Summary
המאמר מתאר מתודולוגיה לייצור מטריצת acellular ממעי חולדה. הגזירה של פיגומי מעיים חשובה ליישומים עתידיים בתחום הנדסת רקמות, ביולוגיה של תאי גזע ובדיקות סמים.
Abstract
הנדסת רקמות מוצלחת כרוכה בשילוב של פיגומים עם תאים מתאימים במבחנה או in vivo. פיגומים עשויים להיות סינטטיים, באופן טבעי, שהופק או שמקורם ברקמות / איברים. האחרון מתקבלים באמצעות טכניקה המכונה decellularization. Decellularization עשוי להיות כרוך בשילוב של פיזי, כימי, ושיטות האנזימטית. המטרה של טכניקה זו היא להסיר את כל העקבות הסלולריות תוך שמירה על ארכיטקטורת מיקרו מקרו ושל הרקמה המקורית.
הנדסת רקמות מעיים עד כה השתמשה בפיגומים פשוטים יחסית שלא ישכפל את הארכיטקטורה המורכבת של האיברים הילידים. המוקד של מאמר זה הוא לתאר טכניקת decellularization יעילה למעי דק חולדה. הבידוד של המעי דק, כדי להבטיח השמירה על חיבור של כלי דם מתואר. השילוב של פתרונות כימיים והאנזימטית כדי להסיר את תאי whilst שימור הציר סיסי-קריפטה בהיבט luminal של הפיגום הוא גם יצא לדרך. לבסוף, הערכה של פיגומים הופקו עבור מאפיינים המתאימים לדיון.
Introduction
הנדסת רקמות (TE) מספקת אלטרנטיבה טיפולית להשתלת איברים, תוך עקיפת סוגיות של דיכוי חיסוני ומחסור באיברים. TE היה לאחרונה יישומים מוצלחים במרפאת, עם החלפה של איברים כגון שלפוחית השתן 1, 2 שופכה ואת קנה הנשימה, הן במבוגרים 3,4 וילדים 5.
בניית איבר רקמות מהונדסות מחייבת שילוב של פיגום עם התאים המתאימים. פיגום ניתן להכין באמצעות טבעית הנגזר (למשל קולגן) ו( חומצה למשל פולי-L-גליקולית; PLGA) סינתטית חומרים, או להשיג על ידי decellularization של איברים ורקמות מקומיים. פיגומים שהיו בשימוש עד כה לTE מעיים היו בעיקר שני decellularized (submucosa מעי הדק) או סינטטי (חומצת פולי-L-גליקולית וחומצה לקטית פולי) 6-13. חומרים ביולוגיים אלה הם פשוטים מאוד בשתי ארכיטקטורת מיקרו מקרו ו, אשרלא יכול להיות אידיאלי אם מעי רקמות מהונדסות הוא להיות מתורגם מבחינה קלינית. ביולוגי אופטימלית למעי צריך עץ בכלי דם מולדת שיכול להיות מחובר לאספקה של מארח דם, קיר צינורי שכבתי עם מאפיינים שונים על מנת לשקף את שכבות דופן המעי וציר סיסי-קריפטה בצד luminal כדי לסייע עם אכלוס על ידי תאי גזע אפיתל.
Decellularization הוא מתודולוגיה חדשנית שמייצרת פיגומים על ידי הסרת תאים מאיברים שלמים תוך שמירה על הארכיטקטורה המקורית שלהם 14. זה עדיף על קיים כבר פיגומים שכן הם לא רק לשכפל את המבנה של האיבר אבל גם מכילים אותות כימיים המוטבעים בתוך המטריצה תאית (ECM) שהתרבות תאי סיוע ובידול. בשנת 2008 קנה הנשימה מגופות היה decellularized 14, נזרע עם תאים של החולה עצמו, ומושתל להחליף את הסמפונות השמאל העיקרית בבחור צעיר
יש לנו גם להתאים אותן השיטות כדי לייצר פיגום decellularized מעי דק 21. המטרה של השיטה המתוארת במסמך זה היא לייצר מטריצות מעיים decellularized, כי לשמור על המאפיינים מקרוסקופית של רקמה המקורית כגון אספקת הדם, כמו גם את הארכיטקטורה המיקרוסקופית של הציר סיסי-קריפטה בחלל המעי. אנו מאמינים במתודולוגיה זו סופו של דבר יכולה להיות מאומץ על איברים אחרים כדי לשפר את היעילות של decellularization.
Protocol
1. בידוד של עכברוש מעי
- הכן פתרון 1 ליטר של בופר פוספט (Sigma, בריטניה) עם 1% אנטיביוטיקה / antimycotic (Sigma, בריטניה) (PBS / AA). להתאים את משאבת peristaltic (מהירות משתנה L Masterflex / S) עם שני צינורות. הפעל 70% אתנול (EtOH) דרך הצינורות של משאבת peristaltic ל15 דקות במהירות המרבית, ואחריו PBS / AA לעוד דקות 15.
- להרדים חולדות ספראג-Dawley בוגרת במשקל של כ 250-350 גר 'על ידי CO 2 שאיפה ונקע בצוואר הרחם על פי הנחיות מקומיות של בעלי חיים ואישורים (בבריטניה, הנחיות משרד פנים תחת בעלי חיים (הליכים מדעיים) Act 1986).
- החיטוי מכשירי הניתוח לפני השימוש. ספריי ולנגב את הבטן של החיה באמצעות EtOH 70%.
- בצע חתך laparotomic xifo-ערווה על הבטן כדי להבטיח שדה ניתוחי ברור.
- כסחת את המעי הדק בצד ימין של החיה על מגבת נייר ריססה עם EtOH 70%. Takטיפול בדואר להרטיב ברציפות המעי עם PBS / AA כדי למנוע התייבשות של הרקמות וdenaturation של מטריקס תאי (ECM).
- אתר את עורק mesenteric מעולה (SMA), שנובע בזווית של ° 90 מאב העורקים לכיוון המעי. השתמש בצינורית G 27 להיכנס SMA מאב העורקים ובמהירות למשוך את המחט כדי למנוע את קריעת הקיר של כלי השיט. לקדם את צינור הפלסטיק של הצינורית לתוך SMA ומאובטח באמצעות תפרים (Vicryl 5/0).
- לאשר cannulation על ידי הזרקת 1 מיליליטר של PBS / AA. השתמש במספריים באביב כדי לחתוך הפרוקסימלי אב העורקים ודיסטלי SMA כדי לשחרר את הצינורית.
- כדי למנוע דליפה של צואה כאשר לנתח את המעי גס, במקום אחד (משי 5/0) קשר תפר בקצה הפרוקסימלי של צומת ileocaecal ואחד בקצה הדיסטלי של המעי הגס סיגמואיד. ואז לחתוך את מעי סופני ומעי גס בין שני קשרים ולהסיר את המעי גס.
- חותכים את המעי בצומת jejuno-התריסריוןnd לשחרר את המעי מכל חיבורי רקמות חיבור זה יכול להיות עם הבטן.
- העבר את המעי הדק בצלחת פטרי עם PBS / AA. Cannulate הקטע הפרוקסימלי של המעי עם טפטפת פלסטיק פסטר (מתכלה המעבדה LSL) ולאבטח אותו במקום עם תפרים. חותכים את פיפטה כך שהוא יתאים Luer-לוק של מזרק 60 מיליליטר (BD Plastipak). סומק לומן המעיים 2X עם 60 מיליליטר של PBS / AA להסיר את הצואה ופסולת.
2. מתודולוגיה Decellularization
- חבר את צינורית כלי הדם לברזלי שלוש דרך. זה יקל טיפול, לצמצם את המתח על העץ בכלי הדם ומאפשר הסרת בועות מהצינורות.
- התחל מים זורמים deionized (18.2 MΩ / סנטימטר התנגדות) באמצעות משאבת ההרים מהירות משתנה L Masterflex / S ב0.6 מיליליטר / שעה. ודא שאין בועות נמצאות בתוך צינורות לפני חיבור עם ברזלים חלל מעי. בועות מסוימות עשויות להיות נוכחת בתוך לומן מצעד1.9, אשר עלול לפגוע בתהליך decellularization. לשנות את המהירות של המשאבה ולטפל ברקמות עם מלקחיים בזהירות כדי להבטיח את יציאת בועות מהקצה הדיסטלי. אל תחבר את צינורית כלי הדם עד שתהליך זה יסתיים מאז מהירויות גבוהות עלולות לגרום נזק לעץ בכלי הדם.
- העבר את המכשיר לחדר הקר, שכן הצעד של decellularization הבא מתבצע ב 4 ° C. הטמפרטורה הנמוכה מאפשרת הסרת התאים תוך מזעור פירוק רקמות. מניחים את צלחת פטרי במכל שיאסוף את הפתרון שעלה על הגדות. תנקב שניהם חלל המעי והעץ בכלי הדם במי deionized (התנגדות 18.2 MΩ / סנטימטר) ל24 שעות ב0.6 מיליליטר / שעה. בשעה הראשונה לבדוק את המנגנון באופן קבוע על מנת להבטיח את כל החיבורים מאובטחים, דליפה היא מינימאלית ואין בועות נמצאות בתוך המעי.
- לאחר 24 שעות של טיפול במי deionized, להעביר מנגנון decellularization מחוץ לחדר הקר כמו שאר השלבים הםמתבצע בטמפרטורת חדר (RT).
- שוקל deoxycholate נתרן (Sigma, בריטניה) כדי להכין 300 מיליליטר של פתרון 4% במי deionized. שוקל deoxycholate נתרן מתחת למכסת מנוע יניקה, כפי שהוא גירוי אוראלי ועין. מערבבים בעזרת מערבולת עד הפתרון הוא ברור. הפתרון עשוי להישמר על 4 מעלות צלזיוס עד חודש 1.
- לשנות את פתרון deionized לdeoxycholate נתרן, בדוק את החיבורים, להסיר כל בועות וינקבו ב0.6 מיליליטר / שעה במשך 4 שעות.
- בעקבות לשטוף צעד deoxycholate נתרן עם PBS / AA ל30 דקות, כדי למנוע אינטראקציה בין deoxycholate נתרן וDNase-I.
- לשקול את deoxyribonuclease-I (DNase-I, Sigma) ולהכין 250 מיליליטר של פתרון 2,000 KU בנתרן כלורי 1 מ ', pH 7.4. מערבבים בעזרת מערבולת עד הפתרון הוא ברור. פתרון זה חייב להיות מוכן מייד לפני השימוש ולא יכול להיות מאוחסן.
- תנקב עם DNase-במשך 3 שעות ב RT במהירות של 0.6 מיליליטר / שעה.
- בעקבות DNase-אני הצעד, להעביר אתפיגום לתוך מכסה המנוע בתרבית רקמה ולשנות צלחות ומכשירים. הוא הציע להשתמש בטכניקה מזוהמת.
- לשטוף עם PBS / AA ל30 דקות כדי להבטיח את כל השאריות של פתרונות decellularization יוסרו. הנח את הפיגום בצלחת פטרי חדשה ולהעביר לcrosslinker UV (Spectroline, ארה"ב). להפעיל שני מחזורי עיקור. אחסן ב5% PBS / AA ולשנות את הפתרון כל 3 ימים.
Representative Results
על decellularization המוצלח (איור 1), הפיגום צריך להיות מראה מאקרוסקופי דומה לזה של המעי המקומי, אבל עם (איור 2 א) קירות שקופים. שימור המאקרו הארכיטקטורה צריך להיות גם לידי ביטוי על ידי patency של העץ בכלי הדם. כאשר הצבע מוזרק דרך צינורית SMA, יש לפזר באופן אחיד לאורך כל הפיגום ולהגיע לעץ הנימים (איור 2). הפיגום צריך להיות חופשי של חומר גרעיני וcytoplasmic, משהו שניתן להעריך באמצעות ערכת כימות DNA וניתוח היסטולוגית פשוט. Hematoxylin ומכתים eosin (H & E) צריכה להוכיח היעדר חומר גרעיני וcytoplasmic תוך שמירה על שכבות המעי הדקות (איור 3 א). בפרט, התחזוקה של villi ומאורות בצד luminal צריכה להיות ברורה הבאה מיקרוסקופיית אלקטרונים (איור 4).גם שימור של רכיבי מטריצה תאיים כגון קולגן, אלסטין וglycosaminoglycans צריך להיות צפוי. לדוגמא, רקמת חיבור ללא פגע מציג מכתים Trichrome של האסון בפיגום (איור 3 ב).
איור 1. . תכנית ניסיונית ציר זמן של הליך decellularization; PBS / א.א.: פוספט שנאגרו מלוח עם NaDeoxy האנטיביוטיקה antimycotic,: deoxycholate נתרן, RT: טמפרטורת חדר, DNAse-I: deoxyribonuclease-I. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 2. macroscopi פיגוםג מאפיינים. מראה מקרוסקופית של המעי הדק העכברוש הבא decellularization המוצלח (). הזרקה של רוסו Ponceau לצבוע באמצעות SMA מדגימה רשת שלמה של כלי דם (B); SMA: עורק mesenteric מעולה לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. . היסטולוגיה H & E () ומכתים MT (ב ') מצביעים על העדרו של חומר תאי עם שימור ארכיטקטורת רקמת חיבור; H & E: hematoxylin ו eosin, MT: Trichrome של מייסון. בר סולם:. 100 מיקרומטר לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר. 
איור 4. . מיקרוסקופ אלקטרונים מיקרוסקופית אלקטרונים סריקה מציין את הארכיטקטורה סיסי-קריפטה השתמרה בלומן הפיגום; בר סולם:. 100 מיקרומטר לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
Discussion
הצעדים הקשים ביותר בהקמת ניסוי זה כרוך cannulation של SMA והקמה והתחזוקה של עקרות. Cannulating SMA במכרסמים ללא פקיעת הקיר יכול להיות די קשה בשל הגודל והמיקום של כלי השיט. לחלופין, תפר ניתן להציב סביב אב העורקים הפרוקסימלי לפני המוצא SMA, ואחריו cannulation של אב העורקים עצמו distally, בימוי צינורית הפלסטיק לתוך SMA. במהלך decellularization שילוב של מיקום צינורית עני וספיקות גבוהות עלול לגרום לאבד את הגישה של כלי הדם. עקרות היא בעיה רצינית עקב כמות של חי חיידקים הנמצאים במעי הדק. שטיפה עם PBS / AA הבאה קציר היא מאוד חשובה, וכל סימן של עניין או פסולת בצואה יש להסיר מלומן. הצבת חלק מהפיגום בצינור בז עם DMEM בחממה הבאה עיקור UV צריכה להיות אינדיקטור אם עקרות הושגו. במקרההקולוניזציה חיידקים, התקשורת תשנה את ה-pH עם הצבע שלו הופך מאדום לצהוב. כדי להתמודד עם זה, מחזורי UV נוספים מומלץ וכן כביסה עם PBS המכיל ריכוז גבוה של האנטיביוטיקה / antimycotic.
שינוי להסיג לך פיגום עם גישת שני כלי דם וורידים יהיה cannulate נחות הווריד הנבוב (IVC), כמו גם מחברת SMA. Decellularization מצדדי ורידים וכלי דם צריך להיות ניסיון לסירוגין במשך כל שלושת הפתרונות. decellularization המתמשך עלול להתפוצץ נימי הדם על ידי שיש לחץ חיובי על שני הצדדים.
במהלך השנים היו מספר ניסיונות במעיים TE באמצעות שילובי תא פיגום שונים במבחנה in vivo 6,9,12. רוב העבודה שבוצע באמצעות פיגומי PLGA צינורי 95%% PGA-5 לא ארוגים מצופים בסוג אני 6,7,13,22 קולגן. הזריעה הבאה עם מעייםיחידות אפיתל organoid (יחידות ארגוניות) ותקופה של השתלה לתוך omentum של עכברים, הם יוצרים ציסטות בשרירים בצד החיצוני והאפיתל בחלק הפנימי אשר לאחר מכן ניתן tubularized. עם זאת, הנקבוביות והפשטות בעיצוב של פיגומים אלה אינם מאפשרים לדור של חתיכות גדולות של מעי מלאכותי בסביבה במבחנה כמו זו של bioreactor. בנוסף, המחסור ברשת כלי דם מולדת שיכול להיות מחוברת לנמען נוסף מגבילה את השימוש בפיגום הזה לתרגום קליני. חוץ מהניסויים עם פיגומי PGA-PLGA, קבוצות אחרות השתמשו בפיגומי קולגן או SIS, אשר שניהם לא לשכפל את המורכבות של מערכת העיכול. SIS בפרט הוא המתודולוגיה שפורסמה קודמת רק של הנדסת רקמות מעיים וכבר בשימוש בלמעלה מ 150 הגדרות רפואיות, הממחיש את יכולתה של פיגומי decellularized לספק יציבות מכאנית ולקדם את צמיחת תאים תוך הובלהing לשום תגובת immunogenic. עם זאת, חוסר ארכיטקטורת מיקרו מקרו ומתאים, הוביל לתוצאות גרועות בשימוש בו "למטרות TE מעיים 9-11,23.
היתרונות של מתודולוגיה decellularization שתארנו כוללים את שימור מאפיינים מיקרוסקופיים כגון ארכיטקטורת קריפטה-סיסי luminal המייצגים את הסביבה מתאימה לאכלוס על ידי הנישה תאי גזע במעי. בהיבט מאקרוסקופי, הנוכחות של רשת כלי דם היררכית תאפשר קובץ מצורף לנמען, המאפשרת מתן חומרי מזון וחמצן לכל השכבה של TE-המעי 21. מה הוא יותר, התחזוקה של רכיבי ECM כגון קולגן, אלסטין וglyocosaminoglycans יש תפקיד חשוב לא רק למאפיינים מכאניים, אלא גם מכוונים את הריבוי והתמיינות תאיים. והכי חשוב, את היכולת של המתודולוגיה decellularization להיות מדורגת עד לגדולרקמות r תוך שמירה על אותם המאפיינים היא תכונה חשובה לתרגום קליני של TE.
הפיתוח של מטריקס מעיים טבעי עם רשת כלי דם מאפשר יצירה של מגזרים גדולים יותר של מעי מלאכותי שיכול להיות מחובר למחשב המארח.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
המחברים מודים וייק פורסט המכון לרפואת רגנרטיבית לעזרתם עם פיתוח של פרוטוקול זה. אנו מכירים תמיכה על ידי תרומות של הצדקה רחוב גרייט אורמונד בבית החולים, הקרן Eugenio Litta (ז'נבה, שוויץ), המועצה למחקר הרפואי, מכללת מנתחים המלכותית של אנגליה, הצדקה הרפואית של ניצוצות הילדים, משרד החוץ הבריטי לבריטניה / ארה"ב גזע פרס שיתוף פעולה נייד וקרן המחקר למיטאל. כמו כן, אנו רוצים להודות לקרן החברה המלכותית / וולפסון למענק שיפוץ מעבדת הנדסת רקמות שהתקבל למחלקה לכירורגיית הילדים במכון לבריאות ילד. PDC ו SE נתמך על ידי הצדקה של רחוב אורמונד בית החולים לילדים הגדולים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol solution, 70% in H20 | Sigma | 02877 | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma | 79382 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma | A5955 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | Oral and eye irritant; use protection |
| Sodium chloride | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025 |
References
- Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).
- Raya-Rivera, A., Esquiliano, D. R., Yoo, J. J., Lopez-Bayghen, E., Soker, S., Atala, A. Tissue-engineered autologous urethras for patients who need reconstruction: an observational study. Lancet. 377 (9772), 1175-1182 (2011).
- Macchiarini, P., Jungebluth, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
- Macchiarini, P., Walles, T., Biancosino, C., Mertsching, H. First human transplantation of a bioengineered airway tissue. J. Thorac. Cardiov. Surg. 128 (4), 638-641 (2004).
- Elliott, M. J., de Coppi, P., et al. Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: a 2-year follow-up study. Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).
- Grikscheit, T. C., Siddique, A., et al. Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection. Ann. Surg. 240 (5), 748-754 (2004).
- Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., Torashima, Y., Barthel, E. R., Grikscheit, T. C. A Multicellular Approach Forms a Significant Amount of Tissue-Engineered Small Intestine in the Mouse. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Matthews, J. A., Sala, F. G., Speer, A. L., Warburton, D., Grikscheit, T. C. VEGF optimizes the formation of tissue-engineered small intestine. Regen. Med. 6 (5), 559-567 (2011).
- Chen, M. K., Badylak, S. F. Small bowel tissue engineering using small intestinal submucosa as a scaffold. J. Surg. Res. 99 (2), 352-358 (2001).
- Wang, Z. Q., Watanabe, Y., Toki, A. Experimental assessment of small intestinal submucosa as a small bowel graft in a rat model. J. Pediatr. Surg. 38 (11), 1596-1601 (2003).
- Wang, Z. Q., Watanabe, Y., Noda, T., Yoshida, A., Oyama, T., Toki, A. Morphologic evaluation of regenerated small bowel by small intestinal submucosa. J. Pediatr. Surg. 40 (12), 1898-1902 (2005).
- Hori, Y., Nakamura, T., et al. Experimental study on tissue engineering of the small intestine by mesenchymal stem cell seeding. J. Surg. Res. 102 (2), 156-160 (2002).
- Gardner-Thorpe, J., Grikscheit, T. C., et al.
- Conconi, M. T., Coppi, P. D., et al. Tracheal matrices, obtained by a detergent-enzymatic method, support in vitro the adhesion of chondrocytes and tracheal epithelial cells. Transpl. Int. 18 (6), 727-734 (2005).
- Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14 (2), 213-221 (2008).
- Uygun, B. E., Soto-Gutierrez, A., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. , 1-8 (2010).
- Uygun, B. E., Price, G., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. J. Vis. Exp. (48), e2394 (2011).
- Petersen, T. H., Calle, E. A., et al. Tissue-Engineered Lungs for in Vivo Implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
- Ott, H. C., Clippinger, B., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16 (8), 927-933 (2010).
- Calle, E. A., Petersen, T. H., Niklason, L. E.
- Totonelli, G., Maghsoudlou, P., et al. A rat decellularized small bowel scaffold that preserves villus-crypt architecture for intestinal regeneration. Biomaterials. 33 (12), 3401-3410 (2012).
- Sala, F. G., Kunisaki, S. M., Ochoa, E. R., Vacanti, J., Grikscheit, T. C. Tissue-engineered small intestine and stomach form from autologous tissue in a preclinical large animal model. J. Surg. Res. 156 (2), 205-212 (2009).
- Demirbilek, S., Kanmaz, T., Ozardali, I., Edali, M. N., Yücesan, S. Using porcine small intestinal submucosa in intestinal regeneration. Pediatr. Surg. Int. 19 (8), 588-592 (2003).
