Summary
Bu protokol, bir atıl gaz akımı kullanılarak yapışkan hücrelerin geçici nüfuziyet için bir yöntem tarif etmektedir. Bu teknik, plazma zarını bozan mekanik kuvvetlerin kullanılması ile yapışık memeli hücrelerine genetik malzeme ve biyomoleküllerin transferini kolaylaştırır.
Abstract
Çeşitli hücre transfeksiyon teknikleri var ve bu üç geniş kategoriye ayrılabilir: viral, kimyasal ve mekanik. Bu protokol, geçici olarak hücrelerin içine normal olarak geçirgen makromoleküllerin transferini kolaylaştırmak için bir inert gaz akımı kullanılarak yapışkan hücrelere nüfuz edilebilir kılınması için mekanik bir yöntemi tarif etmektedir. Bu teknik, mikro gözenek geçici oluşumu ile sonuçlanan, yapışkan hücrelerin plazma zarı üzerinde kesme kuvvetleri aktarmanın çalışır inanıyoruz. Bu gözenekler oluşturulur sonra, hücreler daha sonra, genetik madde ve diğer biyomoleküllerin geçirgendir. Kullanılan mekanik kuvvetlerin kendi alt-tabakaya kalıcı ya da zarar ayırma hücre riski yoktur. Teknik etkili olan atıl gaz dinamiği dar bir aralık, bu nedenle bulunmaktadır. Bir atıl gaz jet HeLa, HEK293 ve insan abdominal aort endotel hücreleri dahil olmak üzere çeşitli hücre çizgileri yapışkan geçirimli de etkili olduğu kanıtlanmıştır. Bu protokol, p için uygunbunun gelecekte yapılacak klinik uygulamalarda potansiyel olarak araştırma ve kullanılabilir gösteren in vivo olarak gösterdiği gibi, in vitro ve hem de yapışık hücre ermeabilization. Ayrıca, değerli bir araştırma aracı olarak kanıtlamak olabilir ki, uzaysal olarak kısıtlayıcı bir şekilde hücrelerin geçirgenleştiren avantajına sahiptir.
Introduction
Biyotıbbın evrim ve hücre mekaniği anlayışı ile, hücre içine biyomoleküllerin teslim birçok araştırma alanları ve tıbbi tedaviler için hayati hale gelmiştir. Farklı teknikler plazma zarı ve hücre sitozolüne yabancı molekülleri tanıtmak için geliştirilmiştir. Viral, kimyasal ya da mekanik teknikler: Bunlar genellikle ya olarak sınıflandırılabilir. Viral teknikleri, viral vektörleri 1 kullanarak, RNA ve DNA gibi genetik malzemeyi transfekte olabilir. Viral teknikleri ancak bunlar immün ve enflamatuar reaksiyonlar 2 için potansiyel var, bazı hücre kuşaklarında yüksek verimliliğe sahip olma eğilimindedir. Genel kimyasal transfeksiyon yöntemleri, kalsiyum fosfat 3, 4 bakteriyel ekzotoksin ve lipofeksiyon 5 ile çökelmesini içerir. Bu teknikler etkili olduğu kanıtlanmıştır, ancak bazı sorunlar, hücre toksisitesi ve non-özgüllük olarak ortaya çıkmaktadır. Ayrıca, bu tür kalsiyum fosfata gibi tekniklere nadiren çökelme primer hücrelerde 6, en fazla% 70, ancak sadece belli hücre hatlarında transfeksiyon verimliliği sahip olduğu tespit edilmiştir. Artan araştırma çabaları, özellikle klinik kullanımı ve DNA işleyişi çalışma için çeşitli tedaviler tasarımı durumunda, primer hücrelerin içine koymak ediliyor gibi bu notun olduğunu.
Mekanik uyarıcılara yoluyla hücre zarının zamansal bozulması hücre içine yabancı moleküllerin sokulması için bir alternatiftir. Teknikler şunlardır: molekül 7 mikroenjeksiyon, membran 8,9 bozmak için bir elektrik alanı kullanılarak elektroporasyon, sonoporation ile bağlı parçacıklar sürgünler "gen tabancası" ile gösterildiği gibi, hücre zarını, 10-12, partikül bombardımanı bozmak için ultrason dalgaları kullanarak hücrenin 13 içine genleri, ve son zamanlarda, memeli hücreleri geçici olarak 14,15 permeabilize gösterilmiştir akışkan kesme stresi uygulaması. Her ne kadar mekanikal yöntemleri yukarıda belirtilen sorunların bazılarını önlemek için, tipik olarak daha düşük verim ve son derece karmaşık ve uzman düzeneklerinin eşlik eder. Bir atmosferik basınçta ışıltılı tahliye meşale (APGD-t) yüzeyler işlevselleştirilmesiyle ve in vitro 16 yapışık hücreleri ayırmanın ilk hedefi ile McGill de geliştirilmiştir. Tesadüfen çok kullanılan canlı / ölü leke nasılsa bir geçirimli madde eklenmeden hücreleri tarafından alınan edildiğini keşfedildi. Ayrıca, bu sadece meşale yolu ile maç oldu kuyu kısıtlı alanlarda meydana gelmiş gibiydi. APGD-t permeabilization yetenekleri soruşturma devam etti ve kontrol çalışmaları, bu uyarımı olmadan plazma taşıyıcı atıl gaz püskürtüsü da permeabilize hücrelerin mümkün olduğu bulunmuştur. Bu plazma jeti tarafından oluşturulan reaktif türler geçici membran fonksiyonu bozulmuş ilk hipotezi çeliştiğini ve önerilen basit mekanik olduğunucal kuvvetler hücre geçirgenliği neden için yeterli idi. Buradan itibaren, çalışmalar denemek ve ölçmek ve Permeabilization inert gaz jetinin etkinliğin yanı sıra tranfeksiyon yetenekleri 16 bakmak karakterize bizim laboratuvarda devam etti.
Bu çalışmalar sayesinde, mikro-plazma membranında gerçek biçimde yapmak olduğu bulunmuştur ve bu gözeneklerin yaklaşık 5 saniye 15 içinde yeniden mühürlemek için eğilimindedir. Bir piliç embriyo koriyoalantoik zara in vitro ve in vivo olarak tekniğin yarar göstermiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. LabView Programının Geliştirilmesi
- Bir kütle akış kontrol cihazı (MKS M100B Mass-Flo Controller) kesin bir gaz akış oranı sağlamak için helyum gazı hattına bağlanmıştır. Bu birim, 0 ve 5 V LabView programındaki bir kontrol döngüsü herhangi bir zamanda gerekli voltaj tespit arasında değişen bir giriş gerilimi ile kontrol edilir. Bilgisayar ve arayüz arasındaki kütle akış kontrolörü bir veri toplama cihazı (NI USB-6009) tarafından gerçekleştirilen ve 12 V güç kaynağı kütle akış kontrol için güç sağlar.
- İki pozisyonlama lineer slaytlar 6-plaka, her yön için bir hareketini kontrol etmek için kullanılır. Her derleme bir adım motor ile birleştiğinde bir MA15 serisi Velmex Unislide Meclisi oluşur ve her iki meclisleri Motor Kontrol Stepping tek Velmex VXM tarafından kontrol edilir. Kontrolör, her motorun manuel koşu için izin verir veya harici seri bir komut kabul, kombinasyonu spesifik hareket p izinatterns. Çeşitli desenler sadece istenilen meşale hızı hem de yol boyutları sağlamak için kullanıcı gerektiren, LabView programa programlanabilir.
2. Ekipman hazırlanması
- Helyum silindiri ve regülatörü hem açın.
- Motor kontrol açın.
- LabView programını açın ve tüm koşullarını doğrulayın.
- Platform merkezli olduğundan emin olun. , Her kontrol motor aşamada bakmak ve her vagon aşama sonunda da yakın olmadığını doğrulamak için. Program merkezi arabaları ya da elle motor kontrol önündeki koşu denetimleri kullanarak ayarlayın ya.
- Bu günün ilk çalışma ise, kurulum düzgün çalıştığından emin olmak için, hücreleri olmadan bir kez programı çalıştırmak için tavsiye edilir.
3. Kılcal gaz püskürtüsü Nozul Yükseklik hazırlanması
- Tutucudan kılcal çıkarın ve yükseklik kadranı sıfır.
- 6-delikli plaka o yerleştirinn platformu.
- Değiştirin ve kapak kayma edecek kadar kuyunun dibine gaz jet kılcal daha düşük. Tutucuya kılcal elde edin.
- Yükseklik kadranının kullanılması, kılcal 3 mm yükseltmek. Kılcal bazında bu yüksekliğe işaretleyin.
- Güvenli bir yüksekliğe kılcal kaldırın ve daha sonra 6-çukurlu plaka çıkarın.
4. Hücre Permeabilization Protokol
- Cam kapak üzerinde izdiham Kültür yapışkan hücre hattı, standart kültür teknikleri kullanılarak, 6-çukurlu bir plaka içerisinde kayar. HeLa hücreleri için, tohum 6-çukurlu, oyuk başına 2 x 10 5 hücre plakaları ve tedavi öncesi 48 saat için inkübe edilir.
- İstenen vektörü içeren çözeltinin uygun hacmi hazırlayın. HrGFPII-1, 1 x PBS içinde 50 ng / ul 'lik bir konsantrasyon HeLa hücrelerinde güçlü bir floresan sinyali transfeksiyondan sonra 24 saat için, içerir. Dekstran çalışmaları için, 10 kDa, yeşil fluoresan dekstran 80 ug / ml önerilir. Bundan sonra, bu çözelti, adlandırılacaktırs "vector çözüm".
- Kuyudan hücre kültürü ortamını çıkarın ve 1x PBS ile üç kez çalkalayın.
- Kuyuya aşama 4.2 'de hazırlanan vektör çözeltisi 1.370 ul Pipet. Bu, yaklaşık 1.3 mm'lik bir derinliğe sıvı ile sonuçlanmalıdır.
- Platformun merkezinde vektör çözeltisi içeren kuyu yerleştirin. Sürgünün üzerinde 3 mm'lik bir meme yüksekliğinin gösteren önceden işaretli seviyeye gaz püskürtme memesi indirin.
- LabView programında helyum akış hızını ayarlamak ve kullanılacak istenilen hareket desen seçin. Zaman Permeabilization protokolü başlamak için hazır "Çalıştır" seçeneğini seçin. Kütle akış kontrol cihazı için gerekli akış oranını temin etmek üzere hazırlanıyor sırasında bir ilk gecikme süresi olacaktır. Uygun akış hızı ulaşıldığında, LabVIEW programı istenen permeabilization desen iyi hareket için kademeli motora aktive edecektir. Platformu durduktan sonra, yaklaşık 30 saniye bekleyin ve vektör çözüm kaldırmak.Not: Optimal permeabilizasyon kılcal çapına bağlı olarak, meme çıkışında 100-200 Pa bir dinamik basınç yakınında meydana gelir.
- 1x PBS ile de üç kez yıkayın.
- Taze kültür ortamı ile iyi doldurun.
- Deneylerin istenilen sayıda 4.6 - 4.3 adımları tekrarlayın. Not: onlar üzerinde yürütülüyor gaz jetsız vektör çözümü ile dolu olan kuyuların oluşmaktadır kontrol örnekleri yer alıyor emin olun. Adımlara 4.5 ve 4.6 için devam yaklaşık olarak 1 dakika boyunca, kontrol çukurlarındaki çözelti bırakın.
- Bir hrGFP transfeksiyon deneyi çalışan ise, transfekte edilmiş hücreler tarafından malzeme transkripsiyonu izin vermek için 24 saat boyunca inkübatör 6-çukurlu plaka döndürür. Bir dekstran permeabilizasyon deney çalışan takdirde, yaklaşık 15 dakika boyunca inkübatör 6-çukurlu plaka döndürür.
5. Hücre Görüntüleme
- İsterseniz, hemen önce görüntüleme, hücre ölümünü değerlendirmek için uygun ölü / canlı leke ile counterstain.
- Approp ile Görüntü hücrelertransfeksiyon / permeabilizasyon etkinliğini araştırmak için yaklaşımlarına yön mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir 0.86 mm iç çap kapiller ile bir helyum gaz püskürtüsünün kullanılarak 10 kDa yeşil floresan dekstran ile HeLa hücre Permeabilization Şekil 1 'de gösterilmiştir. Hücreler hemen hücre ölümünü görselleştirmek için 2 ul / ml EthD-1 çözeltisi (LIVE / DEAD Canlılık / Sitotoksite Kit) ile geçirgenleştirmeden sonra zıt. Hemen counterstaining ardından, kapak fişleri monte edilmiş ve görüntülenmiştir. Bu şekil, bir kontrol numunesi ile karşılaştırıldığında, üç farklı çıkış basınçlarda helyum gaz püskürtüsünün çalışan sonuçlarını göstermektedir. Permeabilization iz genişliği ve verimliliği sadece hafif bir artış (A ve B) gösterdi yüksek bir dinamik basınç ve hücre ölümü ile arttığını unutmayın. Yüksek dinamik basınç ulaşıldı Ancak, bir kez HeLa hücreleri kapak fişleri çıkarılır ve çok az çevresel permeabilizasyon meydana geldi. Hücre sıyırma ve transfeksiyon verimliliği daha ayrıntılı bir analizi daha önce Chouinard tarafından yapılmıştır-Pelletier et al. 15
Taramalı elektron mikroskopisi çalışmaları ile, mikro-hücre zarı (Şekil 2) gözlendi. HeLa hücre Permeabilization permeabilization protokol izlenerek 300 Pa arasında bir basınçta bir çıkış 0.86 mm iç çap kapiller ile bir helyum gaz püskürtüsünün kullanılarak gerçekleştirilmiştir, hücreler hemen 1x PBS içinde bir% 1 paraformaldehit çözeltisi ile tespit edildi.
Şekil 1. 0.86 mm kadar bir kılcal meme iç çapı olan bir helyum gaz püskürtüsünün kullanılarak 10 kDa yeşil floresan dekstran ile HeLa hücre Permeabilization. Dextran yeşil ve ölü hücreler 100 Pa kırmızı. A) dinamik basıncı, B) 135 Pa ve C floresan fluoresces dekstranla) 175 Pa D) Kontrol b eklendihelyum gaz püskürtmesi için poz ut.
Şekil 2. 300 Pa A) düz bir hücre yüzey sergileyen Kontrol numunesi. B), bir 84 nm gözenek çapı olan bir sergileyen permeabilize hücre yüzeyinde gaz püskürtüsü geçirgenliği, aşağıdaki HeLa hücre yüzeyinin 50,000 X büyütmede bir SEM ve görüntüler. için tıklayın büyük rakam görmek .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Inert gaz jet permeabilizasyon yapışık hücre transfeksiyonu için yararlı bir tekniktir. Bu, zararlı kimyasal maddeler ya da viral vektörler için olan ihtiyacı ortadan kaldırır mekanik kuvvetlerin kullanımı ile hücrelere biyomoleküllerin aktarma yeteneği sağlar. Teknik potansiyel araştırmacılara ve klinisyenlere hassas hücreleri transfect verimli ve nispeten basit bir yol verebilir. Nüfuziyet seçiciliği de araştırmacılar sadece çok uygulamalarda yararlı olabilir, tek bir koloni bazı hücreleri tedavi etmek için izin benzersizdir.
Çeşitli parametreleri, kılcal meme çapı ve açısı, gaz akış hızı, sıvı ve kılcal yükseklik, hücre hattı, kullanılmak üzere hedef biyomolekülün, ve atıl gaz türü olarak deney için ayrı ayrı ayarlanabilir. Bir dizi sıvı seviyesi ve kılcal yükseklik prosedüründe tarif edilmiştir ve bu değerler bizim experime katılan değişkenlerin sayısını en aza indirmek için seçilmiştirNTS. Şu anda, deneysel akış görselleştirme ve hesaplamalı akışkanlar dinamiği sistemi modelleme. Bu bize böyle sıvı özellikleri gibi değişkenler üzerindeki permeabilization bağımlılığını belirlemek için izin, bize hücrelerde kazandırdığı kuvvetlerin daha iyi anlaşılmasını sağlayacaktır.
Bu hücrelerin hayatta hangi altında maksimum dinamik basınç dikkate almak önemlidir. Bu bir kez dinamik basıncı 3 mm arasında bir gaz püskürtme memesi yüksekliği 200 Pa yaklaştığında olduğu bulunmuştur, HeLa hücre sıyırma muhtemelen oldu. Bu, Lu ve diğ gibi diğer çalışmalar ile kabul eder. 200-265 Pa 17 WT NR6'dır fibroblast hücre dekolmanı gözlendi kim. Sıyırma büyük miktarda meydana gelirse, düşük gaz akış hızı, bu sorunu hafifletmek gerekir. Benzer şekilde, yüksek akış oranları hücre ölümü ve yanlış pozitif permeabilizasyon sonuçlara yol. Hücrelerin ölmüş kez onlar moleküllere geçirgen olacak ve bu nedenle ölü hücreler permeabilize canlı hücreler için yanlış olabilir. Obu nedenle permeabilize hücrelerin aslında hala hayatta olduğundan emin olmak için bir ölü / canlı deneyi yürütmek için tavsiye edilir. Artan basınç ve bizim laboratuvar ile ölüm artar 390'dan Pa permeabilize HeLa hücrelerinin çoğunluğu 15 ölü olduğunu bulmuşlardır. Uzun bir süre boyunca Hücre canlılığı, aynı zamanda 72 saat post-nüfuziyet (veriler gösterilmemiştir) kadar gözlenmektedir hrGFPII-1 ifadesi ile araştırılmıştır. Daha ileri çalışmalar daha uzun zaman noktalarında canlılığı incelemek için halen devam.
Hipotezimiz gaz püskürtüsü ile medya değiştirmesi ile ortaya çıkan hücreleri üzerinde sıvı kayma gerilmeleri, hücre plazma zarının geçici olarak bozulmasına neden olmasıdır. Bu, mikro-kabarcık dağılması ve sonoporation 18 gibi diğer daha karmaşık fiziksel yöntemler için önerilen aynı mekanizmadır. Bu yöntem için çalışma koşulları, alt-tabaka, hücrenin mekanik özellikleri hücreleri, bağlantı tipine bağlıdırve hücre duvarı, ilgi molekülü, sıvı ve gaz özellikleri ve kurulum fiziksel boyutları. Boyut dışlama çalışmaları sayesinde, 40 kDa'dan daha büyük dekstran molekülleri optimal dekstran boyutu 15 deney boyunca 10 kDa olduğu çok düşük permeabilizasyon etkinliğini göstermek ve bulduk. Bu protokol kullanılarak hücrelere geçirgen olabilir molekül boyutunu sınırlar olarak önemlidir. Şimdiye kadar, sadece plazmidlerin transfeksiyon özelliklerini araştırdık. Daha ileri çalışmalar, genetik materyalin büyük parçalar bu tekniği kullanılarak transfekte olma yeteneğine sahip olup olmadığını tespit edecektir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarları var beyan.
Acknowledgments
Kanada Sağlık Araştırma Enstitüleri (CIHR), Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi (NSERC): Yazarlar aşağıdaki finansman kaynaklarını teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vitality hrGFPII-1 | Agilent Technologies Canada | 240143-57 | Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells |
| Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | Life Technologies Inc. | D22910 | dextran for permeabilization experiments |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies Inc. | L3224 | for counterstaining of mammalian cells |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | for mounting slides when imaging |
| Ultra High Purity Helium | Praxair Canada Inc. | HE 5.0UH-T | |
| Hyclone DMEM/ High Glucose Media - 500 ml | Thermo Scientific | SH30022.01 | for HeLa cells |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 26140079 | For DMEM media |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | For DMEM media |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x | Produced in lab | ||
| Table 1. List of required reagents | |||
| 6-Well Clear TC-Treated Microplates | Corning | 3506 | |
| #1 22 x 22 Coverslips | Fisher | 12-542B | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | WPI Sizing Information | |
| ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100 | |||
| Mass-Flo Controller | MKS | M100B01314CS1BV | Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply |
| USB-6009 DAQ Device | National Instruments | 779026-01 | |
| UniSlide Assembly with stepping motor and controller | Velmex | Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller | |
| Table 2. List of required equipment |
References
- Rosenberg, S. A., et al. Gene transfer into humans--immunotherapy of patients with advanced melanoma, using tumor-infiltrating lymphocytes modified by retroviral gene transduction. The New England Journal of Medicine. 323, 570-578 (1990).
- Yang, Y., et al. Cellular immunity to viral antigens limits E1-deleted adenoviruses for gene therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91, 4407-4411 (1994).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Molecular and cellular biology. 7, 2745-2752 (1987).
- Walev, I., et al. Delivery of proteins into living cells by reversible membrane permeabilization with streptolysin-O. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3185-3190 (2001).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 7413-7417 (1987).
- Hamm, A., Krott, N., Breibach, I., Blindt, R., Bosserhoff, A. K. Efficient transfection method for primary cells. Tissue engineering. 8, 235-245 (2002).
- Rauth, S., Kucherlapati, R. S. Expression of DNA Transferred into Mammalian-Cells. J. Bioscience. 6, 543-567 (1984).
- Spandidos, D. A. Electric field-mediated gene transfer (electroporation) into mouse Friend and human K562 erythroleukemic cells. Gene analysis techniques. 4, 50-56 (1987).
- Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Research. 15, 1311-1326 (1987).
- Fechheimer, M., et al. Transfection of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonication loading. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84, 8463-8467 (1987).
- Koch, S., Pohl, P., Cobet, U., Rainov, N. G. Ultrasound enhancement of liposome-mediated cell transfection is caused by cavitation effects. Ultrasound in Medicine & Biology. 26, 897-903 (2000).
- Greenleaf, W. J., Bolander, M. E., Sarkar, G., Goldring, M. B., Greenleaf, J. F. Artificial cavitation nuclei significantly enhance acoustically induced cell transfection. Ultrasound in Medicine & Biology. 24, 587-595 (1998).
- Yang, N. S., Burkholder, J., Roberts, B., Martinell, B., McCabe, D. In vivo and in vitro gene transfer to mammalian somatic cells by particle bombardment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 87, 9568-9572 (1990).
- Hallow, D. M., et al. Shear-induced intracellular loading of cells with molecules by controlled microfluidics. Biotechnology and Bioengineering. 99, 846-854 (2008).
- Chouinard-Pelletier, G. L., Guay, M., Coulombe, D., Leask, S., L, R., Jones, E. Use of inert gas jets to measure the forces required for mechanical gene transfection. Biomedical Engineering Online. 11, (2012).
- Leduc, M., Coulombe, S., Leask, R. L. Atmospheric Pressure Plasma Jet Deposition of Patterned Polymer Films for Cell Culture Applications. Ieee T. Plasma Sci. 37, 927-933 (2009).
- Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Analytical Chemistry. 76, 5257-5264 (2004).
- Sankin, G. N., Yuan, F., Zhong, P. Pulsating tandem microbubble for localized and directional single-cell membrane poration. Physical Review Letters. 105, 078101 (2010).
