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Medicine

Tibial तंत्रिका transection - चूहे में वितंत्रीभवन प्रेरित कंकाल की मांसपेशी शोष के लिए एक मानकीकृत मॉडल

Published: November 3, 2013 doi: 10.3791/50657
Automatic Translation
1, 2
1Keenan Research Centre of the LiKaShing Knowledge Institute, St Michaels Hospital, 2Department of Surgery, McMaster University

Summary

tibial तंत्रिका transection मॉडल कंकाल की मांसपेशी शोष के एक, अच्छी तरह से सहन पुष्टि, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मॉडल है. मॉडल शल्य चिकित्सा प्रोटोकॉल C57Black6 चूहों में वर्णित और प्रदर्शन किया है.

Abstract

tibial तंत्रिका transection मॉडल कृन्तकों में वितंत्रीभवन प्रेरित कंकाल की मांसपेशी शोष के एक, अच्छी तरह से सहन पुष्टि, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मॉडल है. मूल रूप से विकसित की है और अपने बड़े आकार के कारण चूहे में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया जाता है, चूहों में tibial तंत्रिका sciatic तंत्रिका की peroneal और पिडली का तंत्रिका शाखाओं बरकरार है और इस तरह के संरक्षण छोड़ रहा है, यह आसानी से कुचलने या transection किसी के साथ चालाकी से किया जा सकता है कि काफी बड़ा है अपने लक्ष्य की मांसपेशियों. इस प्रकार, इस मॉडल sciatic तंत्रिका transection के मॉडल की तुलना में कम रुग्णता और ambulation की बाधा उत्प्रेरण का लाभ प्रदान करता है और भी जांचकर्ताओं अनुवांशिक इंजीनियर चूहों में पेशी शोष की प्रक्रिया को विनियमित करने, शारीरिक सेलुलर और आणविक जीवविज्ञान का तंत्र का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है. tibial तंत्रिका gastrocnemius, soleus और plantaris मांसपेशियों को आपूर्ति करती है, इसलिए इसकी transection तेजी से चिकोटी प्रकार द्वितीय फाइबर और / या धीमी गति से चिकोटी प्रकार से बना किसी तंत्रिका को काटकर निकाल देना अथवा तंत्रिका पूर्ति में रुकावट पैदा करना कंकाल की मांसपेशी का अध्ययन परमिट मैंफाइबर. यहाँ हम C57Black6 माउस में tibial तंत्रिका transection मॉडल प्रदर्शित करता है. हम आयल एम्बेडेड histologic वर्गों पर मांसपेशियों वजन और फाइबर प्रकार विशिष्ट पार के अनुभागीय क्षेत्र को मापने के द्वारा 1, 2 पर, एक प्रतिनिधि मांसपेशियों के रूप में, gastrocnemius मांसपेशियों का शोष का आकलन, और 4 सप्ताह के बाद वितंत्रीभवन तेजी से चिकोटी मायोसिन के लिए immunostained.

Introduction

दर्दनाक परिधीय तंत्रिका चोट, बीमारी या pharmacologic हस्तक्षेप की वजह से कंकाल की मांसपेशी वितंत्रीभवन, मांसपेशियों स्वैच्छिक सिकुड़ा समारोह के तत्काल नुकसान में परिणाम है. स्नायु समन्वित रूप शोष के लिए शुरू होता है और समय पर, अच्छी गुणवत्ता वाले reinnervation 1,2 आती है, तो इस शोष प्रतिवर्ती है. Reinnervation के अभाव में, myofiber शोष की प्रगति, और मांसपेशियों में अपरिवर्तनीय जीवविज्ञान परिवर्तन मांसपेशी फाइब्रोसिस और myofiber मौत के साथ होते हैं. यहाँ हम चूहों में tibial तंत्रिका transection मॉडल, वितंत्रीभवन प्रेरित कंकाल की मांसपेशी शोष और फाइब्रोसिस की एक मॉडल प्रदर्शित करता है. इस मॉडल gastrocnemius और soleus मांसपेशियों में vivo में पेशी शोष कायम करना है कि, शारीरिक सेलुलर और आणविक जीवविज्ञान का तंत्र का अध्ययन करने के लिए वैज्ञानिकों को सक्षम बनाता है. ऐतिहासिक रूप से चूहों में मुख्य रूप से इस्तेमाल किया, पीटा और विशेष रूप से ट्रांसजेनिक माउस लाइनों के लिए इस मॉडल का अधिक हाल ही में आवेदन, जांचकर्ताओं उनकी की भूमिका का आकलन करने के लिए अनुमति देता हैविवो में शामिल करने, विकास और रखरखाव, या वैकल्पिक रूप से संकल्प, मांसपेशियों शोष और फाइब्रोसिस में ब्याज की विशेष प्रोटीन (ओं).

tibial तंत्रिका कृंतक hindlimb में एक मिश्रित मोटर संवेदी परिधीय तंत्रिका है, और sciatic तंत्रिका की तीन टर्मिनल शाखाओं में से एक है. Tibial तंत्रिका की transection gastrocnemius, soleus और plantaris मांसपेशियों (और पीछे tibialis, आकुंचिका digitorum longus और आकुंचिका hallicus longus सहित पैर के तीन छोटे गहरी flexor मांसपेशियों) denervates, और चूहों 3,4 में एक अच्छी तरह से मानकीकृत और पुष्टि मॉडल है . gastrocnemius और soleus मांसपेशियों आसानी tibial तंत्रिका transection, तय हो गई है और अध्ययन के उद्देश्य के लिए पेशी आरएनए और प्रोटीन की निकासी के लिए जमे हुए मांसपेशी ऊतक और मांसपेशी फाइबर मौरफोमैटरिक्स, या फ्लैश के आकलन के लिए कार्रवाई, उदाहरण के लिए, पोस्ट धारावाहिक समय बिंदुओं पर विच्छेदित किया जा सकता है पेशी शोष विनियमन सेलुलर नेटवर्क संकेतन. गाstrocnemius मांसपेशी एक मिश्रित फाइबर प्रकार की मांसपेशी (प्रकार मैं और प्रकार द्वितीय, मुख्य रूप से प्रकार द्वितीय हालांकि) है और soleus मांसपेशी जिससे मूल्यांकन 5,6 के लिए तेज और धीमी दोनों चिकोटी मांसपेशी उपलब्ध कराने, प्रकार मैं फाइबर का एक बड़ा हिस्सा से बना है. tibial तंत्रिका transection मॉडल (महीने के लिए सप्ताह) लघु अवधि (दिन) 7 और दीर्घकालिक दोनों 4,8 में वितंत्रीभवन प्रेरित मांसपेशी शोष की प्रक्रिया के अध्ययन के लिए उपयुक्त है.

Sciatic तंत्रिका transection मॉडल (सामान्यतः कृन्तकों में इस्तेमाल वितंत्रीभवन प्रेरित मांसपेशी शोष का एक दूसरा मॉडल) के विपरीत, tibial तंत्रिका transection यह एक अधिक आकर्षक मॉडल बनाने, पशु में कम रुग्णता लाती है. Tibial तंत्रिका की transection sciatic तंत्रिका की peroneal और पिडली का तंत्रिका शाखाओं बरकरार पत्ते जबकि sciatic तंत्रिका की transection इस प्रकार के संरक्षण, 2 ambulate को जानवर की क्षमता आई., पैर (घुटने से नीचे) और पैर की सभी मांसपेशियों denervatesअपने लक्ष्य की मांसपेशियों और संवेदी प्रदेशों. माउस तल फ्लेक्स करने में असमर्थ या पैर पलटना है, लेकिन आसानी से ambulate करने में सक्षम है और वजन जिससे काफी मॉडल की रुग्णता ह्रासमान, दोनों पिछले पैर पर समान रूप से पड़ता है. चलने के पैटर्न का मूल्यांकन चाल विश्लेषण पढ़ाई tibial और sciatic तंत्रिका चोटों के बाद चूहों में प्रदर्शन किया और पदचिह्न और वजन असर बेहतर tibial चोट 9,10 साथ संरक्षित है कि प्रदर्शित किए गए हैं. अध्ययन डिजाइन 3 की आवश्यकता है, इसके अलावा, tibial तंत्रिका transection मॉडल में, peroneal तंत्रिका एक बाद में समय बिंदु पर जुटाए जा सकता है और देरी reinnervation के एक स्रोत के रूप में स्थानांतरित कर दिया. इसके विपरीत, sciatic तंत्रिका transection मॉडल में देरी reinnervation बहुत काफी मॉडल की तकनीकी कठिनाई बढ़ रही है और कुशल सर्जन के लिए इसके उपयोग को सीमित करने, sciatic तंत्रिका घाटे को एक तंत्रिका भ्रष्टाचार का उपयोग जरूरी है.

जबकि tibial तंत्रिका transection मॉडल आरयह innervates tibial तंत्रिका और पिंडली की मांसपेशियों दोनों पशु शल्य चिकित्सा में बाँझ ऑपरेटिव तकनीक के साथ ऑपरेटर के परिचित, equires सर्जन नहीं कर रहे हैं, या अत्यधिक पशु शल्य चिकित्सा के साथ अनुभवी व्यक्तियों, जो आसानी से इस मॉडल महारत हासिल कर सकता है, ताकि हेरफेर के लिए आसानी से सुलभ और पहचान योग्य हैं .

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Protocol

पहले इस मॉडल का उपयोग करने के लिए, जांचकर्ताओं शासी निकाय उनकी संस्था के पशु उपयोग से शल्य चिकित्सा प्रोटोकॉल के लिए अनुमोदन प्राप्त होने चाहिए. मॉडल रिसर्च एथिक्स बोर्ड, हैमिल्टन स्वास्थ्य विज्ञान निगम, मैकमास्टर विश्वविद्यालय (AUP # 10-04-24) ने मंजूरी दे दी है और पशुओं की देखभाल पर कनाडा परिषद की सिफारिशों के साथ सख्त अनुसार किया जाता है.

1. माउस तैयारी

  1. माउस वजन. 5 isoflurane% या 2% halothane साथ संज्ञाहरण प्रेरित. सर्जन की रक्षा के लिए संवेदनाहारी की सफाई पर्याप्त इस्तेमाल किया सर्किट सुनिश्चित करना चाहिए. 2-3 मिनट के बाद पशु की श्वसन धीमी हो जाएगी. झपकी पलटा अनुपस्थित है सुनिश्चित करें और शल्य चिकित्सा संज्ञाहरण (माउस से कोई जवाब नहीं) अर्थात् पुष्टि करने के लिए हाथ में interdigital रिक्त स्थान चुटकी. सर्जरी के दौरान कॉर्निया के सुखाने को रोकने के लिए, आंख के लिए नेत्र स्नेहक लागू करें.
  2. नितंबीय से पार्श्व जांघ और कूल्हे दाढ़ीघुटने के निशान और proviodine साथ कीटाणुरहित. शेविंग शल्य चिकित्सा क्षेत्र की पर्याप्त दृश्य सुनिश्चित करने के लिए और तंत्रिका विच्छेदन और transection के साथ हस्तक्षेप को कम करने के लिए चीरा बालों की साइट मुक्त रखना होगा. बेहतर और फीमर के लिए पीछे है जो नितंबीय पायदान, छूने से पहचाना जा सकता है.

2. ऑपरेटिव प्रक्रिया

  1. 2% (halothane 1%) के लिए inhalational isoflurane को कम करने और एक ऑपरेटिंग या विदारक माइक्रोस्कोप के तहत अपने पक्ष (ऊपर का सामना करना पड़ सर्जरी के लिए इरादा पक्ष), पर माउस जगह. 3.5 x बढ़ाई एक वयस्क (20-25 ग्राम) माउस के लिए संतोषजनक है क्योंकि वैकल्पिक सर्जरी शल्य चिकित्सा loupes के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है.
  2. बाँझ दस्ताने डॉन. छूने से नितंबीय पायदान पहचानें. नितंबीय पायदान से घुटने (लगभग 1 सेमी) के लिए पार्श्व जांघ की एक छुरी, काटना त्वचा का उपयोग करना.
  3. धीरे त्वचा फैल गया. मछलियां ग्रीवा मांसपेशियों की पहचान करें, जो पार्श्व जांघ की फ्लैट सतही मांसपेशियों हैतुरंत त्वचा के नीचे. ठीक कैंची का प्रयोग, मांसपेशी फाइबर साथ मछलियां ग्रीवा मांसपेशी विभाजित और sciatic तंत्रिका और उसकी शाखाओं को बेनकाब करने के लिए एक वसंत प्रतिकर्षक साथ खुला पकड़.
  4. मछलियां ग्रीवा पेशी के लिए तुरंत गहरी sciatic तंत्रिका को पहचानें. यह अपनी विशेषता चमकदार सफेद रंग से पहचाना और व्यास में लगभग 0.8 मिमी है किया जा सकता है. यह घुटने की चक्की खात के स्तर पर, tibial peroneal और पिडली का नसों में शाखाओं में बंटी, नितंबीय पायदान से घुटने तक चलता है.
  5. धीरे ultrafine संदंश और वसंत microdissecting कैंची से peroneal और पिडली का तंत्रिका शाखाओं से tibial अलग. tibial तंत्रिका सबसे बड़ी शाखा है और आम तौर पर केंद्रीय है. यह शाखाओं को अलग करते हुए तंत्रिका को कुचलने के लिए महत्वपूर्ण नहीं है. Ultrafine संदंश के साथ ही बाहरी adventicial परत पर तंत्रिका होल्डिंग, और तंत्रिका सुस्त (सिखाया नहीं) रखने, तंत्रिका कुचलने और कर्षण चोट से बचना होगा.
  6. पूर्ण और स्थायी denervati लिएपर, ध्यान से घुटने की चक्की जहाजों से परहेज है, के रूप में distally संभव के रूप में कैंची microdissecting साथ tibial तंत्रिका कटौती. वैकल्पिक रूप से, 2-4 हफ्तों में उम्मीद पूरी reinnervation साथ अस्थायी वितंत्रीभवन के लिए, tibial तंत्रिका बस transected के 15 सेकंड के बजाय के लिए ultrafine संदंश के साथ कुचल दिया जा सकता है. (परिधीय नसों निम्नलिखित चोट regrow और लक्ष्य पेशी Reinnervate जाएगा.)
  7. पूरा वितंत्रीभवन की आवश्यकता है, gastrocnemius के फिर से स्फूर्तिदान न्यायपालिका को रोकने के लिए 5-0 Vicryl साथ 10-0 नायलॉन और फिर लगभग मछलियां ग्रीवा के साथ मछलियां ग्रीवा मांसपेशियों के पूर्वकाल सतह को transected tibial तंत्रिका के अंत सिवनी और soleus मांसपेशियों.
  8. एक चल 5-0 Vicryl सीवन के साथ त्वचा को बंद करें.

3. ऑपरेटिव केयर पोस्ट

  1. Inhalational संवेदनाहारी बंद करें, लेकिन ऑक्सीजन का प्रवाह बनाए रखने के लिए. Subcutaneously एनाल्जेसिक buprinorphine (या विकल्प) प्रशासन.
  2. कोई साथ एक साफ पिंजरे में माउस स्थानांतरणबिस्तर संज्ञाहरण से जागने जबकि. Ambulating तक पिंजरे के भीतर और प्रत्यक्ष निगरानी में एक वार्मिंग कंबल पर रखें.
  3. पर्याप्त नरम बिस्तर के साथ नरम नीचे पिंजरे में स्थानांतरण और घर नहीं है (तार).
  4. Decubitus एड़ी अल्सर या चबाने के सबूत के विकास के लिए शल्य घाव और पैर की हालत के लिए दैनिक ऑपरेटिव अंग का निरीक्षण किया. मामूली समस्याओं सामयिक एंटीबायोटिक दवाओं या ऐसे proviodine के रूप में दवाइयों के साथ प्रबंधित किया जा सकता है. पशु इच्छामृत्यु की आवश्यकता समापन बिंदु संकेतक वजन घटाने, गरीब आत्म देखभाल के सबूत (झालरदार फर), और hunched मुद्रा हैं. इसके अलावा, प्रमुख घाव विघटन या सामयिक एंटीबायोटिक दवाओं के साथ 1-2 सप्ताह में ठीक है या दर्द है प्रकट नहीं करते कि अल्सर के साथ पशुओं का बलिदान किया जाना चाहिए.

4. किसी तंत्रिका को काटकर निकाल देना अथवा तंत्रिका पूर्ति में रुकावट पैदा करना gastrocnemius और soleus बलवान हार्वेस्ट

  1. वांछित पोस्ट ऑपरेटिव समय बिंदु पर, सीओ 2 अधिक मात्रा के साथ माउस और बलिदान तौलना.
  2. दोनों की औसत दर्जे का पहलू दाढ़ीऑपरेटिव और contralateral नियंत्रण पैर और शराब के साथ साफ. एक ऑपरेटिंग या विदारक खुर्दबीन के नीचे माउस प्लेस, या वैकल्पिक रूप से बढ़ाई के लिए शल्य देखने loupes का उपयोग करें.
  3. आपरेशन वाले भाग पर, एक घुटने से टखने से छुरी और circumferentially टखने के चारों ओर के साथ औसत दर्जे का बछड़ा त्वचा काटकर अलग कर देना. धीरे मांसपेशी बंद और proximally जांघ की ओर संदंश के साथ त्वचा खींच. यह पैर की सभी मांसपेशियों को उजागर करता है. घुटने से पैर के पीछे के पहलू पर टखने तक चलता है और त्वचा के नीचे तुरंत निहित है कि पिंडली की मांसपेशी है जो gastrocnemius मांसपेशियों, पहचानें. घुटने की औसत दर्जे का पहलू पर gastrocnemius मांसपेशियों को समीपस्थ मछलियां ग्रीवा पेशी के बाहर का सम्मिलन, पहचानें. इसके बाहर का सम्मिलन में मछलियां ग्रीवा पतली और फिल्मी दिखाई देता है और gastrocnemius के सबसे समीपस्थ भाग overlies. कैंची और कुंद अंत विच्छेदन का प्रयोग, धीरे गैस से मछलियां ग्रीवा के बाहर का सम्मिलन अलगtrocnemius पेशी.
  4. Calcaneous में अपने बाहर का सम्मिलन में, gastrocnemius मांसपेशियों स्नायुजाल में tapers. सफेद और बलवान दिखाई देता है जो स्नायुजाल, पहचानें. पकड़ या gastrocnemius मांसपेशियों को कुचलने के लिए नहीं, देखभाल संदंश साथ स्नायुजाल पकड़ो, और कैंची का उपयोग कैल्केनीयस प्रविष्टि से स्नायुजाल विभाजित करते हैं.
  5. फिर भी पट्टा पकड़े, धीरे घुटने में अपने मूल की ओर बाहर का सम्मिलन (soleus अलग से काटा जा सकता है) से, गहरी soleus (गहरे लाल) बंद gastrocnemius मांसपेशियों (पीला लाल) उठा.
  6. कैंची का उपयोग औसत दर्जे का है और पार्श्व फीमर chondyles से gastrocnemius की उत्पत्ति विभाजित करके पैर बंद gastrocnemius काटना. पेशी पर बहुत कोमल कर्षण इस प्रक्रिया की सुविधा. मांसपेशियों को कुचलने के लिए नहीं सावधान रहना होगा.
  7. soleus अब तुरंत gastrocnemius की साइट के तहत, स्पष्ट रूप से देखा जा सकेगा. को Achilles पट्टा पर अपनी प्रविष्टि से soleus उठाकर अपने यापीछे बछड़ा पर igin. Soleus अनजाने gastrocnemius के साथ उठाया जाता है, तो धीरे काटा नमूना से अलग. gastrocnemius के प्रकाश (लाल) और soleus (गहरे लाल) अपने रंग मतभेद के कारण काटा नमूना में आसानी से पहचाना रहते हैं.
  8. एक सटीक पैमाने पर अलग से मांसपेशियों वजन.
  9. (बाद में प्रोटीन और / या शाही सेना निकासी के लिए) तरल नाइट्रोजन में तस्वीर ठंड के लिए, खड़ी आधा मांसपेशियों भाजित, और ऊतक विज्ञान (यानी morphometric मूल्यांकन, immunohistology) के लिए आधा isopentane में 10 formalin%, या फ्रोजन निर्धारण में भी फिक्सिंग तरल नाइट्रोजन के साथ ठंडा , के रूप में वांछित.
  10. नियंत्रण gastrocnemius और soleus मांसपेशियों फसल के लिए नियंत्रण पर ऊपर कदम 4.3, संयुक्त राष्ट्र संचालित की ओर से दोहराएँ.

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Representative Results

Tibial तंत्रिका transection gastrocnemius, soleus और बछड़े की plantaris मांसपेशियों denervates. यहाँ हम एक प्रतिनिधि मांसपेशियों के रूप में, gastrocnemius मांसपेशियों में शोष के विकास का आकलन करें. Gastrocnemius मांसपेशियों 1, 2, या 4 हफ्तों के लिए किसी तंत्रिका को काटकर निकाल देना अथवा तंत्रिका पूर्ति में रुकावट पैदा करना 2-3 महीने पुरानी C57Black 6 चूहों (जैक्सन प्रयोगशालाओं) से काटा गया था. स्नायु वजन उत्तरोत्तर रूप में समय के साथ प्रकार द्वितीय तेजी से चिकोटी मांसपेशी फाइबर (चित्रा 2) के पार के अनुभागीय क्षेत्र है, (चित्रा 1) में कमी. gastrocnemius के एक मिश्रित फाइबर प्रकार की मांसपेशी (मैं और प्रकार द्वितीय टाइप) है, लेकिन वितंत्रीभवन मैं द्वितीय फाइबर 11 टाइप करने के लिए टाइप से एक फाइबर प्रकार स्विच लाती है, और एक परिणाम के रूप में इस प्रकार की एक पर्याप्त संख्या मैं फाइबर माप के लिए उपलब्ध हो सकता है और नहीं हो सकता मजबूत सांख्यिकीय विश्लेषण.

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चित्रा 1. किसी तंत्रिका को काटकर निकाल देना अथवा तंत्रिका पूर्ति में रुकावट पैदा करना gastrocnemius मांसपेशियों प्रगतिशील शोष दर्शाता है. C57Black 6 चूहों सही tibial तंत्रिका की transection लिया. Gastrocnemius मांसपेशियों किसी तंत्रिका को काटकर निकाल देना अथवा तंत्रिका पूर्ति में रुकावट पैदा करना (दाएं) और contralateral नियंत्रण से काटा गया था (बाएं) तंत्रिका transection निम्नलिखित 1, 2, या 4 सप्ताह में hindlimbs. Gastrocnemius मांसपेशियों तौला गया, और किसी तंत्रिका को काटकर निकाल देना अथवा तंत्रिका पूर्ति में रुकावट पैदा करना मांसपेशियों का वजन contralateral नियंत्रण innervated मांसपेशियों के अनुपात के रूप में व्यक्त किया जाता है. वितंत्रीभवन मांसपेशियों की एक प्रगतिशील नुकसान लाती है.

चित्रा 2
चित्रा 2. किसी तंत्रिका को काटकर निकाल देना अथवा तंत्रिका पूर्ति में रुकावट पैदा करना gastrocnemius मांसपेशियों myofiber क्रॉस सेक्शन क्षेत्र में प्रगतिशील कमी (ए) किसी तंत्रिका को काटकर निकाल देना अथवा तंत्रिका पूर्ति में रुकावट पैदा करना और नियंत्रण gastrocnemius मांसपेशियों muscl पर क्रॉस सेक्शन पर कटौती formalin तय, थे दर्शाताई मध्य वर्ग और विरोधी कंकाल की मांसपेशी मायोसिन, biotinylated माध्यमिक एंटीबॉडी और streptavidin-HRP/DAB द्वारा पीछा तेजी से चिकोटी isoform (मेरा -32, सिग्मा, 1:500 कमजोर पड़ने) के लिए immunostained रूप में 7 का वर्णन किया. Hematoxylin एक counterstain के रूप में इस्तेमाल किया गया था. फास्ट चिकोटी प्रकार द्वितीय फाइबर मैं फाइबर प्रकाश बैंगनी दाग ​​भूरे और धीमी गति से चिकोटी प्रकार के दाग. फाइबर के पार के अनुभागीय क्षेत्र (सीएसए) 7,12 के रूप में वर्णित ImageJ सॉफ्टवेयर (बेथेस्डा, एनआईएच) का उपयोग मापा गया था. तेजी से चिकोटी प्रकार द्वितीय फाइबर प्रगतिशील शोष प्रदर्शित करता है. बहुत कुछ प्रकार मैं फाइबर फाइबर आकार के एक सांख्यिकीय मान्य मूल्यांकन की अनुमति के लिए किसी तंत्रिका को काटकर निकाल देना अथवा तंत्रिका पूर्ति में रुकावट पैदा करना gastrocnemius में मौजूद हैं. (एन = 6 से 9 चूहों / समूह 200 myofibers का एक न्यूनतम ऑपरेटिव phenotype के लिए अंधा एक समीक्षक द्वारा मांसपेशियों प्रति मापा गया डाटा / + मतलब के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं -... एसडी स्केल बार 100 माइक्रोन के बराबर होती है). बड़ा देखने के लिए यहां क्लिक करें आंकड़ा .

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Discussion

वितंत्रीभवन प्रेरित कंकाल की मांसपेशी शोष का tibial तंत्रिका transection मॉडल चूहों में एक सामान्य रूप से कार्यरत हैं और अच्छी तरह से मान्य मॉडल है. हम अन्वेषक अनुवांशिक इंजीनियर चूहों के अस्तित्व का लाभ लेने के लिए और मांसपेशियों 7,8 के विनियमन के लिए महत्वपूर्ण प्रोटीन के अभाव में इन विवो में पेशी शोष की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए अनुमति देता है जो चूहों में प्रयोग के लिए इस मॉडल को ढाल लिया है. gastrocnemius और soleus मांसपेशियों, इस मॉडल में किसी तंत्रिका को काटकर निकाल देना अथवा तंत्रिका पूर्ति में रुकावट पैदा करना दोनों, इस तरह बाद में आणविक विश्लेषण के लिए उत्कृष्ट गुणवत्ता mRNA और प्रोटीन प्रदान करने, आसानी से और तेजी से न्यूनतम हैंडलिंग के साथ विच्छेदित किया जा सकता है. इसी तरह, क्योंकि मांसपेशियों के आकार की, वे सहवर्ती histologic और morphometric विश्लेषण के लिए एक ही पशु से ऊतक प्रदान करने, विभाजित किया जा सकता है. Hindlimb कार्यात्मक मूल्यांकन की आवश्यकता है, ट्रैक विश्लेषण चलने क्रमानुसार प्रदर्शन किया जा सकता है. पैर स्याही में डूबा है और माउस पर कागज के साथ एक बाड़े के माध्यम से चला जाता हैनीचे. प्रिंट के लक्षण मज़बूती से मापा और पदचिह्न विशेषताओं कार्यात्मक मांसपेशी समूहों 13,14 प्रतिबिंबित के बाद से, न्यूरोमस्कुलर विकलांगता और चाल समझौते की हद से संकेत मिलता है रन बनाए जा सकते हैं. मूल रूप से विकसित और चूहे 13 में मान्य है, जबकि ट्रैक विश्लेषण घूमना भी चूहों 15 में किया जा सकता है.

Tibial तंत्रिका transection आम तौर पर बहुत अच्छी तरह से चूहों द्वारा सहन किया है. एनाल्जेसिक के केवल एक खुराक के तत्काल पश्चात की अवधि में आवश्यक है. उचित बाँझ तकनीक के उपयोग के साथ, नरम ऊतक संक्रमण दुर्लभ है. Tibial तंत्रिका transection के हमारे अनुभव C57black6 और पीटकर या ऑटो पंगु बना करने के लिए करते हैं नहीं है इस लाइन पर ली गई ट्रांसजेनिक चूहों में पैर के तल का पहलू पर संवेदी paraesthesia को उत्पन्न करता है. हालांकि, चूहों ऑटो विकृति के लक्षण, एड़ी दबाव अल्सर, साथ ही देखभाल endpoints के बिंदु के लिए दैनिक निरीक्षण किया जाना चाहिए. हम नगण्य मृत्यु दर बुद्धि है, जबकिज मॉडल, हम चूहों की लगभग 2-5% की वजह से स्वयं की मध्यस्थता चोट करने के लिए euthanized, या दबाव अल्सर संचालित हिंद अंग, पर विकसित किया जाना चाहिए लगता है. मुलायम बिस्तर के उपयोग के बाद operatively जानवर की सुविधा सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है और ऑपरेशन पक्ष पर दबाव अल्सर के विकास को रोकने में मदद करता है. Sciatic तंत्रिका बंधाव के साथ ही बंधाव की SNI मॉडल (जहां नितंबीय का tibial और आम peroneal शाखाओं ligated कर रहे हैं, लेकिन पिडली का बरकरार रह गया है) न्यूरोपैथिक दर्द 16,17 के मॉडल के रूप में काम करते हैं. इस प्रकार, परपीड़ा और थर्मल hyperalgesia साथ ही हमारे मॉडल में पैर में भी हो सकता है, लेकिन हम नरम बिस्तर पर सामान्य दैनिक गतिविधियों के साथ चूहों में प्रकट दर्द व्यवहार नहीं देखा है.

केवल एक hindlimb का tibial तंत्रिका transected है और चूहों के वजन दोनों hindlimbs पर लगभग समान रूप से वहन के बाद, contralateral संयुक्त राष्ट्र संचालित अंग से मांसलता प्रत्येक जानवर 7-10 भीतर एक आंतरिक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.चाल से अधिक महत्वपूर्ण असामान्यताओं contralateral अंग मांसपेशियों में एक अतिवृद्धि प्रतिक्रिया पैदा कर सकते हैं जहां यह नितंबीय transection मॉडल में जरूरी मामला नहीं है. Tibial तंत्रिका transection मॉडल में, हम आम तौर पर हमारे नियंत्रण मांसपेशी 7,8 के रूप में संयुक्त राष्ट्र संचालित अंग से gastrocnemius और soleus मांसपेशियों का उपयोग करें. अन्वेषक नियंत्रण मांसपेशियों की फसल के लिए जो से अलग जानवरों का उपयोग करने के लिए चुनता है, तो नकली सर्जरी प्रदर्शन किया जाना चाहिए. शाम सर्जरी संज्ञाहरण, tibial तंत्रिका बेनकाब करने के लिए त्वचा के बंटवारे, लेकिन कोई transection के प्रशासन से मिलकर करेंगे. त्वचा बस निम्नलिखित तंत्रिका जोखिम बंद किया जाएगा.

कुछ परिधीय तंत्रिका transection मॉडल में, समीपस्थ स्टंप से लक्ष्य की मांसपेशियों को गुमराह reinnervation योजना बनाई वितंत्रीभवन contaminates. इस मॉडल में, मछलियां ग्रीवा मांसपेशी की ऊपरी सतह को transected tibial तंत्रिका के समीपस्थ अंत हासिल प्रकार की मांसपेशी इंटरफेस, inhibi समापनटीएस गुमराह reinnervation. जैसे, यह मॉडल में एक महत्वपूर्ण और आवश्यक कदम है. गुमराह reinnervation इस मॉडल में दुर्लभ है.

इसी तरह, शल्य चिकित्सा के दौरान तंत्रिका की सावधानी से निपटने के लिए आवश्यक है. पिडली का और peroneal तंत्रिका शाखाओं धीरे tibial transection से पहले tibial तंत्रिका से अलग, और कुचल या प्रक्रिया में बढ़ाया नहीं जाना चाहिए. इन नसों के किसी न किसी तरह से निपटने आंशिक रूप से अन्य hindlimb मांसलता denervating, उनके कार्य समझौता होगा. यदि ऐसा होता है जानवर की चाल विभिन्न एकमात्र tibial तंत्रिका transection के दौर से गुजर उन चूहों की तुलना में प्रभावित हो जाएगा, और चर मांसपेशी लोड प्रयोगात्मक परिणामों दूषित हो सकता है. किसी तंत्रिका को काटकर निकाल देना अथवा तंत्रिका पूर्ति में रुकावट पैदा करना मांसलता विदारक जब इसी तरह, ध्यान रखा जाना चाहिए. स्नायु कण्डरा से संभाला, और ऊतक विज्ञान को प्रभावित करेगा कि कुचलने विरूपण साक्ष्य, मांसपेशी फाइबर morphometric विश्लेषण और संभवतः जीन अभिव्यक्ति से बचने के लिए सीधे नहीं समझा जाना चाहिए.

हम टीypically पशु परिपक्व है, के रूप में चूहों 20-24 ग्राम (उम्र के 2-3 महीने) में इस मॉडल को रोजगार और sciatic और tibial नसों आसानी से संभाला जा करने के लिए पर्याप्त आकार के दोनों कर रहे हैं. सर्जरी अगर वांछित छोटे, छोटे जानवरों पर किया जा सकता है, लेकिन यहां सीमित कारक ऑपरेटिंग सर्जन के कौशल होगा. अन्वेषक किसी तंत्रिका को काटकर निकाल देना अथवा तंत्रिका पूर्ति में रुकावट पैदा करना मांसपेशी में उपग्रह सेल प्रतिक्रिया का अध्ययन करने में रुचि है, तो यह एक मुद्दा हो सकता है. उपग्रह सेल पुनर्योजी क्षमता युवा, जानवरों के 18 और इसलिए छोटे जानवरों एक कम अनुभवी ऑपरेटर के लिए एक तकनीकी चुनौती पेश, प्रयोगात्मक डिजाइन में आवश्यक हो सकता है, की तुलना में पुराने में कम हो.

tibial तंत्रिका transection मॉडल, अगर वांछित देरी पेशी reinnervation (> 4 सप्ताह) में से एक के लिए, वितंत्रीभवन प्रेरित मांसपेशी शोष का बस एक मॉडल से अनुकूलित और अनुभवी शल्य ऑपरेटरों 1,3 उपलब्ध हैं. किया जा सकता है निवेश संबंधी निर्णय निर्माताओं द्वारा निर्दिष्ट वितंत्रीभवन की अवधि के बादestigator, माउस reoperated और peroneal तंत्रिका किसी तंत्रिका को काटकर निकाल देना अथवा तंत्रिका पूर्ति में रुकावट पैदा करना मांसलता Reinnervate लिए जुटाए जा सकते हैं. transected tibial तंत्रिका के बाहर का स्टंप की पहचान की है, छंटनी और peroneal तंत्रिका उसके बाहर अंत में जुटाए और microsurgically tibial तंत्रिका स्टंप करने के लिए मरम्मत की है. peroneal तंत्रिका gastrocnemius और soleus मांसपेशियों Reinnervate को tibial तंत्रिका स्टंप में लगभग 1 मिमी / दिन की दर से बढ़ेगा. tibial तंत्रिका transection मॉडल एक तंत्रिका भ्रष्टाचार क्योंकि peroneal तंत्रिका की उपलब्धता के 2 reinnervation प्रक्रिया में आवश्यक नहीं है कि sciatic तंत्रिका transection मॉडल पर एक लाभ प्रदान करता है. हालांकि, यह तंत्रिका reanastomoses एक कुशल और अनुभवी ऑपरेटर की परिशुद्धता की आवश्यकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए.

संक्षेप में, यहाँ हम वितंत्रीभवन प्रेरित कंकाल की मांसपेशी शोष का एक आसान, मजबूत, अच्छी तरह से मान्य है और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मॉडल के रूप में, चूहों में tibial तंत्रिका transection मॉडल प्रदर्शित करता है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा कर रहे हैं.

Acknowledgments

यह काम CIHR Neuromuscular अनुसंधान भागीदारी (-; JAEB को 90,959 JNM) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents and Materials
10-0 Nylon suture Ethicon 2850G
5-0 Vicryl suture Ethicon J553G
Equipment
Spring microdissecting scissors Fine Surgical Tools 15021-15
Ultra fine forceps Fine Surgical Tools 11370-40
Non locking micro needle holder (driver) Fine Surgical Tools 12076-12
Spring retractor Fine Surgical Tools 17000-02

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चिकित्सा अंक 81 माउस tibial तंत्रिका gastronemius soleus शोष वितंत्रीभवन reinnervation myofiber transection
Tibial तंत्रिका transection - चूहे में वितंत्रीभवन प्रेरित कंकाल की मांसपेशी शोष के लिए एक मानकीकृत मॉडल
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Batt, J. A. E., Bain, J. R. Tibial Nerve Transection - A Standardized Model for Denervation-induced Skeletal Muscle Atrophy in Mice. J. Vis. Exp. (81), e50657, doi:10.3791/50657 (2013).

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