Summary
В статье описывается методика производства бесклеточной матрицы от крыс кишечника. Вывод кишечных лесов имеет важное значение для будущих применений в тканевой инженерии, клеточной биологии и тестирования на наркотики стволовых.
Abstract
Успешное тканевая инженерия включает в себя комбинацию лесов с соответствующими клеток в пробирке или в естественных условиях. Строительные леса могут быть синтетическими, естественно, полученных или получен из тканей / органов. Последние получаются с помощью метода, называемого decellularization. Decellularization может включать сочетание физических, химических, и ферментативных методов. Цель этого метода заключается в удалении всех сотовых следы при сохранении макро-и микро-архитектуру исходной ткани.
Кишечные тканевой инженерии до сих пор используется относительно простые строительные леса, которые не воспроизводят сложную архитектуру родного органа. В центре внимания этой работы является описание эффективную технику decellularization для тонкой кишки крыс. Выделение тонкого кишечника с тем, чтобы обеспечить поддержание сосудистого связи описывается. Сочетание химических и ферментативных решений для удаления клеток Whilул сохранения ворсинок-склеп ось в просвете аспекте эшафот также изложены. Наконец, оценка произведенных лесов для соответствующих характеристик обсуждается.
Introduction
Тканевая инженерия (TE) обеспечивает терапевтический альтернативу трансплантации органов, минуя вопросы иммуносупрессии и нехватки органов. TE недавно была успешного применения в клинике, с заменой органах, таких как мочевой пузырь 1, 2 уретры и трахеи, как у взрослых и детей 3,4 5.
Построение тканевой инженерии орган требует сочетания эшафот с соответствующими клетками. Подмости могут быть получены с использованием естественно, производный (например, коллагена) и синтетические (например, поли-L-гликолевая кислота; PLGA) материалов, или быть получены путем decellularization нативных органов и тканей. Леса, которые были использованы до сих пор для кишечного TE были в основном либо decellularized (тонкого кишечника подслизистой) или синтетические (поли-L-гликолевой кислоты и поли-молочная кислота) 6-13. Эти биоматериалы очень просты как в макро-и микро-архитектуры, котораяне может быть идеальным, если тканевой инженерии кишка должна быть клинически переведены. Оптимальный биоматериал для кишечника должны иметь врожденную сосудистую дерево, которое можно подключить к кровоснабжения хозяина, многоуровневой трубчатой стенки с разными свойствами, чтобы отразить слои кишечной стенки и ворсинок-склеп оси на стороны просвета, чтобы помочь с репопуляция эпителиальными стволовыми клетками.
Decellularization является новым методология, которая производит строительные леса, удаляя клетки от целых органов при сохранении их оригинальной архитектурой 14. Это является предпочтительным, чтобы уже существующих строительных лесов, поскольку они не только копировать структуру органа, но и содержат химические сигналы, встроенные в внеклеточного матрикса (ECM), которые помогают клеточной пролиферации и дифференцировки. В 2008 трупный трахею decellularized 14, затравку собственных клеток пациента, и пересадить заменить основные левого бронха в молодого человека
Мы также адаптировать ту же методологию, чтобы произвести небольшой кишечной decellularized эшафот 21. Целью описанного здесь способа является получение decellularized кишечных матрицы, которые поддерживают макроскопические характеристики исходной ткани, такой как кровоснабжения, а также микроскопического архитектуры ворсинок-Crypt оси в просвет кишечника. Мы считаем, эта методология может в конечном итоге быть принят для других органов, чтобы повысить эффективность decellularization.
Protocol
1. Выделение Rat кишечника
- Подготовка 1 л раствора фосфатно-солевом буфере (Sigma, UK) с 1% антибиотик / противогрибкового средства (Sigma, UK) (PBS / AA). Установите перистальтического насоса (Masterflex L / S с переменной скоростью) с двумя трубками. Запуск 70% этанола (EtOH) через трубы перистальтического насоса в течение 15 мин при максимальной скорости, а затем PBS / AA еще 15 мин.
- Усыпить взрослых Спрэг Dawley крыс весом примерно 250-350 г на СО 2 вдоха и смещения шейных позвонков, в соответствии с местными нормативными документами животных и согласований (в Великобритании, домашний офис принципов согласно животных (научные процедуры) Закон 1986).
- Автоклав хирургических инструментов перед использованием. Спрей и протрите живот животного с помощью 70% этанола.
- Выполните xifo-лобковые лапаротомной разрез на животе, что обеспечивает четкое операционного поля.
- Потрошение тонкую кишку с правой стороны животного на бумажное полотенце, распыляемой с 70% этанола. Таке уход непрерывно смачивать кишки с PBS / AA так, чтобы избежать дегидратацию ткани и денатурации внеклеточного матрикса (ECM).
- Найдите верхней брыжеечной артерии (SMA), возникающие в под углом 90 ° от аорты к кишечнике. С помощью 27 г канюли, чтобы войти в SMA от аорты и быстро вывести иглы, чтобы избежать разрыва стенки сосуда. Авансовые пластиковую трубку канюли в SMA и закрепите при помощи швов (викрил 5/0).
- Подтвердите катетеризации путем введения 1 мл PBS / AA. С помощью пружинных ножницы, чтобы надрезать аорты проксимальных и дистальных к SMA с тем, чтобы освободить канюли.
- Чтобы избежать утечки кала при вскрытии из толстой кишки, разместить один (шелк 5/0) шовный узел на проксимальном конце ileocaecal перехода и один в дальнем конце сигмовидной кишки. Затем вырежьте терминального отдела подвздошной кишки и толстой кишки между двумя узлами и удалить толстую кишку.
- Разрежьте кишечник в тощую-перстной узлом ай освободить кишечник от любых соединительных соединений тканевых это, возможно, с живота.
- Передача тонкую кишку в чашке Петри с PBS / AA. Иглу проксимального раздел кишечника с пластиковой пипетки Пастера (LSL Лабораторные расходные материалы) и закрепить ее на месте со швами. Разрежьте пипетку, чтобы она подошла к Luer-Lok из 60 мл шприц (BD Plastipak). Флеш просвет кишечника 2x 60 мл PBS / AA удалить фекалии и мусор.
2. Методология Decellularization
- Подключите сосудистой канюли к трехходовым краном. Это облегчит обработку, минимизировать напряженность на сосудистую сеть и позволяют удалить из них пузырьки от трубки.
- Начать работает деионизированную воду (18,2 удельное сопротивление МОм / см) через переменной скоростью роликового насоса Masterflex л / с при 0,6 мл / час. Убедитесь, никаких пузырей не присутствуют в трубки до подключения с краном просвета кишечника. Некоторые пузырьки могут присутствовать в просвете со стадии1.9, которые могут влиять на процесс decellularization. Изменять скорость насоса и обрабатывать ткань пинцетом осторожно, чтобы обеспечить выход пузырьков из дистального конца. Не подключайте сосудистой канюли, пока этот процесс не будет завершен, так как высокие скорости может привести к повреждению сосудов дерево.
- Перевести аппарат в холодной комнате, так как следующая ступень decellularization выполняется при 4 ° С. Низкая температура позволяет удаление клеток при минимизации ткани разложение. Поместите чашку Петри в контейнере, который будет собирать переполненной решение. Заливать как просвет кишечника и сосудистую сеть деионизированной водой (удельное сопротивление 18,2 МОм / см) в течение 24 ч при 0,6 мл / час. В течение первого часа проверить аппарат регулярно, чтобы обеспечить надежность всех соединений, утечка минимальна и никаких пузырей не присутствуют в кишечнике.
- После 24 часов лечения с деионизированной водой, двигаться decellularization аппарат вне холодной комнате, как и остальные шагипроведены при комнатной температуре (RT).
- Взвесить дезоксихолат натрия (Sigma, UK) с получением 300 мл 4% раствора в деионизированной воде. Взвесьте дезоксихолат натрия под всасывания капотом, как это устное и раздражение глаз. Смешайте с помощью вихрь, пока раствор не станет прозрачным. Решение может поддерживаться при 4 ° С в течение 1 месяца.
- Измените деионизированной решение дезоксихолата натрия, проверьте соединения, удалить пузырьки и заливать на 0,6 мл / ч в течение 4 часов.
- После дезоксихолат натрия стадии промывки с PBS / AA в течение 30 мин, чтобы избежать взаимодействия между дезоксихолата натрия и ДНКазой-I.
- Взвесить дезоксирибонуклеазы-I (ДНКазы-I, Sigma) и подготовить 250 мл раствора 2000 Ku в 1 М хлорида натрия, рН 7,4. Смешайте с помощью вихрь, пока раствор не станет прозрачным. Это решение должно быть приготовлено непосредственно перед использованием и не могут быть сохранены.
- Заливать с ДНКазой-I в течение 3 ч при комнатной температуре со скоростью 0,6 мл / час.
- После ДНКаза-I этапе, трансферстроительные леса в капот культуры ткани и изменить тарелки и приборы. Предлагается использовать асептики.
- Промыть PBS / АА в течение 30 мин, чтобы гарантировать, что все остатки decellularization решений удаляются. Поместите на эшафот в новом чашку Петри и переносят в УФ Crosslinker (Spectroline, США). Запуск двух циклов стерилизации. Хранить в 5% PBS / AA и изменить решение каждые 3 дня.
Representative Results
После успешного decellularization (рис. 1), подмости должны иметь макроскопический внешний вид, похожий на одного из родного кишечника, но с полупрозрачные стены (рис. 2А). Сохранение макро-архитектуры также должны быть видно по проходимости сосудов дерева. Когда краситель вводят через канюлю SMA, следует равномерно распределить по всей строительных лесов и достичь капиллярную дерево (фиг.2В). Леса должны быть свободны от ядерной и цитоплазматической материала, то, что может быть оценена с использованием набора количественного ДНК и простой гистологический анализ. Гематоксилин и эозином (H & E) должны продемонстрировать отсутствие ядерной и цитоплазматической материала при сохранении тонкого кишечника слоев (рис. 3А). В частности, содержание ворсинок и крипт на стороне просвета должно быть очевидно следующее сканирующей электронной микроскопии (рис. 4).сохранение компонентов внеклеточного матрикса, таких как коллаген, эластин и гликозаминогликаны также ожидать не следует. Например, TriChrome окрашивания дисплеи Массона нетронутыми соединительной ткани в эшафот (рис. 3В).
Рисунок 1. . Экспериментальное план Хронология процедуры decellularization; PBS / А.А.: фосфатно-солевой буфер с антибиотиками противогрибковое, NaDeoxy: натрия дезоксихолат, RT: комнатная температура, DNAse-я: дезоксирибонуклеазы-я. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 2. Леса макроскопическис характеристики. Макроскопическая появление тонкой кишки крыс после успешного decellularization (А). Инъекция Rosso Ponceau краску через SMA демонстрирует нетронутыми сосудистой системы (B); SMA: верхняя брыжеечная артерия Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Рисунок 3. . Гистологии H & E (A) и MT (B) окрашивание указывает на отсутствие клеточного материала с сохранением архитектуры соединительной ткани, H & E: гематоксилином и эозином, MT: трехцветный Массона. Шкала бар:. 100 мкм Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение . 
Рисунок 4. . Электронная микроскопия сканирующей электронной микроскопии показывает сохранившийся ворсинок-склеп архитектуры в каркасных просвета; Шкала бар:. 100 мкм Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .
Discussion
Самые трудные шаги в создании этого эксперимента предполагают катетеризации SMA и установление и поддержание стерильности. Cannulating на SMA у грызунов без разрушения стены может быть довольно трудно из-за размера и положения судна. Кроме того, шов может быть помещен вокруг проксимальной аорты до начала SMA происхождения, а затем катетеризации аорты непосредственно дистально, направляя пластиковую канюлю в SMA. Во decellularization сочетание плохого размещения канюли и высоких скоростях потока может привести к потере сосудистого доступа. Стерильность является серьезной проблемой из-за количества бактериальной флоры, присутствующих в тонком кишечнике. Промывка PBS / AA следующее урожая очень важна, и любой признак фекалий или мусора должны быть удалены из просвета. Размещение часть строительных лесов в трубки сокола с DMEM в инкубаторе следующее УФ стерилизации должны быть индикатором если стерильность была достигнута. В случаебактериальной колонизации, СМИ изменится рН с его цвет поворота от красного до желтого. Чтобы справиться с этим, рекомендуется дальнейшие циклы УФ а также промывки ФБР, содержащим высокую концентрацию антибиотика / противогрибкового средства.
Возможная модификация, чтобы получить каркас с обоих сосудов и венозного доступа будет иглу нижней полой вены (НПВ), а также SMA. Decellularization от венозных и сосудистых сторон должно быть предпринято с перерывами в течение всех трех решений. Непрерывная decellularization может лопнуть капилляры, имея положительное давление на обе стороны.
За эти годы был проведен ряд усилий в кишечной TE с использованием различных комбинаций клеток эшафот в пробирке и в естественных 6,9,12. Большинство работ было выполнено с помощью трубчатых нетканый 95% PGA-5% PLGA строительных лесов, покрытые коллагена типа I 6,7,13,22. После посева с кишечнымиэпителиальные органоидные единиц (OU) и период имплантации в сальнике мышей, они образуют цисты с мышц на внешней стороне и эпителия на внутренней которые затем могут быть tubularized. Однако пористость и простота в конструкции этих каркасов не позволяет для генерирования больших кусков искусственного кишечника в среде в пробирке как, например, из биореактора. Кроме того, отсутствие врожденной сосудистой сети, которые могут быть подключены к получателю дополнительно ограничивает использование этого каркаса для клинического перевода. Кроме экспериментов с лесов PGA-PLGA, другие группы использовали коллаген или SIS строительных лесов, оба из которых не воспроизводят сложность кишечного тракта. SIS в частности является единственным предыдущая опубликована методология кишечной тканевой инженерии и была использована в более чем 150 медицинских учреждениях, демонстрируя способность decellularized лесов, чтобы обеспечить механическую стабильность и способствовать росту клеток в то время как ведущийING ни к какому иммуногенной реакции. Тем не менее, отсутствие надлежащей макро-и микро-архитектуры, привело к плохим результатам в своей «использования для кишечных целей ТЕ 9-11,23.
Преимущества методологии decellularization мы описанные включают сохранение микроскопических характеристик, таких как люминальной архитектуры склеп-ворсинок, которые представляют соответствующую среду для репопуляции кишечным нише стволовых клеток. В макроскопическом аспекте наличие иерархической сосудистой сети позволит приложение к получателю, позволяя предоставление питательных веществ и кислорода ко всем слое TE-кишечнике 21. Более того, содержание ECM компонентов, таких как коллаген, эластин и glyocosaminoglycans играет важную роль не только для механических характеристик, но и направляющий клеточную пролиферацию и дифференцировку. Самое главное, способность методологии decellularization быть расширены в большойг ткани при сохранении же характеристики, является важной особенностью для клинического перевода ТЕ.
Развитие природного кишечного матрицы с сосудистой сети позволяет создавать более крупных сегментов искусственного кишечника, что может быть подключен к хосту.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы благодарят Wake Forest Институт регенеративной медицины за помощь с развитием этого протокола. Мы признаем поддержку за счет субсидий из благотворительности Великий больницы Ормонд-стрит, Фонд Эухенио Литта (Женева, Швейцария), Совет по медицинским исследованиям, Королевский колледж хирургов Англии, искры Детского медицинского милосердия, МИД Великобритании для Великобритании / США стволовых клеток премию сотрудничества и научно-исследовательский фонд Mittal. Мы также хотели бы поблагодарить Королевское общество / Wolfson Foundation для тканевой инженерии лаборатория реконструкции гранта, полученного для детской хирургии отдела в Институте детского здоровья. PDC и SE поддерживаются Great Ormond Street детской больнице Милосердия.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol solution, 70% in H20 | Sigma | 02877 | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma | 79382 | |
| Antibiotic Antimycotic Solution (100x) | Sigma | A5955 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D6750 | Oral and eye irritant; use protection |
| Sodium chloride | |||
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025 |
References
- Atala, A., Bauer, S. B., Soker, S., Yoo, J. J., Retik, A. B. Tissue-engineered autologous bladders for patients needing cystoplasty. Lancet. 367 (9518), 1241-1246 (2006).
- Raya-Rivera, A., Esquiliano, D. R., Yoo, J. J., Lopez-Bayghen, E., Soker, S., Atala, A. Tissue-engineered autologous urethras for patients who need reconstruction: an observational study. Lancet. 377 (9772), 1175-1182 (2011).
- Macchiarini, P., Jungebluth, P., et al. Clinical transplantation of a tissue-engineered airway. Lancet. 372 (9655), 2023-2030 (2008).
- Macchiarini, P., Walles, T., Biancosino, C., Mertsching, H. First human transplantation of a bioengineered airway tissue. J. Thorac. Cardiov. Surg. 128 (4), 638-641 (2004).
- Elliott, M. J., de Coppi, P., et al. Stem-cell-based, tissue engineered tracheal replacement in a child: a 2-year follow-up study. Lancet. 380 (9846), 994-1000 (2012).
- Grikscheit, T. C., Siddique, A., et al. Tissue-engineered small intestine improves recovery after massive small bowel resection. Ann. Surg. 240 (5), 748-754 (2004).
- Sala, F. G., Matthews, J. A., Speer, A. L., Torashima, Y., Barthel, E. R., Grikscheit, T. C. A Multicellular Approach Forms a Significant Amount of Tissue-Engineered Small Intestine in the Mouse. Tissue Eng. Part A. , (2011).
- Matthews, J. A., Sala, F. G., Speer, A. L., Warburton, D., Grikscheit, T. C. VEGF optimizes the formation of tissue-engineered small intestine. Regen. Med. 6 (5), 559-567 (2011).
- Chen, M. K., Badylak, S. F. Small bowel tissue engineering using small intestinal submucosa as a scaffold. J. Surg. Res. 99 (2), 352-358 (2001).
- Wang, Z. Q., Watanabe, Y., Toki, A. Experimental assessment of small intestinal submucosa as a small bowel graft in a rat model. J. Pediatr. Surg. 38 (11), 1596-1601 (2003).
- Wang, Z. Q., Watanabe, Y., Noda, T., Yoshida, A., Oyama, T., Toki, A. Morphologic evaluation of regenerated small bowel by small intestinal submucosa. J. Pediatr. Surg. 40 (12), 1898-1902 (2005).
- Hori, Y., Nakamura, T., et al. Experimental study on tissue engineering of the small intestine by mesenchymal stem cell seeding. J. Surg. Res. 102 (2), 156-160 (2002).
- Gardner-Thorpe, J., Grikscheit, T. C., et al.
- Conconi, M. T., Coppi, P. D., et al. Tracheal matrices, obtained by a detergent-enzymatic method, support in vitro the adhesion of chondrocytes and tracheal epithelial cells. Transpl. Int. 18 (6), 727-734 (2005).
- Ott, H. C., Matthiesen, T. S., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat. Med. 14 (2), 213-221 (2008).
- Uygun, B. E., Soto-Gutierrez, A., et al. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat. Med. , 1-8 (2010).
- Uygun, B. E., Price, G., et al. Decellularization and recellularization of whole livers. J. Vis. Exp. (48), e2394 (2011).
- Petersen, T. H., Calle, E. A., et al. Tissue-Engineered Lungs for in Vivo Implantation. Science. 329 (5991), 538-541 (2010).
- Ott, H. C., Clippinger, B., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat. Med. 16 (8), 927-933 (2010).
- Calle, E. A., Petersen, T. H., Niklason, L. E.
- Totonelli, G., Maghsoudlou, P., et al. A rat decellularized small bowel scaffold that preserves villus-crypt architecture for intestinal regeneration. Biomaterials. 33 (12), 3401-3410 (2012).
- Sala, F. G., Kunisaki, S. M., Ochoa, E. R., Vacanti, J., Grikscheit, T. C. Tissue-engineered small intestine and stomach form from autologous tissue in a preclinical large animal model. J. Surg. Res. 156 (2), 205-212 (2009).
- Demirbilek, S., Kanmaz, T., Ozardali, I., Edali, M. N., Yücesan, S. Using porcine small intestinal submucosa in intestinal regeneration. Pediatr. Surg. Int. 19 (8), 588-592 (2003).
