Summary
このプロトコルは、不活性ガスジェットを用いた接着細胞の一時的な透過化のための方法を記載している。この技術は、原形質膜を破壊する機械的な力を利用することにより接着性哺乳動物細胞への遺伝物質および生体分子の移動を容易にする。
Abstract
様々な細胞トランスフェクション技術が存在し、これらは3つのカテゴリーに分けることができます：ウイルス、化学的および機械的。このプロトコルは、時間的に細胞内に通常は非透過性の巨大分子の伝達を容易にすることができる不活性ガスジェットを用いて付着細胞を透過性にするための機械的方法を記載する。我々は、この技術は、マイクロポアの一時的な形成をもたらす、接着細胞の原形質膜上に剪断力を付与することによって機能すると考えている。これらの孔が作成されると、次いで、細胞を遺伝物質および他の生体分子に対して透過性である。関係する機械的な力は、その基板から完全に損傷または取り外し細胞のリスクを実行します。技術が有効である不活性気体力学の狭い範囲は、したがって、存在する。不活性ガスジェットは、HeLa、HEK293およびヒト腹部大動脈内皮細胞を含む種々の接着性細胞株を効率的に透過性であることが証明されている。このプロトコルは、Pに適しています我々は、研究のために、潜在的に将来の臨床用途に使用することができる示し、 インビボで実証したように、両方のin vitroでの接着細胞のermeabilizationと、。また、貴重な研究ツールであることを証明する可能性が、空間的に限定的に細胞を透過性という利点があります。
Introduction
生物医学の進化と細胞の力学を理解し、細胞への生体分子の送達は、多くの研究分野や医学療法に不可欠となっています。異なる技術は、原形質膜を通って細胞サイトゾル内に外来分子を導入するために開発されてきた。ウイルス、化学的または機械的技術：これらは一般的にのいずれかとして分類することができる。ウイルス技術は、ウイルスベクター1を用いたRNAやDNAなどの遺伝物質をトランスフェクトすることができる。ウイルス技術は、しかしながら、それらは免疫および炎症反応の2の可能性を持っている、ある種の細胞株において高い効率を有する傾向がある。一般的な化学的トランスフェクション法は、リン酸カルシウム3、細菌外毒素4とリポフェクション5での沈殿が含まれています。これらの技術は有効であることが証明されているが、特定の問題は、細胞毒性および非特異性として生じる。さらに、このようなカルシウムのような技術phosphat電子沈殿はほとんどの初代細胞6に、最大70％までしか特定の細胞株においてトランスフェクション効率を有することが見出されている。これは、特に臨床用途およびDNAの機能の研究のための様々な治療を設計する場合には、一次細胞中に入れられている研究努力を増大させるように注目すべきである。
機械的刺激を介して細胞膜の一時的な破壊は、細胞に外来分子を導入するための代替手段である。技法としては、分子が7のマイクロインジェクション、膜8,9を破壊電界を用いてエレクトロポレーション、ソノポレーションが結合した粒子を撮影する「遺伝子銃」によって示されるように、細胞膜10-12、粒子ボンバードメントを破壊するために超音波を使用してセル13への遺伝子、およびより最近では、時間的に哺乳動物細胞を14,15を透過することが示されている流体せん断応力を印加する。メカニックもののらの方法は、前述の問題の一部を回避するため、それらは一般的に低い効率と、非常に複雑で専門的なセットアップを伴う。大気圧グロー放電トーチ（APGD-T）は、表面を機能化し、インビトロ 16 に付着した細胞を剥離の初期目標にマギルで開発されました。偶然、それが使用されている生/死染色は、何らかの形で浸透化剤が添加されずに細胞に取り込まれていたことが発見されました。さらに、これが唯一のトーチ·パスと一致するように起こった井戸の制限区域で発生しているように見えた。 APGD-tは透過処理能力の調査を継続し、コントロール研究においては、励起することなく、プラズマの不活性キャリアガスジェットはまた、細胞を透過することができたことがわかった。これは、プラズマジェットによって作成された反応種を一時的に膜の機能を損なわ初期仮説に矛盾を提示単にそのmechani校正力は、細胞透過を引き起こすのに十分であった。ここから、研究は試してみて、定量化し、透過処理、不活性ガスジェットの効率だけでなく、そのトランスフェクション能力16を見て特徴づけるために私たちの研究室で継続。
これらの研究を通して、それは微細孔が原形質膜における実際の形で行うことが見出されており、これらの孔は、約5〜15秒以内に再密封する傾向がある。我々は、ニワトリ胚の漿尿膜のin vitroおよびin vivoでの技術の有用性を実証した。
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Protocol
1。 LabVIEWプログラムの開発
- マスフローコントローラ（MKS M100Bマスフロコントローラ）は、正確なガス流量を確保するために、ヘリウムガスラインに取り付けられている。このユニットは、0から5 V.のLabViewプログラム内の制御ループは、任意の時点で必要な電圧を決定するの範囲の入力電圧によって制御される。コンピュータ及びマスフローコントローラ間のインタフェースは、データ収集装置（NIのUSB-6009）によって行われ、12 V電源は、マスフローコントローラに電力を提供する。
- 二つの位置決めリニアスライドを6ウェルプレート、各方向に1つの動きを制御するために使用される。各アセンブリは、ステッピングモータと連結MA15シリーズVelmex Unislideアセンブリで構成されており、両方のアセンブリは、モータコントローラステッピングシングルVelmex VXMによって制御されます。コントローラは、各モータのマニュアルジョギングを可能にし、または外部シリアルコマンドの文字列を受け取り、特定の動きPを可能にするとの組み合わせatterns。いくつかのパターンは、所望のトーチ速度と経路の寸法を提供するようにユーザに要求する、のLabViewプログラムにプログラムすることができる。
2。機材の準備
- ヘリウムボンベとレギュレータの両方を開きます。
- モータコントローラをオンにします。
- LabVIEWプログラムを開いて、すべての条件を確認してください。
- プラットフォームが中心となっていることを確認します。チェック各モータステージを見て、各キャリッジは、ステージ両端付近ではないことを確認します。プログラムセンター馬車持っているか、手動モータコントローラの前面にあるジョギングコントロールを使用して、どちらかの調整。
- これはその日の最初に実行された場合は、セットアップが正しく動作していることを確認するために、細胞なしで一度プログラムを実行することをお勧めします。
3。ガスジェットキャピラリーノズル高さの調製
- ホルダーから毛細血管を削除し、高さのダイヤルをゼロに。
- 6ウェルプレートを置きoをNプラットフォーム。
- それはカバーガラスに当たるまで井戸の底にガスジェットキャピラリーを交換し、下げます。ホルダーにキャピラリーを固定します。
- 高さのダイヤルを使用して、キャピラリー3ミリメートルを上げる。キャピラリーベースにこの高さをマーク。
- 安全な高さに毛細血管を上げた後、6ウェルプレートを取り外します。
4。細胞透過化プロトコル
- 標準的な培養技術を用いて6ウェルプレート中でガラスカバースリップ上でコンフルエント培養する接着細胞株。 HeLa細胞については、ウェル当たり2×10 5細胞で6ウェルプレートに播種し、処理の前に48時間インキュベートする。
- 所望のベクターを含有する溶液の適切なボリュームを準備します。 hrGFPII-1の場合は、1×PBS中50 NG /μLの濃度は、HeLa細胞にトランスフェクション後24時間後に強い蛍光シグナルを提供しています。デキストラン研究のために、10 kDaの緑色蛍光デキストランの80μg/ mlのをお勧めします。以後、この溶液と呼ぶことにするS「ベクター溶液」。
- ウェルから細胞培養培地を除去し、1×PBSで3回リンスする。
- 井戸にステップ4.2で調製したベクター溶液を1370μlのピペット。これは、約1.3ミリメートルの液体深さをもたらすはずである。
- プラットフォームの中心にベクター溶液を含む井戸を配置します。スライド上の3ミリメートルのノズル高さを示す以前にマークされたレベルにガスジェットノズルを下げます。
- のLabViewプログラム内のヘリウムの流量を設定し、使用する所望の移動パターンを選択。とき透過性プロトコルを開始する準備ができて「ファイル名を指定して実行」を選択してください。マスフローコントローラが、必要な流量を提供する準備をしている間、初期誘導期が存在することになる。適切な流量に達すると、のLabViewプログラムは、所望の透過性パターンでウェルを移動させるようにステッパモータを活性化するであろう。プラットフォームが停止すると、約30秒待ってから、ベクター溶液を除去。注：最適な透過性は、毛細管の直径に応じて、ノズル出口で100〜200 Paでの動圧の近くで発生する。
- 1X PBSでよく3回洗浄する。
- 新鮮な培養培地とよく埋める。
- 実験の目的の数の4.6 - を繰り返して4.3を繰り返します。注：それらの上で実行されているガスジェットずにベクター溶液が充填されたウェルで構成されて対照試料を含めるようにしてください。ステップ4.5および4.6に進み、その後、約1分間の対照ウェル内の溶液を残す。
- hrGFPのトランスフェクション実験を実行している場合は、トランスフェクトされた物質は、細胞によって転写されるように24時間インキュベーターに6ウェルプレートを返す。デキストラン透過性実験を実行している場合は、15分間インキュベーターに6ウェルプレートを返す。
5。細胞画像化
- 必要に応じて、すぐに画像化する前に、細胞死を評価するために、適切な生/死染色で対比染色。
- appropと画像セルトランスフェクション/透過化の有効性を調査するriate顕微鏡。
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Representative Results
0.86ミリメートルの内径を有する毛管ヘリウムガスジェットを用いた10kDaの緑色蛍光デキストランHeLa細胞の透過処理は、 図1に示されている。細胞は、細胞死を可視化する2μL/ mlののEthD-1溶液（生/死生存率/細胞毒性キット）で、すぐに透過処理した後に染色した。すぐに対比以下、カバースリップをマウントし、画像化した。この図は、対照試料と比較して、三つの異なる出口圧力でヘリウムガスジェットを実行した結果を示す。より高い動圧および細胞死に伴って増加透過性トラック幅と効率はわずかな増加（A及びB）を示したことに留意されたい。高ダイナミック圧力に達したしかし、一旦、HeLa細胞をカバーガラスから剥離し、非常に少ない周辺透過化が発生した。細胞ストリッピングおよびトランスフェクション効率のより詳細な分析は、以前はシュイナードにより行った-ペルティエら 15
走査型電子顕微鏡研究を介して、微細孔は、細胞膜（ 図2）で観察された。 HeLa細胞の透過化を透過化したプロトコルに従って300 Paの出口圧力で0.86ミリメートルの内径を有する毛管ヘリウムガスジェットを使用して実施し、細胞を直ちに1×PBS中の1％パラホルムアルデヒド溶液で固定した。
図1。 135 Paで0.86程度の毛細管ノズル内径ヘリウムガスジェットを用いた10kDaの緑色蛍光デキストランとHeLa細胞の透過化。デキストラン、緑及び死細胞は赤色の蛍光を発する蛍光を発する。A）が100Pa、Bの動的圧力）、およびCデキストラン）175ペンシルベニアDの）コントロールは、Bを追加しましたヘリウムガスジェットへの曝露をUTん。
図2。 300ペンシルベニアA）、滑らかな細胞表面を示す対照サンプル。B）84 nmの直径を有する細孔を示す透過化細胞の表面にガスジェット透過性を以下のHeLa細胞の表面50,000 Xの倍率でのSEM画像が 。 するには、ここをクリックしてください大きな画像を表示する 。
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Discussion
不活性ガスジェット透過化は、付着細胞のトランスフェクションのために有用な技術である。これは、潜在的に有害な化学物質又はウイルスベクターの必要性を排除する機械的な力の使用で細胞に生体分子を転送する能力を提供する。技術は、潜在的に研究者や臨床医に正確に細胞をトランスフェクトするための効率的かつ比較的簡単な方法を与えることができる。透過化の選択性はまた、研究者は、複数のアプリケーションのみに有用であり得る単一コロニー内の特定の細胞を処理することを可能に独特である。
いくつかのパラメータは、毛細管ノズルの直径及び角度、ガス流量、液体と毛管高さ、細胞株、使用する標的生体分子、及び不活性ガスの種類などの個々の実験のために調整することができる。セット液レベルおよび毛細管の高さが手順に記載されており、これらの値は、我々のexperimeに関与する変数の数を最小にするように選択されたNTS。現在、実験的な流れの可視化と数値流体力学を使用してシステムをモデリングしている。これは、私たちはこのような液性などの変数に透過性の依存関係を判断できるように、私たちの細胞に与え力のより良い理解が得られます。
これは、細胞が生存することができますその下で最大動圧メモを取ることが重要です。かつては、動的圧力が3mmのガスジェットノズル高さを200Paに近づいた、HeLa細胞剥離になった可能性が高いことが分かった。これは、200から265 Paで17 NR6でWT線維芽細胞の剥離を観察したLu らのような他の研究と一致する。ストリッピングの大量発生した場合、低いガス流量は、この問題を軽減するべきである。同様に、高流量は、細胞死および偽陽性透過化結果をもたらす。細胞が死亡していると、それらは分子に対して透過性になるので、死細胞は、透過化生細胞と間違われることができます。それしたがって、透過処理した細胞は、実際にはまだ生きていることを保証するために生/死アッセイを行うことをお勧めします。圧力の増加と私たちの研究室で死亡が増加して390 Paに透過処理HeLa細胞の大多数は15死んでいたことがわかった。長期間にわたって細胞の生存率も72時間後に透過化（データ示さず）まで観察さhrGFPII-1発現と、検討されている。さらなる研究は、さらに長い時点で生存率を調査するために現在進行中である。
我々の仮説は、ガスのジェットと媒体の変位によって作成された細胞上の流体せん断応力は、細胞原形質膜の一時的な中断を引き起こすことである。これは、マイクロバブルの崩壊とソノポレーション18のような他のより複雑な物理的方法のために提案されたのと同じメカニズムです。この方法のための操作条件は、細胞の機械的特性、基板への付着細胞の種類に依存するおよび細胞壁、目的の分子、液体と気体の性質、およびセットアップの物理的な寸法。サイズ排除の研究を通じて、我々は40kDaのより大きいデキストランの分子が最適なデキストランサイズは、実験15、10 kDaであることを非常に低い透過処理効率を示し、ことを発見した。それは、このプロトコルを用いて細胞に透過処理することができる分子の大きさを制限するので、これは重要である。これまでのところ、我々は唯一のプラスミドのトランスフェクション特性を調査した。さらなる研究は、遺伝物質の大きな片は、この技術を用いてトランスフェクトされることが可能であるかどうかを確認します。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係はありません宣言します。
Acknowledgments
カナダ衛生研究所（CIHR）、自然科学と工学研究評議会（NSERC）：著者は、次の資金源に感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vitality hrGFPII-1 | Agilent Technologies Canada | 240143-57 | Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells |
| Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | Life Technologies Inc. | D22910 | dextran for permeabilization experiments |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies Inc. | L3224 | for counterstaining of mammalian cells |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | for mounting slides when imaging |
| Ultra High Purity Helium | Praxair Canada Inc. | HE 5.0UH-T | |
| Hyclone DMEM/ High Glucose Media - 500 ml | Thermo Scientific | SH30022.01 | for HeLa cells |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 26140079 | For DMEM media |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | For DMEM media |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x | Produced in lab | ||
| Table 1. List of required reagents | |||
| 6-Well Clear TC-Treated Microplates | Corning | 3506 | |
| #1 22 x 22 Coverslips | Fisher | 12-542B | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | WPI Sizing Information | |
| ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100 | |||
| Mass-Flo Controller | MKS | M100B01314CS1BV | Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply |
| USB-6009 DAQ Device | National Instruments | 779026-01 | |
| UniSlide Assembly with stepping motor and controller | Velmex | Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller | |
| Table 2. List of required equipment |
References
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