En Decellularization metoden til udarbejdelse af en naturlig Acellular Intestinal Matrix

Summary

Artiklen beskriver en metode til fremstilling af en acellulær matrix fra rotte tarmen. Udledningen af ​​tarm stilladser er vigtig for fremtidige ansøgninger i tissue engineering, stamcelle biologi og narkotika testning.

Abstract

Vellykket vævsmanipulering involverer kombination af stilladser med passende celler in vitro eller in vivo. Stilladser kan være syntetisk, naturligt afledt eller stammer fra væv / organer. Sidstnævnte opnås ved hjælp af en teknik kaldet decellularization. Decellularization kan indebære en kombination af fysiske, kemiske og enzymatiske metoder. Målet med denne teknik er at fjerne alle cellulære spor samtidig med at den makro-og mikro-arkitektur af den oprindelige væv.

Intestinal tissue engineering har hidtil anvendt relativt simple stilladser, der ikke kopierer den komplekse arkitektur indfødte orgel. Fokus i denne artikel er at beskrive en effektiv decellularization teknik til rotte tyndtarmen. Isoleringen af ​​tyndtarmen for at sikre opretholdelsen af ​​en vaskulær forbindelse er beskrevet. Kombinationen af ​​kemiske og enzymatiske løsninger til at fjerne cellerne whilst bevare villus-crypt akse i luminale aspekt af stilladset er også fastsat. Endelig vurdering af producerede stilladser til relevante karakteristika diskuteret.

Introduction

Tissue engineering (TE) giver en terapeutisk alternativ til organtransplantation, uden om spørgsmål af immunosuppression og organmangel. TE har for nylig haft vellykkede applikationer i klinikken, med udskiftning af organer såsom blæren ^1, urinrøret ² og luftrør, både voksne ^3,4 og børn ^5.

Opbygning af et væv-manipuleret organ nødvendiggør en kombination af et stillads med de relevante celler. Et stillads kan fremstilles ved hjælp af naturligt afledt (fx collagen) og syntetisk (f.eks poly-L-glycolsyre; PLGA) materialer eller opnås ved decellularization indfødte organer og væv. Stilladser, der er blevet anvendt hidtil til intestinal TE hovedsagelig har været enten decellulariseret (lille tarmsubmucosa) eller syntetiske (poly-L-glycolsyre og poly-mælkesyre) ^6-13. Disse biomaterialer er meget enkel i både makro-og mikro-arkitektur, somkan ikke være ideelt, hvis væv-manipuleret tarmen skal klinisk oversættes. En optimal biomateriale til tarmen, bør have en medfødt vaskulær træ, der kan tilsluttes til værten blodforsyning, en trinvis rørformet væg med forskellige egenskaber for at afspejle de lag af den intestinale væg og en villus-crypt aksen på den luminale side at støtte med repopulation af epitel stamceller.

Decellularization er en roman metode, der producerer stilladser ved at fjerne celler fra hele organer, samtidig med at de bevarer deres oprindelige arkitektur ^14. Dette er at foretrække frem for eksisterende stillads, eftersom de ikke kun replikere strukturen af ​​organet, men også indeholder kemiske signaler indlejret i den ekstracellulære matrix (ECM), som støtte cellulær proliferation og differentiering. I 2008 blev en cadaveric luftrøret blev decellulariserede ^14, podes med patientens egne celler, og transplanteres til at erstatte de vigtigste venstre bronkier i en ung mand 15, lever ^16,17 og lunge ^18-20 i små og store dyr.

Vi har også tilpasset den samme metode til at producere en tyndtarmens decellulariseret stillads ^21. Målet med den heri beskrevne fremgangsmåde er at producere decellulariseret tarm matricer, der opretholder de makroskopiske egenskaber af det oprindelige væv, såsom blodforsyning, samt mikroskopisk arkitektur af villus-crypt akse i det intestinale lumen. Vi mener, at denne metode kan i sidste ende blive vedtaget for andre organer til at forbedre effektiviteten af ​​decellularization.

Protocol

1.. Isolering af rotte Tarmen

1. Forbered en 1 L opløsning af Fosfatbufferet saltvand (Sigma, UK) med 1% antibiotikum / antimykotikum (Sigma, UK) (PBS / AA). Monter peristaltisk pumpe (variabel hastighed Masterflex L / S) med to rør. Kør 70% ethanol (EtOH) gennem rørene i den peristaltiske pumpe i 15 minutter ved maksimal hastighed, efterfulgt af PBS / AA i yderligere 15 minutter.
2. Afliv voksne Sprague-Dawley rotter, der vejer ca 250-350 g af CO ₂ indånding og halsdislokation i overensstemmelse med lokale retningslinjer dyr og godkendelser (i UK, hjemmekontor retningslinjerne under de Dyr (videnskabelige procedurer) Act 1986).
3. Autoklavere kirurgiske instrumenter inden brug. Spray og aftør maven af ​​dyret ved hjælp af 70% EtOH.
4. Udfør en xifo-pubic laparotomic snit på maven for at sikre en klar kirurgiske område.
5. Eviscerate tyndtarmen på højre side af dyret på en papirserviet sprøjtet med 70% EtOH. Take sig kontinuerligt våd tarmen med PBS / AA for at undgå udtørring af vævet og denaturering af den ekstracellulære matrix (ECM).
6. Find den øvre mesenteriske arterie (SMA), der opstår i en vinkel på 90 ° fra aorta mod tarmen. Anvend en 27 G kanyle at indtaste SMA fra aorta og hurtigt trækker nålen for at undgå rivning af beholdervæggen. Advance plastrøret af kanylen ind i SMA og fastgør med suturer (Vicryl 5/0).
7. Bekræft kanylering ved injektion af 1 ml af PBS / AA. Brug foråret saks til incise aorta proximalt og distalt i forhold til SMA, således at frigøre kanylen.
8. For at undgå lækage af afføring når dissekere tyktarmen, placeres en (Silk 5/0) sutur knude på den proksimale ende af ileocaecal krydset og en ved den distale ende af sigmoid colon. Derefter skæres den terminale ileum og tyktarm mellem de to knuder og fjerne tyktarmen.
9. Skær tarmen på jejuno-duodenale krydset etnd befri tarmen fra enhver bindevæv forbindelser det måtte have med maven.
10. Overfør tyndtarmen i en petriskål med PBS / AA. Cannulate den proksimale del af tarmen med en plastik Pasteur pipette (LSL Laboratorieprodukter) og fastgør det på plads med suturer. Skær pipetten så det vil passe til Luer-Lok af en 60 ml sprøjte (BD Plastipak). Skyl tarmlumen 2x med 60 ml PBS / AA til at fjerne afføring og snavs.

2. Decellularization Metode

1. Slut vaskulære kanyle til en tre-vejs stophane. Dette vil lette håndtering, minimere spændingen på det vaskulære træ og tillade fjernelse af bobler fra slangen.
2. Begynde at køre deioniseret vand (resistivitet 18,2 MOhm / cm) gennem Masterflex L / S med variabel hastighed rullepumpe på 0,6 ml / time. Sørg for at ingen bobler er til stede inden slangen før forbinder med intestinale lumen stophane. Nogle bobler kan være til stede inden i lumen fra trin1.9, hvilket kan forringe decellularization processen. Variere hastigheden af ​​pumpen og håndtere vævet med pincet for at sikre bobler udgang fra den distale ende. Tilslut ikke vaskulære kanyle indtil denne proces er færdig, da høje hastigheder kan beskadige vaskulære træet.
3. Overfør apparatet til det kolde rum, idet det følgende trin af decellularization udføres ved 4 ° C. Den lave temperatur tillader fjernelse af celler og samtidig minimere væv nedbrydning. Anbring petriskålen i en beholder, der vil indsamle overstrømmende løsning. Perfuse både det intestinale lumen og det vaskulære træ med deioniseret vand (resistivitet 18,2 MOhm / cm) i 24 timer ved 0,6 ml / time. For den første time kontrollere apparatet regelmæssigt for at sikre, at alle forbindelser er sikre, lækage er minimal, og ingen bobler er til stede i tarmen.
4. Efter 24 timers behandling med demineraliseret vand, flytter apparat decellularization udenfor det kolde rum som resten af ​​trinene erudføres i stuetemperatur (RT).
5. Natriumdeoxycholat (Sigma, UK) afvejes til fremstilling af 300 ml af en 4% opløsning i deioniseret vand. Natriumdeoxycholat afvejes under en suge hætte, da det er en mundtlig og øjenirriterende. Bland ved hjælp af en hvirvel, indtil opløsningen er klar. Opløsningen kan holdes ved 4 ° C i op til 1 måned.
6. Skift deioniseret løsning natriumdeoxycholat, kontrollere tilslutningerne, fjern eventuelle bobler og perfuse på 0,6 ml / time i 4 timer.
7. Efter natriumdeoxycholat trin vask med PBS / AA i 30 min for at undgå vekselvirkning mellem natriumdeoxycholat og DNase-I.
8. Afvej deoxyribonuklease-I (DNase-I, Sigma) og forberede 250 ml af en 2,000 kU opløsning i 1 M natriumchlorid, pH 7,4. Bland ved hjælp af en hvirvel, indtil opløsningen er klar. Denne opløsning skal fremstilles umiddelbart før brug og kan ikke gemmes.
9. Perfuse DNase-I i 3 timer ved stuetemperatur ved en hastighed på 0,6 ml / time.
10. Efter DNase-I trin, overførestillads ind i en vævskultur hætte og ændre plader og instrumenter. Det foreslås at anvende aseptisk teknik.
11. Vask med PBS / AA i 30 minutter for at sikre, at alle rester af decellularization løsninger er fjernet. Placer stilladset i en ny petriskål og overføre til en UV Crosslinker (Spectroline, USA). Kør to steriliseringscyklusser. Opbevares i 5% PBS / AA og ændre opløsningen hver 3 dage.

Representative Results

Efter en vellykket decellularization (figur 1), bør stillads have en makroskopisk udseende svarende til den for den native tarmen, men med gennemskinnelige vægge (figur 2A). Bevarelsen af ​​makro-arkitektur bør også være tydeligt ved åbenheden af ​​det vaskulære træ. Når farvestof indsprøjtes gennem SMA kanyle, bør det fordele sig jævnt i hele stilladset og nå kapillarrøret træ (figur 2B). Stilladset skal være fri for nukleare og cytoplasmatisk materiale, noget der kan vurderes ved hjælp af en DNA-kvantificering kit og enkel histologisk analyse. Hematoxylin og eosin farvning (H & E) skal demonstrere et fravær af nukleart og cytoplasmatisk materiale og samtidig bevare de små tarm lag (figur 3a). Navnlig bør vedligeholdelse af villi og krypter på den luminale side være indlysende efter scanning elektronmikroskopi (figur 4). Abør også forventes bevarelse af ekstracellulære matrixbestanddele, såsom collagen, elastin og glycosaminoglycaner. For eksempel Masson Trichrome farvningsprocedurer viser intakt bindevæv i stilladset (figur 3B).

Figur 1. . Forsøgsplan Tidslinje for decellularization procedure PBS / AA: fosfatbufferet saltopløsning med antibiotika-antimykotikum, NaDeoxy: Natriumdeoxycholat, RT: stuetemperatur DNAse-I: deoxyribonuklease-I. Klik her for at se større billede .

Figur 2. Stillads macroscopic egenskaber. Makroskopisk udseende rotte tyndtarmen efter en vellykket decellularization (A). Injektion af Rosso Ponceau farvestof gennem SMA demonstrerer en intakt vaskulære netværk (B), SMA: overlegen mesenterialarterie Klik her for at se større billede .

Figur 3. . Histologi H & E (A) og MT (B) farvning indikerer et fravær af cellemateriale med bevarelse af bindevævet arkitektur H & E: hematoxylin og eosin, MT: Massons trichrom. Skala bar:. 100 um Klik her for at se større billede .
Figur 4.. . Electron Microscopy Scanning elektronmikroskopi indikerer den bevarede villus-crypt arkitektur i skafottet lumen, Scale bar:. 100 um Klik her for at se større billede .

Discussion

De mest vanskelige skridt i oprettelsen af ​​dette eksperiment indebærer kanylering af SMA og etablering og vedligeholdelse af sterilitet. Kanylering SMA hos gnavere uden brud på væggen kan være ganske vanskeligt på grund af størrelse og placering af fartøjet. Alternativt kan en sutur anbragt omkring den proksimale aorta forud for SMA oprindelse, efterfulgt af kanylering af aorta sig distalt dirigere plastikkanylen i SMA. Under decellularization en kombination af dårlig kanyle placering og høje strømningshastigheder kan resultere i at miste den vaskulære adgang. Sterilitet er et stort problem på grund af mængden af ​​bakterielle flora, der findes i tyndtarmen. Vask med PBS / AA efter høst er meget vigtig, og ethvert tegn på afføring eller snavs skal fjernes fra lumen. Placering af en del af stilladset i et Falcon-rør med DMEM i inkubatoren efter UV-sterilisering skal være en indikator, hvis sterilitet er opnået. I tilfældeaf bakteriel kolonisering, vil medierne ændre pH med sin farve vender fra rød til gul. At beskæftige sig med dette, rådes yderligere UV-cykler samt vask med PBS indeholdende en høj koncentration af antibiotikum / antimykotikum.

En mulig modifikation for at opnå et stillads med både vaskulære og venøs adgang ville være at cannulate inferior vena cava (IVC) samt SMA. Decellularization fra venøse og vaskulære sider bør forsøges med mellemrum for alle tre løsninger. Kontinuerlig decellularization kan briste kapillærerne ved at have positivt tryk på begge sider.

Gennem årene har der været en række indsatser på tarm TE ved hjælp af forskellige celle-stillads kombinationer in vitro og in vivo ^6,9,12. Størstedelen af arbejdet er udført ved hjælp af rørformede nonwoven 95% PGA-5% PLGA stilladser overtrukket med collagen type I ^6,7,13,22. Efter såning med tarmepiteliale organoide enheder (OUS) og en periode på implantation i omentum af mus, danner cyster med muskel på ydersiden og epitel på indersiden, som derefter kan tubularized. Imidlertid porøsitet og enkelhed i udformningen af disse scaffolds ikke tillade til frembringelse af store stykker af kunstig tarm i et in vitro miljø, som den af en bioreaktor. Derudover mangler en medfødt vaskulære netværk, der kan forbindes til modtageren begrænser yderligere anvendelsen af ​​dette stillads til klinisk oversættelse. Ud over forsøgene med PGA-PLGA scaffolds har andre grupper anvendt collagen eller SIS stilladser, som begge ikke replikerer forviklinger af tarmkanalen. SIS i særdeleshed er den eneste tidligere offentliggjorte metode tarmvæv teknik og er blevet anvendt i mere end 150 medicinske indstillinger demonstrere evne decellulariseret stilladser at tilvejebringe mekanisk stabilitet og fremme cellevækst mens blyning til ingen immunogen reaktion. Men mangel på passende makro-og mikro-arkitektur, har ført til dårlige resultater i sin »brug for intestinal TE formål ^9-11,23.

Fordelene ved decellularization metode, vi har beskrevet, omfatter beskyttelse af mikroskopiske karakteristika såsom den luminale krypt-villus arkitektur, der repræsenterer et passende miljø for genoprettelse af tarmens stamceller niche. I den makroskopiske aspekt, vil tilstedeværelsen af en hierarkisk vaskulære netværk muliggøre fastgørelse til modtageren, således at levering af næringsstoffer og ilt til alle lag af TE-tarmen ^21. Hvad mere er, vedligeholdelse af ECM komponenter såsom collagen, elastin og glyocosaminoglycans har en vigtig rolle ikke kun for mekaniske egenskaber, men også at dirigere cellulær proliferation og differentiering. Vigtigst er det, at evnen af ​​decellularization metode skaleres op i storer væv og samtidig fastholde de samme egenskaber er en vigtig egenskab for klinisk oversættelse af TE.

Udviklingen af ​​en naturlig tarm matrix med en vaskulær netværk giver mulighed for etablering af større segmenter af kunstig tarm, der kan tilsluttes til værten.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol solution, 70% in H20	Sigma	02877
Phosphate buffered saline tablets	Sigma	79382
Antibiotic Antimycotic Solution (100x)	Sigma	A5955
Sodium deoxycholate	Sigma	D6750	Oral and eye irritant; use protection
Sodium chloride
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma	D5025