Summary
Эпидермального меланина индуцируется местного применения форсколином в мышиной модели справедливой кожей УФ-чувствительных человека. Фармакологическое воздействие уровня цАМФ в коже и эпидермиса затемнение сильно защищают от УФ-опосредованного воспаления (загара) как измеряется минимальной эритематозной дозы (МЭД) анализа.
Abstract
Справедливость кожи, чувствительности УФ и риском рака кожи все коррелируют с физиологической функции рецептора меланокортина 1, в G с связью сигнализации белок, содержащийся на поверхности меланоцитов. MC1R стимулирует аденилатциклазу и производство цАМФ, который, в свою очередь, до-регулирует пигментные выработку меланина в коже. Для изучения механизмов, посредством которых сигнализация MC1R защищает кожу от УФ травмы, это исследование опирается на мышиной модели с "гуманизированной кожи" на основе эпидермиса выражение фактора стволовых клеток (SCF). K14-SCF трансгенных мышей сохранить меланоциты в эпидермис и, следовательно, обладают способностью осаждаться меланина в эпидермисе. В этой модели на животных, дикого типа Состояния MC1R в надежной осаждения черного Эумеланин пигмента и фенотипа УФ-защитой. В отличие от этого, K14-SCF животные с дефектной сигнализации MC1R способности демонстрируют красный / блондинка пигментации, очень мало эумеланин в коже иУФ-чувствительный фенотип. Рассуждая, что Эумеланин отложение может быть повышена за счет местных средств, которые имитируют сигнализации MC1R, мы обнаружили, что прямое применение экстракта форсколином к коже MC1R-неполноценного справедливой кожей мышей привело к надежной Эумеланин индукции и УФ защиты 1. Здесь мы опишем способ получения и применения форсколином содержащий природный экстракт корня к K14-SCF светлокожих мышей и сообщить метод измерения чувствительности УФ путем определения минимального эритематозные дозу (MED). Используя эту модель животного, можно изучить, как эпидермальный цАМФ индукция и меланизации кожи влияют физиологические реакции на УФ-облучения.
Introduction
Заболеваемость меланомой, наиболее смертоносная форма рака кожи, резко возросло за последние несколько десятилетий в Соединенных Штатах, особенно среди светлокожих лиц. Сильный молекулярной и эпидемиологические данные подразумевает УФ-излучения в качестве основного причинного фактора окружающей среды 2-5. Увеличенная экспозиция УФ в виде солнечного воздействия и использования солярий, вероятно, будет ответственен за большую часть увеличения заболеваемости меланомой 6-7. Меланома риск кажется особенно связано с солнечных ожогов 8, особенно тех, в начале жизни 9-10. Риск загара связана не только с дозы и интенсивность ультрафиолетового облучения, но и наследственными факторами, которые влияют кожную реакцию на УФ-излучения. Пигментация кожи является одним из наиболее важных факторов, определяющих чувствительность УФ, риск солнечных ожогов и риском рака. Меланома встречается примерно в двадцать раз чаще у светлокожих людей по сравнению с темнокожей индивидовLs 11-13.
Меланин, пигмент производится меланоцитов в эпидермисе, является основным фактором, определяющим кожи лица. Меланин поставляется в двух основных вариантах: (1) Эумеланин, темно-коричневый / черный пигмент эффективно поглощает энергию УФ-излучения, и (2) феомеланин, красновато / блондинка пигментных менее эффективными в предотвращении проникновения ультрафиолетовых фотонов в кожу. Цвет кожи, чувствительность УФ и риск меланомы во многом определяются эпидермального Эумеланин содержания 14-15. Чем больше эумеланин в эпидермисе, тем меньше УФ фотоны могут проникать в кожу. Из-за низких врожденных уровнях эумеланин, светлокожие люди гораздо более склонны к острой и хронической воздействия УФ-излучения 16-18.
Пигментации кожи, риск меланомы и способность "загар" после УФ-облучения все коррелируют с возможностью передачи сигналов от рецептора меланокортина 1 (MC1R), G с связью семь трансмембранных сПоверхность рецептор на меланоцитов 19-22. Когда MC1R связывает его родственный высокого сродства лиганда, α-меланоцит стимулирующий гормон (α-МСГ), происходит активация аденилатциклазы и производства вторичного мессенджера цАМФ 23. Нормальная физиологическая реакция кожи после воздействия УФ-излучения включает эпидермальный производство α-МСГ по кератиноцитов 24-29. Мы и другие предполагают, что кератиноцитов, полученных α-MSH связывается с MC1R на эпидермальных меланоцитов, инициируя вниз по течению производство вторичного мессенджера цАМФ через активацию аденилатциклазы 30. уровни цАМФ контролировать многие аспекты меланоцитов дифференциации, в том числе путей выживания, репарации ДНК и синтеза пигмента. Сигнализации MC1R и цАМФ четко вызывают уровни фермента пигментные и производство Эумеланин. Когда сигнализация MC1R не поврежден и меланоцитарных уровни цАМФ являются надежными, эумеланин производится и кожа темнеет. Однако, если сигнализация MC1R неисправен ицитоплазматические уровни цАМФ остаются низкими, феомеланин производится вместо 1. Синтез Эумеланин можно стимулировать фармакологически агентами, которые повышают уровни цАМФ 1,14,31-35.
Поскольку белок MC1R является главным регулятором риска меланомы у людей 36-46, мы заинтересованы в механизмах, с помощью которых MC1R защищает меланоциты воздействию ультрафиолетового излучения канцерогенеза. В качестве основы для наших исследований, мы получили трансгенного MC1R-вариант мышиной модели на чистом C57BL / 6 генетического фона 1. В этой модели, фактор клеток (SCF) стволовых конститутивно экспрессируется в базальных эпидермиса и эпидермиса интерфолликулярной меланоциты сохраняются в коже на протяжении всей жизни 47, в отличие от не-трансгенных мышей, в котором меланоциты локализуются в дерме в волосяных фолликулах. С трансген K14-Scf включены, эпидермис становится пигментированные с конкретным меланина пигментов характеристики пигменташтамм животного 1. К14-SCF мышей на генетическом фоне C57BL / 6 с дикого типа MC1R сигнализации были черные как смоль кожи характеризуется очень высоким уровнем Эумеланин пигмента. Не удивительно, что эти животные обладают высокой УФ-излучению. Напротив, генетически подобранные K14-SCF C57BL / 6 животных, которые укрывают мутантный неактивный MC1R почти не эумеланин в эпидермисе. Вместо этого, эти "Расширение" животные (MC1R э / е) есть справедливый характер кожи, вызванное отложением феомеланин пигмента (рис. 1А) и являются гораздо более УФ-чувствительных 48-49.
Фармакологические соединения с химическими свойствами, которые позволяют проникновению в кожу, как было показано мощно индуцировать эумеланин в расширении (MC1R е / е) K14-SCF модели животных путем непосредственного манипулирования уровни цАМФ в эпидермальных меланоцитов в коже. Меланин регуляция в этой модели был гeported путем активации аденилатциклазы 1, а также ингибирования фосфодиэстеразы 4 35. В этой статье мы покажем, подготовку и местное применение форсколином в расширении (MC1R э / э) K14-SCF животные, какая модель со светлой кожей УФ-чувствительных людей. Мы покажем, что два раза в день применение препарата способствует ускоренной меланизации, что кожа потемнение связано с эпидермального осаждения пигмента меланина и, что индуцированное эпидермального меланина защищает от УФ-индуцированной загара через измерение «минимального эритематозной дозы» (МЭР) 48.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка Форсколин для местного применения из сырой экстракт корня от Plectranthus ЬагЬаШз (Cohleus Forskohlii) завод
- Протоколы для мышиных экспериментов в соответствии с руководящими для этического поведения в уходе и использовании животных и были утверждены Комитетом Институциональная уходу и использованию животных в Университете Кентукки (Протокол № 00768M2004) на. Экстракт корня состоит в 40% масса / объем в стандартном дерматологической базе 70% этанолом, 30% пропиленгликоля.
- Взвесьте 200 г экстракта корня сырой форсколином и передать его в стакан. Чтобы 500 мл 40% (вес / объем) раствор, ресуспендируют 200 г экстракта корня сырой добавлением форсколина большинство, но не все из объема транспортного средства (70% этанол, 30% пропиленгликоль) и довести раствор до примерно 450 мл.
- Перемешивают в течение часа при комнатной температуре. Решение будет несколько вязким и может потребовать ручной агитацию «поднять» экстракта в раствор домешалку способен взять на себя.
- После часа перемешивании влить смесь в градуированный цилиндр и довести объем до 500 мл с помощью транспортного средства, которая была использована для "промыть" стакан, который был использован для перемешивания суспензии (для максимального восстановления форсколином от стакана) .
- Передача суспензии до 50 мл полипропиленовые центрифужные пробирки. Центрифуга (1500 XG, комнатная температура, 15 мин), используя настольный центрифуги. В этот момент нерастворимый материал будет достаточно уплотнен, что позволяет супернатант, чтобы быть легко сливают.
- Раствор фильтруют через ацетат целлюлозы мембраны 0,22 мкм, чтобы удалить остатки нерастворимого материала из экстракта. Мы используем систему бутылка-топ, предназначенный для культуры клеток, наряду с использованием фильтров предварительной очистки, которые приходят вместе с устройством для предотвращения преждевременного засорения мембраны от нерастворимых компонентов экстракта корня. При принятии больших объемов экстракта, отфильтровать около 100 мл за один раз, меняя предварительной очистки ставкуWEEN каждый добавил объем.
- При хранении при комнатной температуре, экстракт сохраняет биологическую активность на срок до одного года.
2. Подготовка C57BL / 6 К14-Scf мышей для местного лечения
- Удалить спинной мех у животных электрическим стрижки. Кратко обезболить животных с легочной изофлураном для облегчения стрижки спинной меха с электрическими ножницами оснащенных 0,25 мм хирургического подготовительной головы (Fisher Scientific). Предпочтительно использовать только один тип анестезии (например кетамин / ксилазина), чтобы минимизировать риск анестезии передозировки. Насыщенный ингаляции камера осуществляет профессионального риска при использовании вне вытяжной шкаф и поставляет неизвестные количество анестетика для животных. В идеале точность испаритель должен быть использован.
- Для удаления остатков стерни волос, лечить животных с химическим удаления волос. Администрирование анестезии животного с внутрибрюшинной инъекции кетамина 40 мг / кг и ксилазина 4 мг / кг После того, как животные адекватно наркозом (если судить по ног крайнем случае), нанесите пальца размера количество депиляции кремом для стриженой спинной кожи с помощью палец в перчатке. Натрите крем в кожу в течение 30-60 сек или до волоски можно ясно увидеть в креме, как это в настоящее время переехал вокруг. Оставьте крем на только для минимального количества времени, необходимого для удаления волос, как длительное воздействие приводит к химической жжения кожи, поломки эпидермиса и смерти от потери целостности эпидермиса.
- Протрите спинной кожи насыщенных водой марлевые прокладки, пока все сливки не была удалена. Сухие животные, использующие мягкие бумажные полотенца, и дать им возможность восстановить в теплом уединенном месте (например чистые клетки помещают на потепление площадку). Депилировать животных один за одним и внимательно следить на протяжении всей процедуры.
3. Актуальные администрация форсколина или управления транспортным средством
- Животные должны рассматриваться по одному. Кратко обезболить с вдохг изофлюран с помощью манипулятора мышь на вершине формы оборудованная нейлона воздухопроницаемой фильтр под который был разместила ИФ-насыщенный бумажное полотенце в изофлурана насыщенной веками ясной стеклянной банке в вытяжной шкаф. Защиту мышь, чтобы изофлуран в течение достаточного времени, чтобы подавить добровольных мышечных движений, но сохранить спонтанного дыхания (обычно 10-20 сек). Оставив животное в изофлураном слишком долго может привести к дыхательной подавления и смерти. Лучше ошибиться в сторону "собирается свет" и необходимости повторного подвергайте мышь кратко дополнительной изофлураном, а не к переэкспонировать животное до смерти наркотиками и риска.
- Снимите животное от изофлурана камеры и поместите на чистую абсорбирующего скамейке площадку.
- Использование 1000 мкл микропипетки оборудованием с одноразового наконечника полипропилена, составить 400 мкл 40% неочищенного экстракта форсколином (управления транспортным средством животные получат 70% этанола, 30% пропилена в одиночку гликоль).
- Трансфер выписку наЗадняя часть животного происхождения капает его на кожу, а затем, используя сторону кончика пипетки, намазать экстракта над кожу спины, пока вся кожа не была покрыта. Там нет необходимости, чтобы промокните кожу после применения.
- Вернуться мышь в клетку, и внимательно наблюдать, пока она не оправится от анестезии.
- Для того, что не-пигментные эффекты цАМФ не должны посрамить УФ экспериментов по оценке чувствительности, прекратить все актуальные лечения за 2 дня до ультрафиолетового облучения (пигмент эффект длится несколько дней за последний местного лечения).
4. Цвет кожи Измерение с помощью зеркальной колориметрии
- Кратко обезболить мышь с вдыхаемым изофлураном (см. выше).
- Калибровка колориметр Minolta, поместив портативный головой о стандартизированной белой поверхности, снабженной колориметра.
- Поместите портативный измерительную головку колориметра флеш с спинной кожи животного, обеспечивая, что круглый проема 1 см 2е полностью прижимают к коже. Взять хотя бы три отдельных измерений в различных областях спинного кожи.
- Рассчитать среднюю L * счет ± стандартное отклонение на одно животное и в группе лечения. Светоотражающие колориметрию можно сделать в любой момент в эксперименте.
5. Определение УФ Чувствительность по расчету "Минимальная Эритематозные дозы" (MED)
- Использование животных, которые были предварительно обрабатывают либо носителем или форсколина, как описано выше. Обезболить животных с внутрибрюшинной инъекции стандартной смеси кетамина и ксилазина (см. выше).
- Подготовьте кусок УФ-окклюзионной ленты для тестирования MED. Для создания отверстий в ленте используйте тяжелых дырокол с 1 см 2 круговой вырез (рис. 2A и B). Имея отверстия определенного размера и симметричным расположением в ленте облегчает признание изменений кожи после облучения. За каждое отверстие в ленте, нанесите небольшое, но легко съемный кусок ленты, которую можно снять в определенное время в течение ультрафиолетового облучения, чтобы позволить введение различных доз УФ.
- После того, как животные адекватно отключке, место ленту на поверхности спинного. Глаз смазка всегда должны быть использованы под наркозом.
- Включите УФ источника, состоящей из двух Westinghouse F15T8UV-B лампы с пиковой мощностью 313 нм, а также ряд 280-370 нм. Дайте лампе, чтобы уравновесить в постоянной мощностью УФ при измерении с помощью УФ-фотометра с датчиком UVB (как правило, занимает несколько минут для ламп, чтобы согреться).
- На основании скорости передачи ультрафиолетового как измерено УФ-фотометр, вычислять время экспозиции УФ для каждого требуемого дозы. Например, выходные меры UVB нашей лампы 2,4 мВт / см 2. Поэтому, чтобы управлять 5 кДж / м 2, кожа должны быть подвержены 208 сек (который является 3 мин и 28 сек) от УФ-излучения, рассчитанный ниже:
upload/50670/50670eq1.jpg "/> - Наведите седации животных (каждый с окклюзионной ленты в месте) брюшной поверхности вниз, чтобы гарантировать даже воздействие УФ лучей. Для администрирования выбранные дозы УФ-излучения, последовательно удалить небольшие окклюзионные лент, охватывающих отверстия, чтобы выставить 1 см 2 участки кожи на правильные доз радиации. Таким образом, в приведенном выше примере, если 40 кДж / м 2 является крупнейшим доза в эксперименте, то животное будет под лампой в течение 27 минут и 47 общей сек и кожи в 40 кДж / м 2 состоянии не будет иметь вышележащих ленту все время. Тем не менее, лента, закрывающая 5 кДж / м 2 состояние будет удален, когда есть 208 сек оставаясь в экспозиции. Сроки снятия ленты должно быть сделано таким образом, что каждое условие концов одновременно.
- После УФ-облучения, снимите ленту с спинной кожи осторожно, стараясь не разорвать кожу внезапных или чрезмерно силовых движений. Поместите животных в теплом тихом месте, чтобы позволитьвосстановление после анестезии.
- Монитор мышей в течение 24-48 часов, чтобы искать дискретных областей эритема (покраснение) или отек (отек), соответствующие анатомических объектах, подверженных конкретной дозы УФ-облучения. Документ выводы кожи фотографически.
- Значение MED соответствует минимальной дозы УФ, которое вызывает воспаление как определено эритема и / или отек всей открытой круга кожи. Обратите внимание, что пигментация кожи может оспорить определение MED, однако, эритема и отек может еще вообще быть точно оценены, во многом благодаря установленному формы отверстий в ленте во время ультрафиолетового облучения.
6. Статистический анализ
Анализ данных между когорт мышей в одну сторону ANOVA с Бонферрони сообщению теста (График Pad Prism). Значений р <0,05 считаются статистически значимыми.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C57BL / 6 мышей были получены на eumelanotic, pheomelanotic или беспигментный слоев, включающих трансген K14-SCF, как описано (фиг.1А). Когорты светлокожего расширения (MC1R е / е, Tyr + / +) мышей обрабатывали местно дважды ежедневных доз либо носитель (70% этанола, 30% пропиленгликоль) или 40% сырой Coleus Forskohlii экстракта корня (80 мкМ за доза) в течение 5 дней (фиг. 2b). Влияние местного лечения на эпидермальный пигментации были определены как путем визуального осмотра и с помощью зеркальной колориметрии (рис. 1В). Применение экстракта корня было связано с надежной эпидермального потемнение в K14-Scf трансгенных фоне, но не в генетически подобранных без трансгенных животных. Мы интерпретируем эти результаты, показывая, что интерфолликулярной эпидермиса меланоциты должны присутствовать для того, чтобы фармакологически вызванной меланина на хранение в эпидrmis. Хотя Экстракт корня глубоко цветной из-за наличия растительных фитохимические, кроме форсколина, потемнение кожи не может быть исключительно из-за окрашивающего эффекта от препарата, как не-трансгенных животных не могут проявлять кожу потемнение с экстракта корня (рис. 1В). При нанесении в два раза в день таким образом, melanizing эффекты местно-прикладного форсколином можно отметить в качестве лишь 2 дней, хотя максимальная потемнение осуществляется после еще несколько дней (рис. 1в). Класс меланизации зависит от дозы, как показано Фонтана-Массона меланина окрашивания срезов кожи спинной обработанных различными концентрациями препарата (рис. 1D).
Далее, эффект местно-прикладного форсколина на УФ-чувствительности было определено путем тестирования MED у мышей расширение (MC1R е / е, Tyr + / +), как описано выше (фиг. 2 А и В). МЕД определение сравнивали между Анинормалей, обработанные ускоренном медикаментозного лечения (два раза в день введения в течение 5 дней, 10 Всего доз) против стандартного подхода (один раз в день администрации в течение 15 дней, 15 суммарных дозах). Non-трансгенных мышей были включены для контроля не-меланина эффектов препарата. Оба вида лечения привели к аналогичным количеством кожи затемнения в форсколином обращению K14-SCF животных. В частности, L * (отражающей колориметрические бело-черный шкала) значения для форсколином, подвергшихся воздействию животных были 31,9 ± 1,8 и 31,1 ± 1,6 для ускоренного приложения против стандартного приложения, соответственно. Там не было никаких очевидных токсических эффектов от форсколином воздействия в любой группе лечению, тем самым, мы пришли к выводу, что ускоренный администрация форсколин (два раза в день за 10 суммарных дозах, 80 мкм на дозу) способствовали безопасному меланизации кожи спинной же эффективно, как, что использовался ранее (один раз в день в течение 15 суммарных дозах, 80 мкМ на дозу).
Форсколин вызванной эпидермального меланизации привело кглубокая защита от ультрафиолетовых лучей можно судить по MED (Цифры 2C-D). Таким образом, в то время как в виду МЕД для расширения мышей K14-SCF лечение по два раза в течение 5 дней с автомобиля был 5,0 ± 0,0 кДж / м 2, средняя MED для когорт, получавших местного форсколином было> 30,0 ± 0,0 кДж / м 2 (рис. 2 и С). В самом деле, в дозе 30,0 кДж / м 2 было недостаточно, чтобы генерировать эритемы в этом эксперименте. Используя стандартный форсколином дозирование (один раз в день в течение 15 суммарных дозах, 80 мкм на дозу), мы обнаружили, что средняя MED для расширения мышей K14-SCF получавших форсколином был 50,0 ± 7,1 кДж / м 2 (рис. 2 B, D). Важно отметить, что форсколин предварительная обработка не влияет MED животных, не способных меланизации, либо из-за отсутствия K14-SCF-опосредованных эпидермиса меланоцитов (рис. 2в, г) или из-за дефицита тирозиназы (Рисунок 2E). С Форсколин приложения были распродолжал за 2 дня до ультрафиолетового облучения, а не были продолжены после ультрафиолетового облучения, заключаем, что непигментных эффекты цАМФ не играть роль в MED результатов. Скорее, данные свидетельствуют о том, что эпидермальный меланизации был механизм, посредством которого форсколином индуцированных УФ защиты в этой модели.
Рисунок 1. Местное лечение форсколином способствует потемнение кожи у светлокожих расширения (MC1R э / э) мышей. (A) Фотографии C57BL / 6 животных, используемых в данном исследовании. Животные генетически соответствует исключением в меланокортина 1 рецептора (MC1R) и тирозиназы (Тир) локусов. Обратите внимание, что пигментация eumelanotic (черный), когда MC1R функционален, но pheomelanotic (blondish), когда MC1R неисправен, как и в случае срасширение (MC1R э / э) мутант. Эпидермального пигментации зависит от сохранения межфолликулярного эпидермиса меланоцитов в коже под трансгена K14-Scf, и можно легко увидеть в ушах. (B) Фотографии расширения (MC1R э / э) K14-Scf или не трансгенные животные, получавшие 400 мкл управления транспортным средством (70% этанол 30% гликолевого пропил) или 40% вес / об (80 мкМ) форсколина дважды в день в бритой спинной кожи в течение 5 дней, всего 10 приложений. Цвет кожи измерения по отражающей колориметрии проводились для каждой группы. Светоотражающие результаты колориметрии представлены как среднее (± стандартное отклонение) рефлектометрических единиц на L * (черно-белый) оси цвет. Обратите внимание, что местное применение форсколином вызвало надежную кожу потемнение в K14-SCF трансгенных животных, но не в не-трансгенных мышей. (С) Время Конечно эксперимент показывает потемнение форсколином лечить ухо K14-SCFмышей расширения для указанных периодов времени (форсколином лечить уши, обозначены синими треугольниками). Автомобиль был приложен к правому уху для сравнения. (D) Фонтана-Массона окрашенные срезы кожи, взятые от животных, обработанных указанными дозами форсколином, как описано. Нажмите здесь, чтобы увеличить рисунок .
Рисунок 2. Форсколин вызванной меланизации защищает от воспаления УФ-опосредованного как определяется минимальным эритематозной дозы (МЭД) тестирования. (А, В) Положение УФ окклюзионной ленты и UVB доз животных, получавших два раза в день в течение 5 дней (A, C) или один раз в день в течение 15 дней (B, D, E) с любой автомобиль или форсколином. Чт е в прошлом местное лечение применялось 48 часов до облучения. Спинной кожу воздействию различных доз UVB с помощью УФ-окклюзионной ленту с перфорированной выезда 1 см 2 круговой апертуры, и разное время экспозиции, чтобы получить соответствующую дозу. После облучения круги открытые участки кожи были помечены с пером в некоторых экспериментах. МЭР, определяется эритемы и / или отек всего круга открытые участки кожи на конкретный дозы, были определены 48 часа после облучения. MED ± результатов SD представлены как кДж / м 2 UVB, * р ≤ 0,001. (Е) Цвет кожи рефлектометрия и MED значения для тирозин-дефицитных K14-SCF расширения альбинос мышей, получавших в течение 10 дней с транспортного средства или форсколином. Кликните здесь, чтобы увеличить рисунок .
70fig3highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/50670/50670fig3.jpg "/>
Рисунок 3. Общая схема эксперимента. Когорты расширения (MC1R е / е) K14-SCF или не-трансгенных животных были получены путем удаления спинной мех электрическим сдвига и / или химической депиляции. Животных затем обрабатывают местных аппликаций либо носитель (70% этанола, 30% пропиленгликоль) или с 40% неочищенного экстракта форсколина на графиках дозирования указанных. Влияние на пигментации кожи были зарегистрированы фотографически, колориметрическим и окрашиванием меланина Фонтана-Массона. УФ-чувствительность определялась минимальной эритематозной дозы (МЭД) тестирования.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Использование животную модель справедливой кожей человека, мы находим, что местное применение в форсколином богат сырой экстракт корня решительно темнеет эпидермис, стимулируя выработку меланина в коже. Эпидермального меланизации зависит от экспрессии фактора стволовых клеток в базальном эпидермисе, как это происходит в коже человека, но не в генетически немодифицированного кожу мыши. Спинной кожи генетически немодифицированного мышей отсутствует достаточное количество межфолликулярного меланоцитов, чтобы придать пигмента в коже. Только в обстановке конститутивной экспрессии фактора роста меланоцитов, таких как фактор стволовых клеток (комплект лиганда) или фактор роста гепатоцитов (ФРГ) может меланоциты быть сохранены в базального слоя эпидермиса на протяжении всей жизни животного 50-51. Наша животная модель справедливой кожей человека основана на регистрации трансгена K14-Scf в расширение пигмента варианта мышиного линии C57BL / 6. Хотя животные любого возраста могут бытьиспользуется, наши эксперименты обычно включают молодых взрослых (4-12 недель) мышей. Из-за усеченной меланокортина 1 рецептора (MC1R), что приводит к потере цАМФ сигнализации, мыши расширения выразить феомеланин преимущественно в шерсти и кожи (в трансгенных государств K14-SCF или ФРГ-Met), а не Эумеланин 52-54. В результате измененной экспрессией меланина, расширения мышей K14-SCF гораздо чувствительность к УФ излучению, чем их MC1R дикорастущие коллегами типа, которые имеют черные как смоль кожу за счет обильного осаждения эпидермального Эумеланин пигмента 1. Мы полагали, что с производства Эумеланин значительно уменьшается в условиях мутантного MC1R, что фармакологические стимуляторы, которые имитируют сигнализации MC1R может спасти производство Эумеланин. MC1R является G с связью трансмембранный рецептор, который, при связывании с высоким сродством лиганда α-меланоцит-стимулирующего гормона (α-МСГ), передает про-дифференцировки сигналы в Melanoцит цитоплазма через активацию аденилатциклазы и производства вторичного мессенджера цАМФ. Таким образом, мы предположили, что местное применение форсколином, клетка проницаемым дитерпеноид, что является мощным прямым активатором аденилатциклазы, могли бы стимулировать производство Эумеланин в MC1R исправный, pheomelanotic государства.
Использование очищенного форсколином для этих исследований, однако, оказалось непомерно. Первые эксперименты, определяющие минимальное количество, необходимое для форсколина эпидермального потемнение в модели расширения K14-SCF предположить, что максимальное затемнение произошло с использованием 40% по весу в расчете по объему раствора с использованием сырой экстракт, который содержал 20% (вес к весу) форсколина. Вычислим, что применение 400 мкл 8% конечного форсколина (вес на объем, 40% х 20%) раствора приведет к доставке приблизительно 80 мкМ форсколина на дорсальную кожу каждого приложения. Конечно, большая часть доставленной дозыне впитывается в кожу, а не всасываясь, окружив мех или падает животное на момент подачи заявки. Таким образом, трудно представить точную дозу реализован, что животные получают с каждым применением препарата. Тем не менее, когда применяется таким образом, форсколин приводит к надежной индукции ферментов пигмента в коже и производства эумеланин. На самом деле, K14-SCF трансгенные расширения животные продемонстрировали четкую потемнение кожи после второго применения (рис. 1в).
Хотя мы ранее опубликована кожу потемнение с ежедневного применения препарата 1,48-49, здесь мы показываем, что два раза в день приложение связано с надежной эпидермального потемнения и значительным УФ-защитой, предполагая, что фармакологическое вызванной меланизации могут быть оптимизированы путем введения Препарат чаще, чем один раз в день. Потемнение кожи, что связано с индукцией Эумеланин в эпидермисе, длится до техПока продолжаются актуальные Форсколин лечения. Даже хронический приложение (через три месяца), казалось, хорошо переносится мышей 49. Увеличение потемнение кожи происходит из-за синтеза меланина, а не пролиферации меланоцитов в эпидермисе. 49. Как только актуальные лечения прекращается, кожа постепенно увядает назад до ее исходного светлой кожей (в течение 2-3 недель), как меланин эпидермиса теряется с нормальной обновления кератиноцитов. Потемнение кожи может быть легко определено путем простого визуального осмотра мышей, однако цвет кожи может быть определена количественно с использованием объективно отражающий колориметрии 55-56. Этот метод является неинвазивным быстро и безболезненно метод измерения цвета кожи. Цвет может быть точно описано с помощью L * A * B * (LAB) цветовое пространство модели 57-58.
Для этих экспериментов мы опирались на сырой экстракт корня от forskolii завода Колеус, природном источнике форсколином. Этот препаратбыл использован из-за высокой стоимости проведения этих экспериментов с очищенной форсколином. Этот эксперимент, например, требуется примерно 2 г форсколина общей для применения два раза в день до шести животных в течение пяти дней. 2 г коммерчески доступного ВЭЖХ-очищенные форсколином будет стоить более $ 20000, по сравнению с менее чем $ 5 за неочищенного экстракта. Хотя очищенный форсколином индуцированных эпидермиса меланина в нашей животной модели 1, мы не можем исключить возможного влияния других соединений растительного происхождения в сырой экстракт корня включая алкалоиды, фенолы и дубильных веществ. В самом деле, до работы с использованием морскую свинку или человека эксплантов кожи предположил, что соединения в сырой экстракт корня может способствовать кожная поглощение форсколином 59. Пока, однако, идентичность и механизм этих соединений остается неизвестным. Таким образом, мы не можем исключить изменения действие других соединений, присутствующих в природе в сырой экстракт корня.
Совокупное форсколином смесьтемно-коричневая жидкость с привлекательным специи, как аромат, который легко наносится на кожу для местного применения. Поскольку нерастворимые вещества были удалены, ежедневное применение не оставляет корки или отложений раз, поглощаемого кожей. Хотя сырой экстракт корня темно-коричневый, когда приготовленные таким образом, потемнение кожи, индуцированный препарата не только эффект краситель, о чем свидетельствует тот факт, что местное применение соединения на животных, не способных меланизации кожи (например, MC1R Е / Е тирозиназы -дефицитные альбиносов животных или без трансгенных мышей, которые не имеют эпидермиса меланоциты) не имел никакого эффекта на кожу затемнение (фиг.1В и 2E). Мы рассматриваем эти эксперименты в качестве доказательства правильности концепции демонстраций, манипуляции цАМФ в коже может вызвать УФ-защитным темную пигментацию кожи. Тем не менее, маловероятно, что местное применение форсколином является возможным или практический терапевтический вариант из-за неспецифической природы лекарства. Яndiscriminate и нецелевой активации аденилатциклаз и индукции цАМФ можно было бы ожидать, чтобы вызвать неприемлемые токсичности. Важно отметить, что другие показали, что местное введение ингибитора фосфодиэстеразы 4 (ролипрам), мощно повышающей регуляции меланина в расширении животной модели K14-SCF, доказывает, что кожный цАМФ индукции и меланизации может быть достигнуто путем альтернативного фармакологического ориентации 35. Очевидно, что, прежде чем актуальным манипуляция уровня цАМФ в коже можно перевести для использования человеком, его безопасность должны быть тщательно оценены. Тем не менее, наши данные убедительно свидетельствуют, что фармакологически вызванной меланизации является УФ-защитным как определяется минимальным эритематозной дозы (МЭД) тестирования.
Таким образом, местное применение форсколином, в аденилатциклазной активатора, привели к сильным меланизации эпидермиса мышиной модели светлокожего человека на основе дефектных цАМФ сигнализации внизпоток дефектного меланокортина 1 рецептора (MC1R). Эпидермального меланизации был УФ-защитным, если судить по минимальным эритематозной дозы (МЭД) тестирования. Мы предполагаем, что фармакологическое манипуляции цАМФ может не только спасение УФ-защитным eumelanization эпидермиса, но и другие MC1R-зависимые УФ-защитная реакция, а также.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Малинда Spry для оказания технической помощи. Мы также признаем, текущих и прошлых источников финансирования: Национальный институт рака (R01 CA131075, R01 CA131075-02S1), исследований Case фонд Венди Уилл Рак, Фонд борьбы с раком Марки, Детский Чудо Сеть и Дженнифер и Дэвид Диккенс Меланома исследовательский фонд.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Coleus Forskoli extract 20% | Buckton Scott USA Inc. | n/a | Princeton, NJ |
| Isothesia, Isoflurane , USP | Butler Schein | NCD 11695-6776-1 | Dublin, OH, USA |
| Xylazine | Anased Injection | LA04612 | Shenandoah, Iowa, USA |
| Ketamine HCl, USP | Putney | NDC 26637-411-01 | St. Joseph, MO, USA |
| Ethanol | Decon Labs. | 2705 | |
| Propylene glycol | Adesco | 05751L | Solon, OH, USA |
| Depilatory cream, Nair | Church Dwight | JF-11 4381322 | Priceton, NJ |
| EQUIPMENT | |||
| Germicidal Hg Lamp UV-B | Westinghouse | F15T8UV-B | |
| Radiometer photometer | International light | 1LT400A | Peabody, MA,USA |
| Chromameter | Konica Minolta | CR-400 | Ramsey, NJ, USA |
| Data Processor for Chromameter CR-400 | Konica Monilta | DR-400 | Ramsey, NJ, USA |
References
- D'Orazio, J. A., et al. Topical drug rescue strategy and skin protection based on the role of Mc1r in UV-induced tanning. Nature. 443, 340-344 (2006).
- Gallagher, R. P., et al. Suntan, sunburn, and pigmentation factors and the frequency of acquired melanocytic nevi in children. Similarities to melanoma: the Vancouver Mole Study. Arch Dermatol. , 126-770 (1990).
- Kraemer, K. H., Lee, M. M., Andrews, A. D., Lambert, W. C. The role of sunlight and DNA repair in melanoma and nonmelanoma skin cancer. The xeroderma pigmentosum paradigm. Arch Dermatol. 130, 1018-1021 (1994).
- Wang, Y., et al. Evidence of ultraviolet type mutations in xeroderma pigmentosum melanomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6279-6284 (2009).
- Pleasance, E. D., et al. A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome. Nature. 463, 191-196 (2009).
- Weinstock, M. A., Fisher, D. E. Indoor ultraviolet tanning: what the data do and do not show regarding risk of melanoma and keratinocyte malignancies. J. Natl. Compr. Canc. Netw. 8, 867-873 (2010).
- Fisher, D. E., James, W. D. Indoor tanning--science, behavior, and policy. N. Engl. J. Med. 363, 901-903 (2010).
- Pfahlberg, A., Kolmel, K. F., Gefeller, O. Timing of excessive ultraviolet radiation and melanoma: epidemiology does not support the existence of a critical period of high susceptibility to solar ultraviolet radiation- induced melanoma. Br. J. Dermatol. 144, 471-475 (2001).
- Lew, R. A., Sober, A. J., Cook, N., Marvell, R., Fitzpatrick, T. B. Sun exposure habits in patients with cutaneous melanoma: a case control study. J. Dermatol. Surg. Oncol. 9, 981-986 (1983).
- Autier, P., Dore, J. F. Influence of sun exposures during childhood and during adulthood on melanoma risk. EPIMEL and EORTC Melanoma Cooperative Group. European Organisation for Research and Treatment of Cancer. Int. J. Cancer. 77, 533-537 (1998).
- Udayakumar, D., Mahato, B., Gabree, M., Tsao, H. Genetic determinants of cutaneous melanoma predisposition. Semin. Cutan. Med. Surg. 29, 190-195 (2010).
- Psaty, E. L., Scope, A., Halpern, A. C., Marghoob, A. A. Defining the patient at high risk for melanoma. Int. J. Dermatol. 49, 362-376 (2010).
- Tucker, M. A.
- Abdel-Malek, Z. A., Knittel, J., Kadekaro, A. L., Swope, V. B., Starner, R. The melanocortin 1 receptor and the UV response of human melanocytes--a shift in paradigm. Photochem. Photobiol. 84, 501-508 (2008).
- Suzuki, I., et al. Participation of the melanocortin-1 receptor in the UV control of pigmentation. J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 4, 29-34 (1999).
- Gibson, G. E., Codd, M. B., Murphy, G. M. Skin type distribution and skin disease in Ireland. Ir. J. Med. Sci. 166, 72-74 (1997).
- Evans, R. D., et al. Risk factors for the development of malignant melanoma--I: Review of case-control studies. J. Dermatol. Surg. Oncol. 14, 393-408 (1988).
- Pack, G. T., Davis, J., Oppenheim, A. The relation of race and complexion to the incidence of moles and melanomas. Ann. N.Y. Acad. Sci. 100, 719-742 (1963).
- Valverde, P., Healy, E., Jackson, I., Rees, J. L., Thody, A. J. Variants of the melanocyte-stimulating hormone receptor gene are associated with red hair and fair skin in humans. Nat. Genet. 11, 328-330 (1995).
- Rees, J. L., Healy, E. Melanocortin receptors, red hair, and skin cancer. J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 2, 94-98 (1997).
- Beaumont, K. A., et al. Melanocortin MC(1) receptor in human genetics and model systems. Eur. J. Pharmacol. 660, 103-110 (2011).
- Palmer, J. S., et al. Melanocortin-1 receptor polymorphisms and risk of melanoma: is the association explained solely by pigmentation phenotype? Am. J. Hum. Genet. 66, 176-186 (2000).
- Haskell-Luevano, C., et al. Compounds that activate the mouse melanocortin-1 receptor identified by screening a small molecule library based upon the beta-turn. J. Med. Chem. 42, 4380-4387 (1999).
- Yamaguchi, Y., Hearing, V. J.
- Eves, P. C., MacNeil, S., Haycock, J. W. alpha-Melanocyte stimulating hormone, inflammation and human melanoma. Peptides. 27, 444-452 (2006).
- Slominski, A., Wortsman, J., Luger, T., Paus, R., Solomon, S. Corticotropin releasing hormone and proopiomelanocortin involvement in the cutaneous response to stress. Physiol. Rev. 80, 979-1020 (2000).
- Slominski, A., Wortsman, J.
- Luger, T. A., et al. Role of epidermal cell-derived alpha-melanocyte stimulating hormone in ultraviolet light mediated local immunosuppression. Ann. N.Y. Acad. Sci. 885, 209-216 (1999).
- Chakraborty, A. K., et al. UV light and MSH receptors. Ann. N.Y. Acad. Sci. 885, 100-116 (1999).
- Cui, R., et al. Central Role of p53 in the Suntan Response and Pathologic Hyperpigmentation. Cell. 128, 853-864 (2007).
- Imokawa, G., Yada, Y., Hori, Y. Induction of melanization within hair bulb melanocytes in chinchilla mutant by melanogenic stimulants. J Invest Dermatol. 91, 106-113 (1988).
- Siegrist, W., et al. Interactions of alpha-melanotropin and agouti on B16 melanoma cells: evidence for inverse agonism of agouti. J. Recept. Signal Transduct Res. 17, 75-98 (1997).
- Abdel-Malek, Z., et al. The melanocortin-1 receptor is a key regulator of human cutaneous pigmentation. Pigment Cell Res. 13, Suppl 8. 156-162 (2000).
- Wood, J. M., Gibbons, N. C., Schallreuter, K. U.
- Khaled, M., Levy, C., Fisher, D. E. Control of melanocyte differentiation by a MITF-PDE4D3 homeostatic circuit. Genes Dev. 24, 2276-2281 (2010).
- Ghiorzo, P., et al. MC1R variation and melanoma risk in relation to host/clinical and environmental factors in CDKN2A positive and negative melanoma patients. Exp. Dermatol. , (2012).
- Cust, A. E., et al. MC1R genotypes and risk of melanoma before age 40 years: a population-based case-control-family study. Int. J. Cancer. 131, E269-E281 (2012).
- Ibarrola-Villava, M., et al. Genetic analysis of three important genes in pigmentation and melanoma susceptibility: CDKN2A, MC1R and HERC2/OCA2. Exp Dermatol. 19, 836-844 (2010).
- Scherer, D., et al. Melanocortin receptor 1 variants and melanoma risk: A study of 2 European populations. Int. J. Cancer. , (2009).
- Hoiom, V., et al. MC1R variation and melanoma risk in the Swedish population in relation to clinical and pathological parameters. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 196-204 (2009).
- Galore-Haskel, G., et al. MC1R variant alleles and malignant melanoma risk in Israel. Eur. J. Cancer. 45, 2015-2022 (2009).
- Sturm, R. A. Skin colour and skin cancer - MC1R, the genetic link. Melanoma Res. 12, 405-416 (2002).
- Kennedy, C., et al. Melanocortin 1 receptor (MC1R) gene variants are associated with an increased risk for cutaneous melanoma which is largely independent of skin type and hair color. J. Invest. Dermatol. 117, 294-300 (2001).
- Box, N. F., et al. MC1R genotype modifies risk of melanoma in families segregating CDKN2A mutations. Am. J. Hum. Genet. 69, 765-773 (2001).
- Rees, J. L. The melanocortin 1 receptor (MC1R): more than just red hair. Pigment Cell Res. 13, 135-140 (2000).
- Valverde, P., et al. The Asp84Glu variant of the melanocortin 1 receptor (MC1R) is associated with melanoma. Hum. Mol. Genet. 5, 1663-1666 (1996).
- Kunisada, T., et al. Transgene expression of steel factor in the basal layer of epidermis promotes survival, proliferation, differentiation and migration of melanocyte precursors. Development. 125, 2915-2923 (1998).
- Vanover, J. C., et al. Stem cell factor rescues tyrosinase expression and pigmentation in discreet anatomic locations in albino mice. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 827-838 (2009).
- Spry, M. L., et al. Prolonged treatment of fair-skinned mice with topical forskolin causes persistent tanning and UV protection. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 219-229 (2009).
- Takayama, H., La Rochelle, W. J., Anver, M., Bockman, D. E., Merlino, G. Scatter factor/hepatocyte growth factor as a regulator of skeletal muscle and neural crest development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 5866-5871 (1996).
- Kunisada, T., et al. Murine cutaneous mastocytosis and epidermal melanocytosis induced by keratinocyte expression of transgenic stem cell factor. J. Exp. Med. , 187-1565 (1998).
- Takeuchi, T., Kobunai, T., Yamamoto, H. Genetic control of signal transduction in mouse melanocytes. J. Invest. Dermatol. 92, 239S-242S (1989).
- Ozeki, H., Ito, S., Wakamatsu, K., Hirobe, T. Chemical characterization of hair melanins in various coat-color mutants of mice. J. Invest. Dermatol. 105, 361-366 (1995).
- Lamoreux, M. L., Wakamatsu, K., Ito, S. Interaction of major coat color gene functions in mice as studied by chemical analysis of eumelanin and pheomelanin. Pigment Cell Res. 14, 23-31 (2001).
- Barbini, P., et al. Instrumental measurement of skin colour and skin type as risk factors for melanoma: a statistical classification procedure. Melanoma Res. 8, 439-447 (1998).
- Takiwaki, H. Measurement of skin color: practical application and theoretical considerations. J. Med. Invest. 44, 121-126 (1998).
- Anderson, R. R., Parrish, J. A.
- Rubegni, P., et al. Relationship between skin color and sun exposure history: a statistical classification approach. Photochem. Photobiol. 65, 347-351 (1997).
- Chen, J., Hammell, D. C., Spry, M., D'Orazio, J. A., Stinchcomb, A. L. In vitro skin diffusion study of pure forskolin versus a forskolin-containing Plectranthus barbatus root extract. J. Nat. Prod. 72, 769-771 (2009).
