Deneme başına taranan hücre sayısı sınırlıdır. Bu nedenle mitoz hücreleri saptamak için şansı düşüktür, ve çeşitli tekrar deneyler taranan hücrelerde mitoz gerçek zamanlı belgeleri için gereklidir. Buna ek olarak, başarılı olarak etiketlenmiş proteinleri, ifade vektörleri ile hücrelerin transfeksiyonu yüksek verimlilik, son derece bağlıdır. Böylece, güvenilir olmasına rağmen, canlı konfokal görüntüleme zaman alıcı ve son derece deneyimli sert işçiler gerektirir.
Sabit hücrelerin karşılaştırma, immunositokimya ve konfokal görüntüleme güvenilir bir istatistiksel analiz için gerekli deney başına hücre sayıda inceleme sağlar. Biz karşılaştırmak için bu yöntem kullanılırSüpernümerari sentrozom 2,3 ile mitoz kanser hücreleri üzerindeki etkileri normal huylu hücrelerin mitoz PJ-34 etkileri. Benzer şekilde, bu yöntem, PARP olmayan fenantren PARP1 inhibitörlerinin PJ-34 etkilerini değerlendirmek için kullanıldı (- / -) MEF İlave sentrozom (çoklu sentrozom 11 arasında yüksek bir olay olan hücreler) (Şekil 4) barındıran.
Özet olarak, sonuçlar histokimya ve sabit hücre konfokal analizi ile mitoz canlı hücreleri (Şekil 2 ve 3) konfokal görüntüleme tarafından sağlanan en değerli gerçek zamanlı bilgi birleştirme avantaj göstermektedir. Bu yöntemlerin bir arada PJ-34 gibi, hücrenin hayatta kalması için özel mekanizmaları çok önemli hedef, küçük moleküllerin sitotoksik etkinliği belirlemek için yararlı olabilir. Kendi çoğalması ve surviv için ekstra centrosomes iki kutuplu kümeleme pek çok insan kanser hücrelerinin eşsiz bağımlılığıEl PJ-34 kanser tedavisi için olası bir aday vermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Bu araştırmanın finansman kaynakları: Tel Aviv Üniversitesi teknoloji transferi şirketi, Ramot ve Sheba-Tıp Merkezi (M. CA ve SI.), ICRF ortak bir fon - İsrail Kanser Araştırma Vakfı (M. CA.) Ve İsrail bilim Vakfı ( SI).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENTS | |||
| DMEM | Invitrogen (GIBCO) | 41965 | |
| FBS (Fetal bovine Serum) | Invitrogen (GIBCO) | 12657 | |
| Pen-Strep-Ampho solution | Biological Industries, Israel | 03-033-1B | |
| L-glutamine | Invitrogen (GIBCO) | 25030-024 | |
| 0.25% Tripsin-EDTA | Invitrogen (GIBCO) | 25200 | |
| 92 mm Petri dishes | Nunc,Thermo scientific | 150350 | |
| 35 mm poly-D-lysine coated glass bottom culture dishes | MatTek Corporation, USA | P35GC-0-14-C | |
| Luminescent ATP detection assay kit | Abcam | ab113849 | |
| NDS (Normal Donkey Serum) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Anti α-tubulin antibody | Sigma | T9026 | 1:250 dilution (IF) |
| Anti γ-tubulin antibody | Sigma | T5192 | 1:200 dilution (IF) |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG | Invitrogen | A-11017 | 1:1,000 dilution (IF) |
| Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG | Invitrogen | A-10042 | 1:1,000 dilution (IF) |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI (mounting) | Invitrogen | P36935 | |
| JetPEI (liposomal transfection reagent ) | Polyplus | 101-10 | |
| EQUIPMENT | |||
| Confocal microscope | Leica (Mannheim, Germany) | TCS SP5II | |
References
- Jagtap, P., et al. Novel phananthridine inhibitors of poly(adenosine 5'-diphosphate-ribose) synthetase: Potent cytoprotective and antishock agents. Crit. Care Med. 30, 1071-1082 (2002).
- Castiel, A., et al. A small molecule exclusively eradicates human cancer cells: Extra-centrosomes de-clustering agent. BMC Cancer. 11 (1), 412 (2011).
- Inbar-Rozensal, D., et al. A selective eradication of human nonhereditary breast cancer cells by phenanthridine -derived polyADP-ribose polymerase inhibitors. Breast Cancer Res. 11 (6), R78 (2009).
- Gergely, F., Basto, R. Multiple centrosomes: together they stand, divided they fall. Genes Dev. 22, 2291-2296 (2008).
- Godinho, S. A., Kwon, M., Pellman, D. Centrosomes and cancer: how cancer cells divide with too many centrosomes. Canc. Met. Rev. 28, 85-98 (2009).
- Doxsey, S.
- Walczak, C. E., Heald, R. Mechanisms of mitotic spindle assembly and function. International Rev. of Cytology. 265, 111-158 (2008).
- Ogden, A., Rida, P. C. G., Aneja, R. Let's huddle to prevent a muddle: centrosome declustering as an attractive anticancer strategy. Cell Death Differ. 19, 1255-1267 (2012).
- Kramer, A., Anderhub, S., Maier, B. Mechanisms and Consequences of centrosomes clustering in cancer cells. The Centrosome: Cell and Molecular mechanisms of functions and disfunctions in disease. Schatten, E. , Humana Press Springer. 255-277 (2012).
- Galimberti, F., et al. Anaphase Catastrophe Is a Target for Cancer Therapy. Clin. Cancer Res. 17, 1218-1222 (2011).
- Kanai, M., et al. Haploinsufficiency of poly(ADP-ribose) polymerase-1-mediated poly(ADP-ribosyl)ation for centrosome duplication. Biochem. Biophys. Res. Commun. 359, 426-430 (2007).
- Gartner, E. M., Burger, A. M., Lorusso, P. M. Poly(ADP-ribose) polymerase inhibitors: a novel drug class with a promising future. Cancer J. 16, 83-90 (2010).
- Wahlberg, E., et al. Family-wide chemical profiling and structural analysis of PARP and tankyrase inhibitors. Nature Biotechnology. 30, 283-288 (2012).
- Rouleau, M., Patel, A., Hendze, M. J., Kaufmann, S. H., Poirier, G. G. PARP inhibition: PARP1 and beyond. Nature Rev. Cancer. 10, 293-301 (2010).
- Leber, B., et al. Proteins Required for Centrosome Clustering in Cancer Cells. Sci. Transl. Med. 2 (33), 33-38 (2010).
- Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar division in cancer cells with extra centrosomes. Gene Dev. 22, 2189-2203 (2008).
