Summary
Este protocolo describe un método para la permeabilización temporal de células adherentes utilizando un chorro de gas inerte. Esta técnica facilita la transferencia de material genético y biomoléculas en células de mamífero adherentes por la utilización de fuerzas mecánicas para romper la membrana de plasma.
Abstract
Existen diversas técnicas de transfección de células y éstas se pueden dividir tres grandes categorías: viral, químicas y mecánicas. Este protocolo describe un método mecánico para permeabilizar temporalmente las células adherentes utilizando un chorro de gas inerte que puede facilitar la transferencia de macromoléculas normalmente no permeables a las células. Creemos que esta técnica funciona impartiendo fuerzas de cizallamiento en la membrana plasmática de las células adherentes, resultando en la formación temporal de microporos. Una vez que se crean estos poros, las células son entonces permeable al material genético y otras biomoléculas. Las fuerzas mecánicas que intervienen no corren el riesgo de dañar permanentemente las células o se separe de su sustrato. No es, por lo tanto, una estrecha gama de dinámica de gases inertes donde la técnica es eficaz. Un chorro de gas inerte se ha demostrado su eficacia en la permeabilización de diversas líneas de células adherentes, incluidos HeLa, HEK293 y células endoteliales de aorta abdominal humanos. Este protocolo es apropiado para el permeabilization de células adherentes, tanto in vitro y, como hemos demostrado, in vivo, demostrando que puede ser utilizado para la investigación y, potencialmente, en futuras aplicaciones clínicas. También tiene la ventaja de permeabilización de las células de una manera espacialmente restrictiva, lo que podría llegar a ser una valiosa herramienta de investigación.
Introduction
Con la evolución de la biomedicina y la comprensión de la mecánica de células, la entrega de las biomoléculas en células se ha convertido en vital para muchos campos de investigación y las terapias médicas. Diferentes técnicas han sido desarrollados para introducir moléculas extrañas a través de la membrana plasmática y en el citosol de la célula. Estos se pueden clasificar en general ya sea como: técnicas viral, químicos o mecánicos. Técnicas virales pueden transfectar material genético, tales como ARN y ADN utilizando vectores virales 1. Técnicas virales tienden a tener altos rendimientos en ciertas líneas celulares, sin embargo tienen la posibilidad de reacciones inmunes e inflamatorias 2. Métodos de transfección química comunes incluyen precipitación con fosfato de calcio 3, exotoxinas bacterianas 4 y 5 lipofección. Estas técnicas han demostrado ser eficaces, sin embargo, ciertos problemas surgen tales como toxicidad celular y no especificidad. Además, las técnicas tales como Phosphat de calcioe precipitación se han encontrado para tener eficiencias de transfección de hasta 70%, pero sólo en ciertas líneas celulares, rara vez en las células primarias 6. Esto es de nota como el aumento de los esfuerzos de investigación se están poniendo en células primarias, especialmente en el caso de diseñar diversos tratamientos para el uso clínico y el estudio de funcionamiento de ADN.
La interrupción temporal de la membrana celular a través de estímulos mecánica es una alternativa para la introducción de moléculas extrañas en las células. Las técnicas incluyen: la microinyección de moléculas 7, electroporación usando un campo eléctrico para romper la membrana 8,9, sonoporación utilizando ondas de ultrasonido para romper la membrana celular 10-12, bombardeo de partículas como se demuestra por la "pistola de genes", que dispara partículas unidas con genes en la célula 13, y, más recientemente, la aplicación de la tensión de cizallamiento de fluido que se ha demostrado para permeabilizar temporalmente las células de mamífero 14,15. Aunque mecánicométodos cols evitar algunos de los problemas antes mencionados, por lo general son acompañados por una menor eficiencia y configuraciones muy complejas y especializadas. Una antorcha de descarga luminiscente a presión atmosférica (APGD-t) fue desarrollado en McGill con el objetivo inicial de la funcionalización de superficies y separar las células adherentes in vitro 16. Casualmente, se descubrió que una mancha en vivo / muerto se está utilizando de alguna manera se está tomada en por las células sin que se añade un agente de permeabilización. Además, este parecía haber ocurrido sólo en áreas restringidas de los pozos que sucedieron para que coincida con la ruta de la antorcha. Investigación de las capacidades de permeabilización de la APGD-t continuó y en los estudios de control, se encontró que el chorro de gas inerte portador del plasma sin excitación también fue capaz de permeabilizar las células. Esto contradecía la hipótesis inicial de que las especies reactivas creadas por el chorro de plasma alterado de forma temporal la función de la membrana, y sugirió que simplemente los mecánicosfuerzas de cal fueron suficientes para causar la permeabilización celular. A partir de aquí, se continuaron los estudios en nuestro laboratorio para tratar de cuantificar y caracterizar la eficiencia de la permeabilización de un chorro de gas inerte, así como cuidar a sus capacidades de transfección 16.
A través de estos estudios, se ha encontrado que los microporos se puede hacer en forma de hecho en la membrana plasmática, y estos poros tienden a cerrar de nuevo dentro de aproximadamente 5 seg 15. Hemos demostrado la utilidad de la técnica in vitro e in vivo en la membrana corioalantoidea de un embrión de pollo.
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Protocol
1. Desarrollo del programa de LabVIEW
- Un controlador de flujo másico (MKS M100B misa-Flo Controlador) está unido a la línea de gas de helio para garantizar una velocidad de flujo de gas precisa. Esta unidad es controlada por una tensión de entrada, que oscila entre 0 y 5 V. Un bucle de control en el programa LabView determina el voltaje requerido en cualquier momento dado. Interfaz entre el ordenador y el controlador de flujo de masa se lleva a cabo por un dispositivo de adquisición de datos (NI USB-6009), y una fuente de alimentación de 12 V suministra potencia al controlador de flujo másico.
- Dos diapositivas lineal de posicionamiento se utilizan para controlar el movimiento de la placa de 6 pocillos, una para cada dirección. Cada conjunto se compone de una serie MA15-Velmex Asamblea Unislide junto con un motor paso a paso, y ambos conjuntos están controlados por un único Velmex VXM Stepping Motor Controller. El controlador permite para hacer footing manual de cada motor o acepta una cadena de comandos en serie externos, la combinación de los cuales permitir el movimiento específico patterns. Varios patrones se pueden programar en el programa LabView, que requiere que el usuario proporcione sólo la velocidad de la antorcha deseado, así como las dimensiones de ruta.
2. Preparación de Equipo
- Abra tanto el cilindro de helio y el regulador.
- Encienda el controlador del motor.
- Abra el programa LabView y verificar todas las condiciones.
- Asegúrese de que la plataforma esté centrada. Para comprobarlo, busque en cada etapa del motor y verificar que cada carro no está cerca de cualquier extremo escenario. Ya sea que el centro del programa de los carros o ajuste manualmente mediante los controles de correr en la parte frontal del controlador de motor.
- Si esta es la primera carrera del día, se recomienda ejecutar el programa una vez y sin células, para asegurar la instalación funciona correctamente.
3. Preparación de la Altura Gas Jet boquilla capilar
- Quite la capilaridad del soporte y cero el dial de altura.
- Coloque la placa de 6 pocillos on la plataforma.
- Vuelva a colocar y bajar el capilar chorro de gas a la parte inferior del pozo hasta que llega a la hoja de la cubierta. Fije el capilar en el soporte.
- Utilización del dial de altura, levante el capilar 3 mm. Marque esta altura en la base del capilar.
- Levante el capilar a una altura segura y luego retire la placa de 6 pocillos.
4. Celular Protocolo Permeabilización
- Cultura línea celular adherente a la confluencia de la cubierta de cristal se desliza en una placa de 6 pocillos usando técnicas estándar de cultivo. Para las células HeLa, semillas placas de 6 pocillos con 2 x 10 5 células por pocillo y se incuban durante 48 horas antes del tratamiento.
- Preparar volumen apropiado de solución que contiene el vector deseado. Para hrGFPII-1, una concentración de 50 ng / l en 1x PBS proporciona una señal fluorescente fuerte en células HeLa 24 horas después de la transfección. Para los estudios de dextrano, se recomienda 80 mg / ml de 10 kDa de dextrano fluorescente verde. De ahora en adelante, esta solución será referido a un"La solución vector" s.
- Retire el medio de cultivo de células de bien y enjuáguese la boca tres veces con PBS 1x.
- Pipetear 1.370 l de solución de vector preparado en el paso 4.2 en el pozo. Esto debería dar lugar a una profundidad de líquido de aproximadamente 1,3 mm.
- Coloque el pocillo que contiene la solución del vector en el centro de la plataforma. Baje la boquilla de chorro de gas al nivel previamente marcado que indica una altura de boquilla de 3 mm por encima de la diapositiva.
- Establecer velocidad de flujo de helio en el programa LabView y seleccionar el patrón de movimiento deseado para ser utilizado. Seleccione "Ejecutar" cuando esté listo para comenzar el protocolo de permeabilización. Habrá un período de retraso inicial en que el controlador de flujo de masa se está preparando para dar el caudal necesario. Una vez que se ha alcanzado la velocidad de flujo apropiada, el programa LabView activará los motores paso a paso para mover el bien en el patrón de permeabilización deseada. Una vez que la plataforma se ha detenido, espere aproximadamente 30 segundos y retirar la solución del vector.Nota: permeabilización óptimo se produce cerca de una presión dinámica de 100 hasta 200 Pa a la salida de la boquilla, en función del diámetro capilar.
- Lavar tres veces con PBS 1x.
- Llenar bien con medios de cultivo fresco.
- Repita los pasos 4.3 a 4.6 para el número deseado de experimentos. Nota: Asegúrese de incluir muestras de control que consisten en pozos están llenos de la solución vector sin el chorro de gas que se ejecute sobre ellos. Agregar la solución en los pocillos de control durante aproximadamente 1 min continúe en los pasos 4.5 y 4.6.
- Si la ejecución de un experimento de transfección hrGFP, devuelva la placa de 6 pocillos a la incubadora durante 24 horas para permitir que el material transfectadas para ser transcrito por las células. Si al ejecutar un experimento de permeabilización dextrano, volver placa de 6 pocillos a la incubadora durante 15 min.
5. Imágenes de células
- Si lo desea, inmediatamente antes de la imagen, counterstain con mancha en vivo / muerto apropiado para evaluar la muerte celular.
- Celdas de imagen con appropmicroscopio riate para investigar la eficacia de transfección / permeabilización.
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Representative Results
La permeabilización de las células HeLa con 10 kDa de dextrano fluorescente verde usando un chorro de gas helio con un capilar de diámetro interior 0,86 mm se muestra en la Figura 1. Las células fueron counterstained inmediatamente después de la permeabilización con 2 l / ml EthD-1 solución (LIVE / DEAD viabilidad / citotoxicidad Kit) para visualizar la muerte celular. Inmediatamente después de la contratinción, cubreobjetos fueron montados y la imagen. Esta figura muestra los resultados de ejecutar el chorro de gas helio a tres presiones de salida diferentes en comparación con una muestra de control. Tenga en cuenta que la anchura de pista de permeabilización y la eficiencia aumentó con una presión más alta dinámica y la muerte celular sólo mostró un ligero aumento (A y B). Sin embargo, una vez que se llegó a una alta presión dinámica, las células HeLa fueron despojados de la cubierta se desliza y se produjeron muy poco permeabilización periférica. Un análisis más detallado de decapado celular y la eficacia de la transfección se llevó a cabo anteriormente por Chouinard-Pelletier et al. 15
A través de estudios de microscopía electrónica de barrido, se observaron microporos en la membrana celular (Figura 2). La permeabilización de las células HeLa se realizó usando un chorro de gas helio con un 0,86 mm de diámetro interno capilar a una presión de salida de 300 Pa. Tras el protocolo de permeabilización, las células se fijaron inmediatamente con una solución de paraformaldehído al 1% en PBS 1x.
Figura 1. Permeabilización de las células HeLa con 10 kDa dextrano fluorescente verde con un chorro de gas helio con un diámetro interior de la boquilla capilar de 0,86 mm. Dextrano fluorescente células verdes y muertos fluorescencia roja. A) Presión dinámica de 100 Pa, B) de 135 Pa, y C ) de 175 Pa. D) Control con dextrano añadido but ninguna exposición al chorro de gas helio.
Figura 2. Imágenes de SEM con un aumento de 50.000 X de la superficie de las células HeLa después de chorro de gas de permeabilización a 300 Pa. A) de la muestra de control que presenta una superficie celular lisa. B) de la superficie de las células permeabilizadas exhiben un poro con un diámetro de 84 nm. clic aquí para ver más grande la figura .
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Discussion
Permeabilización chorro de gas inerte es una técnica útil para la transfección de células adherentes. Se proporciona la capacidad de transferir biomoléculas en células con el uso de fuerzas mecánicas, lo que elimina la necesidad de productos químicos potencialmente dañinos o vectores virales. La técnica podría potencialmente dar a los investigadores y los clínicos de una manera eficiente y relativamente sencillo para transfectar células con precisión. La selectividad de la permeabilización también es único permitiendo a los investigadores sólo para el tratamiento de ciertas células en una única colonia que podría ser útil en varias aplicaciones.
Varios parámetros pueden ser ajustados para la experimentación individual tales como diámetro de la boquilla capilar y el ángulo, velocidad de flujo de gas, líquido y la altura capilar, línea celular, biomolécula diana para ser utilizado, y el tipo de gas inerte. Un nivel de líquido conjunto y la altura capilar se han descrito en el procedimiento y estos valores fueron elegidos para minimizar el número de variables que intervienen en nuestro experiments. En la actualidad, estamos modelando el sistema mediante la visualización del flujo experimental y la dinámica de fluidos computacional. Esto nos dará una mejor comprensión de las fuerzas impartidas en las células, que nos permite determinar la dependencia de la permeabilización de variables tales como las propiedades del líquido.
Es importante tomar nota de la presión dinámica máxima bajo la cual las células pueden sobrevivir. Se encontró que las presiones dinámicas una vez acercaban a 200 Pa para una altura de la boquilla de chorro de gas de 3 mm, decapado de células HeLa se convirtió probable. Esto concuerda con otros estudios como Lu et al. Quien observó PESO NR6 desprendimiento celular de fibroblastos a 200-265 Pa 17. Si se producen grandes cantidades de decapado, una tasa de flujo de gas inferior debe aliviar este problema. Del mismo modo, las altas tasas de flujo dan como resultado la muerte celular y los resultados de permeabilización de falsos positivos. Una vez que las células han muerto ellos se hacen permeables a las moléculas y, por tanto, las células muertas pueden confundirse con células vivas permeabilizadas. Lopor lo tanto, se recomienda llevar a cabo un ensayo en vivo / muerto para asegurar que las células permeabilizadas son de hecho todavía está vivo. Muerte aumenta con el aumento de la presión y de nuestro laboratorio encontró que a 390 Pa la mayoría de las células HeLa permeabilizadas habían muerto 15. La viabilidad celular durante un período prolongado de tiempo también ha sido investigado, con hrGFPII-1 de expresión se observó hasta 72 horas después de la permeabilización (datos no mostrados). Nuevos estudios están en curso para investigar la viabilidad en puntos de tiempo aún más largas.
Nuestra hipótesis es que los esfuerzos de corte de fluido en las células, creadas por el chorro de gas y el desplazamiento de los medios de comunicación, hacen que la interrupción temporal de la membrana plasmática de la célula. Este es el mismo mecanismo propuesto para los otros métodos físicos más complejos, tales como el colapso de microburbujas y sonoporación 18. Las condiciones de funcionamiento de este método son dependientes del tipo de células, la unión al sustrato, propiedades mecánicas de la célulay la pared celular, molécula de interés, características del líquido y del gas, así como las dimensiones físicas de la instalación. A través de estudios de exclusión de tamaño, se ha encontrado que las moléculas de dextrano mayores de 40 kDa muestran muy baja eficiencia de permeabilización y que un tamaño de dextrano óptima es 10 kDa para la experimentación 15. Esto es importante ya que limita el tamaño de las moléculas que pueden ser permeabilizadas en las células usando este protocolo. Hasta ahora, sólo hemos investigado las propiedades de transfección de plásmidos. Otros estudios se cerciorará de que los trozos más grandes de material genético son capaces de ser transfectadas utilizando esta técnica.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a las siguientes fuentes de financiación: Canadiense Institutos de Investigación en Salud (CIHR), las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación (NSERC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vitality hrGFPII-1 | Agilent Technologies Canada | 240143-57 | Green fluorescent protein for transfection experiments on HeLa cells |
| Dextran, AlexaFluor 488; 10,000 MW, Anionic, Fixable | Life Technologies Inc. | D22910 | dextran for permeabilization experiments |
| LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit | Life Technologies Inc. | L3224 | for counterstaining of mammalian cells |
| Prolong Gold Antifade Reagent | Invitrogen | P36930 | for mounting slides when imaging |
| Ultra High Purity Helium | Praxair Canada Inc. | HE 5.0UH-T | |
| Hyclone DMEM/ High Glucose Media - 500 ml | Thermo Scientific | SH30022.01 | for HeLa cells |
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 26140079 | For DMEM media |
| Penicillin-Streptomycin, liquid | Invitrogen | 15140-122 | For DMEM media |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) 1x | Produced in lab | ||
| Table 1. List of required reagents | |||
| 6-Well Clear TC-Treated Microplates | Corning | 3506 | |
| #1 22 x 22 Coverslips | Fisher | 12-542B | |
| Glass Capillaries | World Precision Instruments | WPI Sizing Information | |
| ID (mm): 1, 0.86, 0.68, 0.5 Order #: 1B200, 1B150, 1B120, 1B100 | |||
| Mass-Flo Controller | MKS | M100B01314CS1BV | Mass flow controller, Series M100B, requires an external 12 V power supply |
| USB-6009 DAQ Device | National Instruments | 779026-01 | |
| UniSlide Assembly with stepping motor and controller | Velmex | Two series MA15 UniSlide Assemblies, fitted with Vexta 1.8° stepping motors provided by Velmex, and controlled by a VXM Stepping Motor Controller | |
| Table 2. List of required equipment |
References
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