Summary
Ce protocole décrit un procédé pour la perméabilisation temporaire de cellules adhérentes au moyen d'un jet de gaz inerte. Cette technique facilite le transfert de matériel génétique et de biomolécules dans des cellules de mammifères adhérentes par l'utilisation des forces mécaniques pour rompre la membrane de plasma.
Abstract
Diverses techniques de transfection cellulaire existent et peuvent être décomposés en trois grandes catégories: virale, chimiques et mécaniques. Ce protocole décrit un procédé mécanique pour perméabiliser les cellules adhérentes dans le temps au moyen d'un jet de gaz inerte qui peut faciliter le transfert de macromolécules normalement non-perméables dans des cellules. Nous croyons que cette technique fonctionne en transmettant des forces de cisaillement sur la membrane plasmique des cellules adhérentes, ce qui entraîne la formation de micropores temporaire. Une fois que ces pores sont créés, puis les cellules sont perméables à du matériel génétique et d'autres biomolécules. Les forces mécaniques impliquées ne courent le risque de cellules en permanence endommager ou de détachement de leur support. Il est, par conséquent, une gamme étroite de la dynamique des gaz inertes où la technique est efficace. Un jet de gaz inerte, s'est avérée efficace pour la perméabilisation de diverses lignées cellulaires adhérentes, y compris les cellules HeLa, HEK293 et des cellules endotheliales aortiques abdominaux humains. Ce protocole est approprié pour la permeabilization de cellules adhérentes à la fois in vitro et, comme nous l'avons démontré, in vivo, montrant qu'il peut être utilisé pour la recherche et potentiellement dans de futures applications cliniques. Il a aussi l'avantage de perméabilisation des cellules d'une manière restrictive l'espace, ce qui pourrait s'avérer un précieux outil de recherche.
Introduction
Avec l'évolution de la biomédecine et la compréhension de la mécanique des cellules, la livraison de biomolécules dans les cellules est devenu vital pour de nombreux domaines de recherche et les traitements médicaux. Différentes techniques ont été mises au point pour introduire les molécules étrangères à travers la membrane plasmique et dans le cytosol de la cellule. Ceux-ci peuvent généralement être classés comme étant soit: techniques virales, chimiques ou mécaniques. Techniques virales peuvent transfecter matériel génétique tel que l'ARN et de l'ADN en utilisant des vecteurs viraux 1. Techniques virales ont tendance à avoir des rendements élevés dans certaines lignées cellulaires, mais ils ont le potentiel pour les réactions immunitaires et inflammatoires 2. Procédés de transfection chimique communs comprennent la précipitation au phosphate de calcium 3, les exotoxines bactériennes 4 et 5 lipofection. Ces techniques se sont révélées être efficaces, cependant, certains problèmes se posent tels que la toxicité cellulaire et la non-spécificité. En outre, des techniques telles que phosphat de calciume précipitations ont été trouvés pour avoir des efficacités de transfection allant jusqu'à 70%, mais seulement dans certaines lignées cellulaires, rarement dans des cellules primaires 6. C'est la note que l'augmentation des efforts de recherche sont mis dans des cellules primaires, en particulier dans le cas de la conception de divers traitements pour une utilisation clinique et l'étude du fonctionnement de l'ADN.
Perturbation temporelle de la membrane cellulaire par l'intermédiaire des stimuli mécaniques est une alternative pour introduire des molécules dans des cellules étrangères. Les techniques comprennent: une micro-injection des molécules 7, électroporation en utilisant un champ électrique pour rompre la membrane de 8,9, sonoporation utilisant des ondes ultrasonores pour perturber la membrane cellulaire de 10 à 12, le bombardement de particules tel que démontré par le «canon à gènes», où l'on tire des particules liées avec gènes dans la cellule 13, et, plus récemment, l'application d'une contrainte de cisaillement de fluide qui a été montré pour perméabiliser des cellules de mammifères 14,15 temporellement. Bien que mécanicienméthodes al éviter certains des problèmes mentionnés ci-dessus, ils sont généralement accompagnés par une efficacité moindre et des configurations très complexes et spécialisés. Une torche à décharge luminescente à la pression atmosphérique (APGD-t) a été développé à l'Université McGill dans le but initial de la fonctionnalisation de surfaces et de détacher les cellules adhérentes in vitro 16. Par un heureux hasard, il a été découvert qu'une tache vivants / morts a été utilisé en quelque sorte d'être pris en charge par les cellules sans agent de perméabilisation est ajouté. En outre, cela semblait n'avoir eu lieu que dans les zones réglementées des puits qui ont eu lieu à correspondre avec le chemin de la torche. Enquête sur les capacités de perméabilisation de la APGD-t continué et dans les études de contrôle, il a été constaté que le support inerte jet de plasma sans excitation de gaz a également été en mesure de perméabiliser les cellules. Cela contredit l'hypothèse initiale selon laquelle les espèces réactives créées par le jet de plasma perturbés temporairement la fonction de la membrane et a suggéré que simplement les mécaques forces étaient suffisantes pour provoquer la perméabilisation de la cellule. De là, les études poursuivies dans notre laboratoire pour tenter de quantifier et de caractériser l'efficacité de perméabilisation d'un jet de gaz inerte ainsi que regarder ses capacités de transfection 16.
Grâce à ces études, il a été trouvé que des micropores font sous forme de fait dans la membrane plasmique, et ces pores ont tendance à refermer au sein d'environ 5 sec 15. Nous avons démontré l'utilité de la technique in vitro et in vivo dans la membrane chorioallantoïque d'un embryon de poulet.
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Protocol
Une. Programme de développement des LabView
- Un régulateur de débit massique (MKS M100B Mass-Flo Controller) est fixée à la conduite de gaz d'hélium à assurer un débit de gaz précis. Cette unité est commandée par une tension d'entrée, compris entre 0 et 5 V. Une boucle de commande dans le programme de LabView détermine la tension requise à un moment donné. L'interfaçage entre l'ordinateur et le contrôleur de débit massique est exécutée par un dispositif d'acquisition de données (NI USB-6009), et une alimentation électrique de 12 V alimente le régulateur de débit massique.
- Deux coulisseaux de positionnement linéaires sont utilisés pour contrôler le mouvement de la plaque à 6 puits, une pour chaque direction. Chaque ensemble se compose d'un MA15-série Velmex Assemblée Unislide couplé avec un moteur pas à pas, et les deux assemblées sont contrôlées par un seul Velmex VXM Stepping Motor Controller. Le dispositif de commande permet de pulser manuel de chaque moteur ou accepte une chaîne de commandes série externes, dont la combinaison permet de mouvement p spécifiqueConstantes. Plusieurs modèles peuvent être programmées dans le programme de LabView, obligeant l'utilisateur à ne fournir que la vitesse de la flamme désirée, ainsi que les dimensions de trajectoire.
2. Préparation de l'équipement
- Ouvrez la fois la bouteille d'hélium et le régulateur.
- Mettre en marche le dispositif de commande du moteur.
- Ouvrez le programme LabView et vérifier toutes les conditions.
- Assurez-vous que la plate-forme est centrée. Pour vérifier, regardez à chaque étape de moteur et vérifier que chaque chariot n'est pas près de chaque extrémité de la scène. Soit que le centre du programme, les voitures de régler manuellement ou en utilisant les contrôles de jogging sur le devant de la commande de moteur.
- Si c'est la première course de la journée, il est recommandé d'exécuter le programme une fois sans cellules, pour assurer l'installation fonctionne correctement.
3. Préparation de la hauteur capillaire Jet Nozzle Gas
- Retirez le capillaire du support et zéro la molette de hauteur.
- Placez le 6 puits plaque on la plate-forme.
- Remplacer et abaisser le capillaire du jet de gaz au fond du puits, jusqu'à ce qu'il frappe la lamelle. Fixer le capillaire dans le support.
- Utilisation de la molette de hauteur, augmenter le capillaire 3 mm. Marquer cette hauteur sur la base capillaire.
- Soulevez le capillaire à une hauteur sécuritaire, puis retirez la plaque de 6 puits.
4. Cellule Protocole perméabilisation
- Culture lignée de cellules adhérentes jusqu'à confluence de la couverture de verre glisse dans une plaque à 6 puits en utilisant des techniques de culture standard. Pour les cellules HeLa, semences plaques de 6 puits avec 2 x 10 5 cellules par puits et incuber pendant 48 heures avant le traitement.
- Préparer une quantité appropriée de la solution contenant le vecteur désiré. Pour hrGFPII-1, une concentration de 50 ng / ul dans du PBS 1x fournit un fort signal de fluorescence dans les cellules HeLa 24 heures après la transfection. Pour les études de dextrane, de 80 pg / ml de 10 kDa dextran fluorescent vert est recommandée. Désormais, cette solution sera soumise à uns "de la solution de vecteur".
- Retirer milieux de culture cellulaire de bien rincer et trois fois avec PBS 1x.
- Pipeter 1370 pi de solution de vecteur préparés à l'étape 4.2 dans le puits. Il devrait en résulter une profondeur de liquide d'environ 1,3 mm.
- Placer le puits contenant la solution de vecteur au centre de la plate-forme. Abaisser la buse d'éjection de gaz au niveau préalablement marquée indiquant une hauteur de buse de 3 mm au-dessus du coulisseau.
- Réglez le débit d'hélium dans le programme LabView et sélectionnez le modèle de mouvement désiré à être utilisé. Sélectionnez "Exécuter" lorsque vous êtes prêt à commencer le protocole de perméabilisation. Il y aura une période initiale de latence au cours de laquelle le contrôleur de débit massique se prépare à fournir le débit nécessaire. Une fois que le débit d'écoulement approprié a été atteint, le programme de LabView va activer les moteurs pas à pas pour déplacer le puits dans le modèle de perméabilisation souhaitée. Une fois la plate-forme s'est arrêté, attendre environ 30 secondes et retirer la solution de vecteur.Remarque: perméabilisation optimale se produit à proximité d'une pression dynamique de 100 à 200 Pa à la sortie de la buse, en fonction du diamètre du capillaire.
- Lavez bien trois fois avec PBS 1x.
- Remplissez bien avec milieu de culture frais.
- Répétez les étapes 4.3 à 4.6 pour le nombre désiré d'expériences. Remarque: Assurez-vous d'inclure des échantillons de contrôle qui consistent en des puits étant remplis avec la solution de vecteur sans le jet de gaz est de fonctionner sur eux. Laissez la solution dans les puits de contrôle pendant environ 1 min, puis suivez les étapes 4.5 et 4.6.
- Si l'exécution d'une expérience de transfection hrGFP, retourner la plaque de 6 puits à l'incubateur pendant 24 heures pour permettre au matériau transfectées pour être transcrit par les cellules. Si l'exécution d'une expérience de perméabilisation dextran, retourner la plaque de 6 puits à l'incubateur pendant 15 min.
5. Imagerie cellulaire
- Si vous le souhaitez, immédiatement avant l'imagerie, de contraste avec tache direct / morts approprié pour évaluer la mort cellulaire.
- cellules d'image avec appropmicroscope riés d'enquêter transfection / perméabilisation efficacité.
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Representative Results
La perméabilisation de cellules HeLa avec 10 kDa de dextran fluorescent vert à l'aide d'un jet de gaz d'hélium avec un capillaire de diamètre intérieur de 0,86 mm est représenté sur la figure 1. Les cellules ont été contre immédiatement après perméabilisation avec 2 pl / ml EthD-1 solution (LIVE / DEAD viabilité / cytotoxicité Kit) pour visualiser la mort cellulaire. Immédiatement après une contre-coloration, lamelles ont été montées et imagés. Cette figure montre les résultats d'exploitation du jet de gaz d'hélium à trois pressions de sortie différents par rapport à un échantillon témoin. Notez que la perméabilisation largeur et l'efficacité piste augmenté avec une pression dynamique plus élevée et la mort cellulaire seulement a montré une légère augmentation (A et B). Cependant, une fois la pression dynamique élevée a été atteinte, les cellules HeLa ont été enlevés des lamelles et très peu de perméabilisation périphérique attribués. Une analyse plus détaillée de décapage de la cellule et de l'efficacité de transfection a été préalablement menée par Chouinard-Pelletier et al. 15
Grâce à des études de microscopie électronique à balayage, ont été observés dans les micropores de la membrane cellulaire (figure 2). La perméabilisation de cellules HeLa a été réalisée à l'aide d'un jet de gaz d'hélium avec un 0,86 mm capillaire de diamètre interne à une pression de sortie de 300 Pa. En suivant le protocole de perméabilisation, les cellules sont immédiatement fixées avec une solution de paraformaldéhyde à 1% dans du PBS 1X.
Figure 1. La perméabilisation de cellules HeLa avec 10 kDa de dextran fluorescent vert à l'aide d'un jet de gaz d'hélium avec une buse capillaire de diamètre intérieur de 0,86 mm. Dextran fluorescent cellules vertes et mortes fluorescence rouge. A) une pression dynamique de 100 Pa, B) de 135 Pa, et C ) de 175 Pa. D) Contrôle dextran ajouté but pas d'exposition à jet d'hélium gazeux.
Figure 2. Images MEB à un grossissement de 50 000 X de la surface des cellules HeLa suivant jet perméabilisation de gaz de 300 Pa. A) échantillon de contrôle présentant une surface des cellules musculaires lisses. B) Surface de cellule perméabilisée présentant un pore d'un diamètre de 84 nm. Cliquez ici pour agrandir la figure .
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Discussion
Jet de gaz inerte perméabilisation est une technique utile pour la transfection de cellules adhérentes. Il offre la possibilité de transférer des biomolécules dans des cellules à l'aide de forces mécaniques, ce qui élimine le besoin pour des produits chimiques potentiellement nocives ou des vecteurs viraux. La technique pourrait permettre aux chercheurs et aux cliniciens un moyen efficace et relativement simple pour la transfection des cellules précisément. La sélectivité de la perméabilisation est également unique permettant aux chercheurs de ne traiter que certaines cellules dans une colonie unique qui pourrait être utile dans des applications multiples.
Plusieurs paramètres peuvent être ajustés pour l'expérimentation individuel, tel que le diamètre de la buse capillaire et de l'angle, la vitesse d'écoulement de gaz, de liquide et de la hauteur capillaire, une lignée cellulaire, biomolécule cible doit être utilisé, et le type de gaz inerte. Un jeu de niveau de liquide et la hauteur capillaire ont été décrits dans la procédure, et ces valeurs ont été choisies pour réduire au minimum le nombre de variables impliquées dans notre experiments. Actuellement, nous modélisons le système en utilisant la visualisation d'écoulement expérimentale et dynamique des fluides computationnelle. Cela nous donnera une meilleure compréhension des forces appliquées sur les cellules, ce qui nous permet de déterminer la dépendance de la perméabilisation de variables telles que les propriétés des liquides.
Il est important de prendre note de la pression dynamique maximale en vertu de laquelle les cellules peuvent survivre. Il a été constaté que les pressions dynamiques approchaient une fois 200 Pa pour une hauteur de la buse à jet de gaz de 3 mm, de cellules HeLa décapage devient probable. Ceci est en accord avec d'autres études comme Lu et al. Qui a observé le détachement des cellules de fibroblastes WT RN6 à 200-265 Pa 17. Si de grandes quantités de décapage se produisent, un débit de gaz plus faible devrait atténuer ce problème. De même, les vitesses d'écoulement élevées conduisent à la mort cellulaire et de perméabilisation de résultats faussement positifs. Une fois les cellules sont morts ils deviennent perméables à des molécules et donc les cellules mortes peuvent être confondus avec des cellules vivantes perméabilisées. IlIl est donc recommandé de procéder à un essai en direct / morts de veiller à ce que les cellules perméabilisées sont en fait toujours en vie. Décès augmente avec la pression croissante et de notre laboratoire ont constaté que 390 Pa la majorité des cellules HeLa perméabilisées étaient morts 15. La viabilité des cellules sur une période de temps prolongée a également été étudiée, avec hrGFPII-1 expression étant observée jusqu'à 72 heures après la perméabilisation (données non présentées). D'autres études sont actuellement en cours pour étudier la viabilité des points de temps encore plus longues.
Notre hypothèse est que les contraintes de cisaillement de fluide sur les cellules, créées par le jet de gaz et le déplacement de la presse, provoquent une interruption temporaire de la membrane plasmique de la cellule. Il s'agit du même mécanisme proposé pour les autres méthodes physiques plus complexes telles que des microbulles effondrement et sonoporation 18. Les conditions opératoires de ce procédé dépendent du type de cellules, la fixation sur le substrat, les propriétés mécaniques de la celluleet de la paroi cellulaire, molécule d'intérêt, les propriétés du liquide et du gaz, et les dimensions physiques de l'installation. Grâce à des études d'exclusion de taille, nous avons découvert que des molécules de dextrane supérieures à 40 kDa montrent une très faible efficacité de perméabilisation et une taille optimale de dextrane est de 10 kDa pour l'expérimentation 15. Ceci est important, car il limite la taille des molécules qui peuvent être dans des cellules perméabilisées en utilisant ce protocole. Jusqu'à présent, nous avons seulement étudié les propriétés de transfection de plasmides. D'autres études seront vérifier si les gros morceaux de matériel génétique sont capables d'être transfectées en utilisant cette technique.
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Disclosures
Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier les sources de financement suivantes: Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC), les Sciences naturelles et du Conseil de recherches en génie (CRSNG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vitality hrGFPII-1 | Agilent Technologies Canada | 240143-57 | Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells |
| Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | Life Technologies Inc. | D22910 | dextran for permeabilization experiments |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies Inc. | L3224 | for counterstaining of mammalian cells |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | for mounting slides when imaging |
| Ultra High Purity Helium | Praxair Canada Inc. | HE 5.0UH-T | |
| Hyclone DMEM/ High Glucose Media - 500 ml | Thermo Scientific | SH30022.01 | for HeLa cells |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 26140079 | For DMEM media |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | For DMEM media |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x | Produced in lab | ||
| Table 1. List of required reagents | |||
| 6-Well Clear TC-Treated Microplates | Corning | 3506 | |
| #1 22 x 22 Coverslips | Fisher | 12-542B | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | WPI Sizing Information | |
| ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100 | |||
| Mass-Flo Controller | MKS | M100B01314CS1BV | Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply |
| USB-6009 DAQ Device | National Instruments | 779026-01 | |
| UniSlide Assembly with stepping motor and controller | Velmex | Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller | |
| Table 2. List of required equipment |
References
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