Summary
表皮黑色素是由毛喉素局部应用在皮肤白皙的紫外线敏感的人小鼠模型诱导。 cAMP水平的皮肤和表皮发黑免受紫外线介导的炎症（晒斑）强烈保护如由最小红斑量（MED）法测定的药理操纵。
Abstract
公平性皮肤，紫外灵敏度和皮肤癌的风险的所有关联与的黑皮质素-1受体的生理功能，黑素细胞的表面上发现了G S耦合信号蛋白。 MC1R刺激腺苷酸环化酶和cAMP的产生，这反过来，上调黑色素细胞黑色素的产生在皮肤上。为了研究由MC1R信令保护皮肤免受紫外线伤害皮肤的机理，本研究依赖于小鼠模型与基于干细胞因子（SCF）的表达表皮“人源化的皮肤”。K14-SCF基因小鼠黑素细胞保留在表皮，因此具有沉积黑色素在表皮的能力。在这个动物模型，在黑色的真黑素色素和UV保护型健壮的沉积野生型MC1R状态结果。与此相反，K14-SCF动物有缺陷的MC1R信令能力表现出红色/金色的色素沉着，很少真黑素在皮肤和一个对紫外线敏感的表型。理由是真黑色素的沉积可能是由局部用药，模仿MC1R信号增强，我们发现直接应用毛喉素提取物对MC1R基因缺陷的皮肤白皙的小鼠的皮肤造成了强大的真黑素诱导和防紫外线1。在这里，我们描述了制备和应用含毛喉素天然根提取物对K14-SCF皮肤白皙小鼠及报告，通过测定最小红斑量（MED）测定紫外灵敏度的方法的方法。使用该动物模型，能够研究的皮肤表皮的cAMP的诱导和黑化如何影响生理反应，以UV曝光。
Introduction
黑色素瘤的发病率，皮肤癌的最致命的形式，也大幅增加，在过去几十年在美国，尤其是皮肤白皙的人。强烈的分子和流行病学证据牵连紫外线辐射为主要致病环境因素2-5。在阳光下暴晒和晒黑床使用的形式增加紫外线照射很可能是负责大部分的增加黑色素瘤的发病率6-7。黑色素瘤的风险似乎与晒伤8，尤其是那些生活在9-10月初特别的联系。晒伤的风险被链接不仅剂量和紫外线照射的强度，而且还通过影响紫外线辐射的皮肤反应遗传因素。皮肤色素沉着是一种UV灵敏度的最重要的决定因素，晒伤和癌症风险的风险。黑色素瘤约20倍更频繁地发生在浅肤色的人相比，皮肤黝黑的individuaLS 11-13。
黑色素，由黑素细胞在表皮中产生的颜料，是肤色的主要决定因素。黑色素有两个主要品种有：（1）真黑素，黑棕色/黑色颜料在吸收UV辐射的能量有效的，并且（2）褐黑素，红/金色颜料防止紫外线光子的穿透入皮肤效果较差。肤色，紫外线的敏感性和黑色素瘤的风险在很大程度上是由表皮黑色素含量14-15决定。在表皮中的黑色素多，越少的UV光子可以渗透进皮肤。因为真黑素的先天低层次的，皮肤白皙的人对紫外线辐射16-18急性和慢性影响更容易发生。
皮肤色素沉着，黑色素瘤的风险，并有能力“晒黑”的紫外线照射后，所有与关联的黑素皮质素受体1（MC1R）的信令能力，一个G S耦合的七次跨膜s对黑素细胞19-22 urface受体。当MC1R结合其同源的高亲和力配体，α-黑素细胞刺激激素（α-MSH），有活化腺苷酸环化酶的第 二信使cAMP 23的制作中。紫外线照射后皮肤的正常生理反应包括表皮生产α-MSH的由角质形成细胞24-29。我们和其他人推测，角质形成细胞源性α-MSH结合MC1R对表皮黑素细胞，通过激活腺苷酸环化酶30的启动下游生产内cAMP第二信使。 cAMP水平控制黑色素细胞分化的许多方面，包括存活途径，DNA修复和颜料的合成。 MC1R信号和cAMP诱导清楚色素酶水平和黑色素的生产。当MC1R信号是否完好及黑素细胞内cAMP水平是强大的，真黑素的产生和皮肤变暗。但是，如果MC1R信号是有缺陷的，并胞浆内cAMP水平仍然很低，褐黑素产生，而不是1。真黑素合成可以通过药理学的提高cAMP水平1,14,31-35剂刺激。
由于MC1R蛋白是在人类36-46黑素瘤风险的主要调节剂，我们感兴趣的是其中MC1R保护皮肤免受紫外线诱导黑素细胞癌变的机制。作为我们研究的基础，我们产生了转基因MC1R基因变体小鼠模型在纯C57BL / 6遗传背景1。在这个模型中，干细胞因子（SCF）的组成型表达在基底表皮和表皮黑素细胞滤泡被保留在整个生命47的皮肤，而相比之下，在非转基因小鼠，其中黑素细胞定位于毛囊真皮。与K14-SCF基因掺入，表皮变得与颜料的特定黑色素着色特性动物1株。K14-SCF小鼠对C57BL / 6遗传背景与野生型MC1R信号已经乌黑的皮肤特点是非常高水平的真黑素色素。毫不奇怪，这些动物是高度抗紫外线。相比之下，基因匹配K14-SCF的C57BL / 6动物怀有一种突变无效的MC1R在表皮几乎没有黑色素。相反，这些“ 延伸 ”的动物（MC1R E / E）具有引起的褐黑素色素（ 图1A）沉积公平肤色和更为紫外线敏感48-49。
与化学特性，使渗透到皮肤药物化合物已被证明直接操作cAMP水平的表皮黑素细胞在皮肤有效地诱导黑色素的扩展名（MC1R E / E）K14-SCF动物模型。在这个模型中黑色素的上调已经Ř通过腺苷酸环化酶激活1以及磷酸二酯酶4抑制35 eported。在这篇文章中，我们展示了准备并在扩展名（MC1R E / E）K14-SCF的动物模型中，皮肤白皙紫外线敏感的人毛喉素局部应用。我们表明，该药物每日两次应用促进加速黑色素，即皮肤变黑是由于黑色素的表皮沉积而引起的表皮黑色素防止紫外线引起的晒伤通过“最小红斑剂量”（MED）48的测量值。
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Protocol
1。从左手石竹（Cohleus毛喉）植物的粗根提取物制剂毛喉素用于局部给药的
- 协议对小鼠实验其次为动物的护理和使用道德行为的准则和批准的机构动物护理和使用委员会在肯塔基大学（协议＃00768M2004）。根提取物是由在40％重量/体积70％乙醇中的一个标准皮肤病学的基础上，30％的丙二醇。
- 权衡将200g粗福斯克林根提取物，并将其转移到烧杯中。制成500毫升40％（重量/体积）溶液，重悬将200g粗福斯克林根提取物，加入大部分但不是全部车辆的体积（70％乙醇，30％丙二醇），并把该溶液至大约450毫升。
- 搅拌一个小时在室温下。该解决方案将有点粘稠，可能需要手动搅拌以“升降机”提取到溶液中之前搅拌棒是能够接管。
- 搅拌一小时后，混合物倒入量筒中，并使用车辆已被用于“漂洗”，是用来搅拌的浆料中的烧杯中（最大限度地从烧杯中恢复毛喉素），使体积至500ml 。
- 将浆料转移至50ml聚丙烯离心管中。离心（1,500×g离心，室温，15分钟）使用台式离心机。在这一点上，不溶性材料将是相当密实，使上清液容易被倒出。
- 通过0.22微米乙酸纤维素膜过滤该溶液，以从提取物中除去残留的不溶性物质。我们使用的瓶顶系统设计用于细胞培养，随着使用的预过滤器来与单元以防止从根提取物的不溶性组分的膜过早堵塞。当使大量的提取物，过滤大致100毫升在一个时间，改变了预过滤器的选择吐温每个添加量。
- 当在室温下保存，提取物保持生物学活性高达长达一年。
2。用于局部治疗制备C57BL / 6 K14-SCF小鼠
- 电动剪切从动物取出背毛皮。简要麻醉动物吸入异氟醚，方便背部皮毛配备0.25mm的手术预备头（飞世尔科技）电热剪的剪切。最好只使用一种类型的麻醉（ 如氯胺酮/甲苯噻嗪），以尽量减少麻醉药过量的风险。饱和吸入室进行职业风险时，通风橱外使用，并提供未知量的麻醉剂的动物。理想的情况是一个精密蒸发器应该被使用。
- 以去除残留的毛茬，善待动物用化学脱毛剂。管理麻醉的动物用腹腔注射氯胺酮40 mg / kg和甲苯噻嗪4毫克/千克一旦动物有足够的麻醉（用脚趾捏来判断），适用的脱毛霜指尖大小的量，用戴手套的手指剪切背侧皮肤。擦眼霜渗入皮肤30-60秒或直到毛发可以清楚地在奶油被看作是它被搬来搬去。离开上霜只对需要的时间脱毛的最小量为长时间暴露引起的皮肤，表皮破裂和死亡的表皮完整性损失的化学燃烧。
- 反复擦拭背部皮肤用清水浸泡过的纱布垫，直到所有的冰淇淋已被删除。用柔软的纸巾，并允许他们在一个温暖的僻静的位置（ 如干净的笼子放置在一个变暖垫）恢复干燥的动物。脱毛的动物，一个接一个，整个手术过程中密切监测。
3。毛喉素或车辆控制的局部给药
- 动物应该在一个时间进行处理1。与吸入麻醉简要通过将鼠标上的下一个形状吻合尼龙透气式过滤器的顶部ð异氟醚已被放置的异氟醚饱和的纸巾在通风橱中的异氟醚的饱和带盖透明玻璃广口瓶中。暴露的小鼠对异氟烷足够的时间，以抑制自发肌肉运动，但保持自主呼吸（通常是10-20秒）。留在异氟醚的动物过长会导致呼吸抑制而死亡。这是更好地犯错“去光”，不得不重新暴露鼠标简单地多异氟醚，而不是动物过度暴露于药物和死亡风险的一面。
- 从异氟醚室中取出的动物，并放置在干净的吸水垫板凳。
- 使用1,000微升微量配备一次性聚丙烯尖，制定400微升40％的粗提取物毛喉素（车辆控制动物将获得70％的乙醇，独自一人30％丙二醇）。
- 提取物转印到背面的动物通过它滴落到皮肤上，然后，用移液管尖端的侧面，涂抹提取在背部皮肤，直到所有的皮肤已经被覆盖。有没有必要向吸干涂布后的皮肤上。
- 返回鼠标笼子里，并仔细观察，直到它从麻醉中恢复。
- 为了使非色素cAMP的作用不应该混淆紫外线敏感性试验，停止所有的局部治疗前2天的紫外线照射（颜料效果持续数天超越去年局部治疗）。
4。皮肤颜色测量由反射比色法
- 简要麻醉小鼠吸入异氟醚（见上文）。
- 通过将便携式头所提供的色度计标准化白色表面校准美能达色差。
- 将色度计平齐的便携式测量头与该动物的背部皮肤确保1cm 2的圆形aperture的完全压在皮肤上。采取在背部皮肤的不同区域的至少三个单独的测量。
- 计算平均长*得分±每只动物和每个治疗组的SD。反射色度可以在任何时候在实验中进行。
5。由“最小红斑剂量”（MED）的计算测定紫外灵敏度
- 使用已预先用载体或如上述毛喉素的动物。麻醉动物腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪（见上文）的标准混合物。
- 准备一张紫外闭塞磁带MED测试。以产生在带的孔中，使用了重型打孔器以1厘米2的圆形开口（ 图2A和B）。具有在带一个定义尺寸和对称布置的孔便于照射后识别的皮肤变化。多年来在磁带每孔，应用一个小而易于拆卸件磁带，可以在规定的时间紫外线照射过程中被移除，以允许不同的紫外线剂量给药。
- 一旦动物有足够的镇静，将磁带上的背水面。眼部润滑剂应始终在麻醉下利用。
- 打开UV光源包括两个西屋F15T8UV-B灯与313纳米的峰值输出和一系列的280-370纳米。允许通过紫外分光光度计用紫外线传感器测得的灯，以平衡到一个恒定的紫外线输出（通常需要几分钟，让灯预热）。
- 根据如通过UV光度计测得的紫外线透射率，计算出的紫外线照射时间为每个所需的剂量。例如，我们的灯的紫外线输出的措施2.4毫瓦/厘米2。因此，施用5千焦耳/米2，皮肤将需要暴露在208秒（这是3分钟，28秒）的UVB辐射，计算如下：
upload/50670/50670eq1.jpg“/> - 将动物镇静剂（每到位闭塞磁带）腹面向下，以确保即使紫外线照射。施用所选择的剂量的紫外线辐射，依次取出小闭塞胶带覆盖该孔以露出1厘米皮肤的2个区域，以正确的剂量的辐射。因此，使用上面的例子，如果40千焦耳/米2是实验中的最大剂量，则该动物将灯泡下为27分钟和47秒的总和皮肤中的40千焦耳/米2的条件就没有覆盖磁带的整个时间。但是，磁带上覆5千焦/米2的条件时，会出现208秒剩余曝光被删除。胶带去除时机应该做的，让每个条件同时结束。
- 紫外线照射后，撕下胶带小心地从背部皮肤，注意不要撕裂突然或过度有力的运动的皮肤。将动物在温暖安静的地方，让麻醉恢复期。
- 监测小鼠为24-48小时，以寻找红斑（发红）或水肿的离散区域（肿胀）对应于暴露于UV辐射的特定剂量的解剖部位。照相记录皮肤的发现。
- MED值对应于最小剂量的紫外线红斑和/或皮肤的整个暴露圆的水肿定义，导致炎症。需要注意的是皮肤的色素沉着可以挑战的决心MED，然而，红斑和水肿仍然可以大致准确地评估，这要部分归功于在磁带上的小孔中的紫外线照射过程中定义的形状。
6。统计分析
通过单因素方差分析和Bonferroni事后检验（图垫棱镜）。P值 <0.05被认为是统计学显著分析老鼠的同伙之间的数据。
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Representative Results
上结合了K14-SCF基因所描述的（ 图1A）eumelanotic，pheomelanotic或无色素的背景中产生C57BL / 6小鼠。皮肤白皙的扩展同伙（MC1R E / E，酪氨酸+ / +）小鼠，每日两次剂量溶媒（70％乙醇，30％丙二醇）或40％的粗毛喉鞘蕊根提取物（每80微米的局部治疗剂量），连续5天（ 图2B）。对表皮色素沉着的局部治疗效果进行既通过目测和通过反射色度（ 图1B）来确定。是与在K14-SCF基因背景，但不是在基因匹配的非转基因动物强健表皮变黑相关的根提取物中的应用。我们解释这些结果表明，滤泡表皮黑素细胞中必须存在，以便为药理学诱导的黑色素在epide沉积RMIS。因为除了毛喉素的植物的植物化学物质的存在，虽然根提取物是深色的，皮肤变黑不能仅归因于从药物染色效果，因为非转基因动物没有表现出皮肤与根提取物（ 图1B）变暗。当在每天两次的方式应用，melanizing局部应用毛喉素的影响可以注意到在短短的2天，虽然最大变黑是经过多天（ 图1C）实现的。黑化的程度是剂量依赖性的，如通过用不同浓度的药物（ 图1D）的处理过的背侧皮肤的部分塔纳-马森黑色素染色。
其次，正如上文所述（ 图2 A和B）局部应用毛喉素对紫外线敏感性的影响是通过延长小鼠MED测试（MC1R E / E，酪氨酸+ / +）来确定。 MED测定ANI进行了比较与加速药物治疗（每天两次给药5天，10总剂量）与一个标准的方法（每日一次给药15天，15总剂量）治疗MALS。非转基因小鼠被纳入，以控制非黑色素药物作用。两种治疗导致变黑的毛喉素处理K14-SCF动物类似金额的皮肤。具体而言，毛喉素暴露的动物长*（反射比色法白黑标）值分别为31.9±1.8和31.1±1.6加速应用与标准的应用，分别为。共有来自毛喉素暴露在任一治疗组无明显毒性作用，因此，我们的结论是，加速毛喉素给药（每天10总剂量，每剂80微米的两倍）促进背部皮肤的黑化安全尽可能有效地以前使用（每日一次，连续15总剂量，每种剂量80μM）。
毛喉素诱导表皮黑化导致作为判断MED（ 图2C-D）深刻的紫外线防护。因此，尽管意味着对MED治疗两次，连用5天有车辆K14-SCF延长小鼠为5.0±0.0千焦/米2，平均MED与毛喉素外用治疗同伙为> 30.0±0.0千焦/米2（ 图2 A和C）。事实上，为30.0千焦耳/米2的剂量不足以产生红斑在本实验中。使用标准的毛喉素剂量（每天一次，共15剂，每剂80微米），我们发现，平均MED与毛喉素治疗的K14-SCF延长小鼠为50.0±7.1千焦/米2（ 图2 B，D）。重要的是，毛喉素的前处理没有影响的，因为或者由于酪氨酸酶缺乏症（ 图2E）缺乏K14-SCF-介导的表皮黑素细胞（ 图2C，D）MED动物不能黑化的，无论是。由于毛喉素的应用程序都显示继续之前，UV暴露2天，紫外线照射后不继续，我们得出结论，非颜料cAMP的作用没有在MED结果发挥作用。相反，该数据表明，表皮黑色素是由毛喉素诱导的紫外线保护在该模型中的作用机制。
图1。局部治疗毛喉素促进肌肤变黑的皮肤白皙的扩展名（MC1R E / E）小鼠。C57BL / 6在这项研究中使用的动物（A）的照片。动物是遗传上匹配除了在黑素皮质素受体1（MC1R）和酪氨酸酶（TYR）基因位点。需要注意的是色素沉着是eumelanotic（黑色）时，MC1R的功能，但pheomelanotic（blondish）时，MC1R是有缺陷的，为的是与案件扩展（MC1R E / E）突变体。表皮色素沉着取决于保留在皮肤的K14-SCF基因滤泡表皮黑素细胞，并且可以在耳朵很容易地看到。 分机 （B）的照片（MC1R E / E）K14-SCF或非转基因动物对待与400微升车辆控制（70％乙醇30％丙基乙二醇）或40％w / v的（80微米）毛喉素每天涂抹两次，以剃光背部皮肤，连续5天，共10个应用程序。分别对每个组的皮肤颜色测量由反射比色法。反射比色法结果报告为平均值（±SD）反射单元在L *（黑白）色轴。需要注意的是毛喉素的局部给药导致强健皮肤变黑的K14-SCF的转基因动物，但不能在非转基因小鼠（C）的时间过程实验表明K14-SCF的毛喉素处理的耳朵的发黑扩展老鼠所指示的时间（毛喉素处理的耳朵是由蓝色三角形表示）。车辆被应用到右耳进行比较。（D）丰塔纳-马森染色的皮肤切片与毛喉素所描述的指定剂量治疗的动物服用。 点击这里查看大图 。
图2。毛喉素诱导黑色素保护皮肤免受紫外线介导的炎症由最小红斑量（MED）的测试来确定。 （A，B）位置的紫外线闭塞磁带和UVB剂量每天两次治疗5天（A，C）或每日一次，与任何车辆或毛喉素15天（B，D，E）的动物。钍 e最近外用治疗应用于48小时前照射。背部皮肤用紫外闭塞胶带冲压出1cm 2的圆形孔，和不同的曝光时间，以产生适当的剂量暴露于不同剂量的UVB。照射后，皮肤暴露的圆圈进行标记，在一些实验一支笔。 MED的，由红斑和/或暴露的皮肤到特定剂量的整个圆的水肿定义，测定曝光后48小时。该MED±标准差结果报道千焦/米2的UVB，* P≤0.001。（五）皮肤颜色反射和治疗10天，车辆或毛喉素酪氨酸缺乏K14-SCF白化延长小鼠的MED值。 点击这里查看大图 。
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图3。实验的整体架构。 扩展各县（MC1R E / E）K14-SCF或非转基因动物由电动剪切和/或化学脱毛去除背部皮毛编制。然后，将动物用载体（70％乙醇，30％丙二醇）的局部施用或用40％的粗提取物毛喉素所指示的给药方案治疗。影响皮肤色素沉着均有详细记载照相，色度和塔纳 - 马森黑色素染色。紫外线敏感性，最小红斑量（MED）的测试来确定。
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Discussion
使用皮肤白皙的人的动物模型，我们发现一个毛喉素富含粗根提取物的局部应用强劲，刺激黑色素的生成在皮肤变暗的表皮。表皮黑色素是依赖于干细胞因子在基底表皮的表达，如发生在人类皮肤，但不能在基因未修饰小鼠皮肤。基因未修饰小鼠的背部皮肤缺乏足够数量的滤泡黑色素细胞以赋予颜料在皮肤上。只在黑素细胞生长因子，如干细胞因子（kit配体）或肝细胞生长因子（HGF）的组成型表达的设置可以黑素细胞在整个动物50-51的寿命保持在表皮的基底层。我们的动物的皮肤白皙的人的模型是基于K14-SCF基因到C57BL / 6小鼠的延长线色素变异注册成立。虽然任何年龄的动物可以是使用时，我们的实验中通常涉及青少年（4-12周龄）小鼠。因为被截断的黑皮质素1受体（MC1R），导致cAMP信号损失， 延长小鼠优先表达褐黑素在大衣和皮肤（在K14-SCF或HGF-Met的转基因状态），而不是真黑素52-54。作为改变黑色素表达的结果，K14-SCF分机小鼠得多UV敏感比其MC1R-野生型对应物，其具有喷射黑色皮肤由于表皮黑色素色素1丰富的沉积。我们的理由是因为真黑素产量大大减少了突变MC1R的设置，即模仿MC1R信号兴奋剂药物可能拯救真黑素的生产。 MC1R是G S-偶联跨膜受体，其在它的高亲和性配体的结合的α-黑素细胞刺激激素（α-MSH），发送亲分化信号的黑色素通过腺苷酸环化酶激活第二信使cAMP和生产核细胞细胞质中。因此，我们推测，局部应用毛喉素，细胞渗透性二萜类化合物是腺苷酸环化酶的一种有效的直接激活剂，或许能促进黑色素的生产在MC1R缺陷，pheomelanotic状态。
用纯化的毛喉素对这些研究，然而，事实证明成本过高。早期的实验确定毛喉素需要在K14-SCF推广模式表皮变黑的最低金额建议，最大变黑发生，每使用毛喉素含有20％的粗提取物（重量单位重量），体积溶液中使用40％的重量。我们计算的400微升8％的最终毛喉素的该应用程序（每体积重量; 40％×20％）的溶液将导致递送约毛喉素的80μM到背部皮肤的每个应用程序。当然，许多输送剂量的不被皮肤所吸收，而不是被吸收了由周围的皮毛或在申请时脱落的动物。因此，它是困难的报告，动物接受与药物的每个应用程序的具体实现剂量。然而，当以这种方式应用，在强大的感应中黑色素的皮肤和颜料的生产酶的毛喉素的结果。事实上，K14-SCF基因延长动物表现出对皮肤的变黑清楚第二应用（ 图1C）之后。
虽然我们之前已经公布的皮肤与药物1,48-49的日常应用变黑，在这里我们表明，每天两次的应用程序具有强大的表皮变黑，并显著防紫外线相关，提示药物诱导的黑化可以通过管理优化药物超过一天一次更频繁。皮肤变黑，这在表皮是由于黑色素诱导，持续为只要外用毛喉素治疗是继续。甚至慢性申请（通过3个月）似乎很好的耐受性的小鼠49。在皮肤变黑的增加，是由于黑素合成，而不是黑素细胞的表皮层49的增殖。一旦局部治疗被停止，皮肤逐渐变淡回到基线白晰（超过2-3周）为表皮黑色素丢失与正常角质细胞更新。皮肤变黑可以通过小鼠简单的目视检查容易地确定，但是肤色可客观使用反射比色法55-56进行量化。此方法是一种非侵入性的快速，无痛的方法，用于测量皮肤的颜色。颜色可以准确地描述使用的L * a * b *表（LAB）色彩空间模型57-58。
对于这些实验，我们依靠彩叶植物forskolii，毛喉素的天然来源的粗根提取物。这种准备被使用，因为执行这些实验与毛喉素纯化的成本高。该实验中，例如，需要大致2克福斯克林总为每天两次应用到六只动物为五天。 2克市售的高效液相色谱纯化毛喉素将花费2万元以上，相比之下，不到5元的粗提取物。虽然纯净毛喉素诱导表皮黑色素在我们的动物模型1，我们不能排除其他植物衍生的化合物在粗根提取物可能产生的影响，包括生物碱，酚类和鞣质。事实上，使用豚鼠或人的皮肤外植体以前的工作表明，在粗根提取物的化合物可促进毛喉素59的皮肤吸收。然而，迄今为止，身份以及这些化合物的作用机制尚不清楚。因此，我们不能排除修改粗根提取物天然存在其他化合物的影响。
该复合毛喉素混合物深棕色液体与被容易地应用到皮肤上局部应用的有吸引力的香料样的香气。由于不溶物已被删除，日常应用不会留下结痂或存款一旦被皮肤吸收。虽然粗根提取物为黑褐色，当以这种方式制备的，皮肤变黑诱导药物不仅是一种染料的效果，具体表现为事实，对动物皮肤无法黑色素的化合物（ 如MC1R E / E酪氨酸酶的局部应用缺陷白化动物或非转基因小鼠缺乏表皮黑素细胞）对皮肤变黑（ 图1B和图2E）没有影响。我们认为，这些实验是验证性的概念示威操纵的cAMP的皮肤可诱发抗紫外线黝黑的皮肤色素沉着。然而，这是不可能的毛喉素的局部给药是由于药物的非特异性性质的可行或实际的治疗选项。我ndiscriminate和腺苷酸环化酶和cAMP的诱导的非靶向激活可能预期会导致不可接受的毒性。重要的是，其他人都表现出一种磷酸二酯酶4抑制剂（咯利普兰）的局部给药，有力地上调黑色素在K14-SCF延长动物模型，证明了皮肤的cAMP诱导和黑化可以通过瞄准35替代药物来实现。显然，前局部操纵cAMP水平的皮肤可以被翻译为人类使用，其安全性将必须仔细评估。然而，我们的数据有力地表明，药理学诱导黑色素是紫外线防护由最小红斑量（MED）的测试来确定。
综上所述，毛喉素，腺苷酸环化酶激活剂局部给药，导致皮肤白皙的人的基础上有缺陷的cAMP信号向下小鼠模型的表皮的黑色素强有缺陷的黑皮素1受体（MC1R）流。表皮黑色素被紫外线防护，由最小红斑量（MED）的测试测量。我们推测，药物的cAMP操作不仅可以拯救紫外线防护eumelanization表皮，但其他MC1R依赖性抗紫外线的反应也是如此。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
作者要感谢MALINDA轻快的技术援助。我们也承认目前和过去资金来源：美国国家癌症研究所（R01 CA131075，R01 CA131075-02S1），温迪威尔案例癌症研究基金，马基癌症基金会，儿童奇迹网络和珍妮弗与大卫·狄更斯黑色素瘤研究基金会。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Coleus Forskoli extract 20% | Buckton Scott USA Inc. | n/a | Princeton, NJ |
| Isothesia, Isoflurane , USP | Butler Schein | NCD 11695-6776-1 | Dublin, OH, USA |
| Xylazine | Anased Injection | LA04612 | Shenandoah, Iowa, USA |
| Ketamine HCl, USP | Putney | NDC 26637-411-01 | St. Joseph, MO, USA |
| Ethanol | Decon Labs. | 2705 | |
| Propylene glycol | Adesco | 05751L | Solon, OH, USA |
| Depilatory cream, Nair | Church Dwight | JF-11 4381322 | Priceton, NJ |
| EQUIPMENT | |||
| Germicidal Hg Lamp UV-B | Westinghouse | F15T8UV-B | |
| Radiometer photometer | International light | 1LT400A | Peabody, MA,USA |
| Chromameter | Konica Minolta | CR-400 | Ramsey, NJ, USA |
| Data Processor for Chromameter CR-400 | Konica Monilta | DR-400 | Ramsey, NJ, USA |
References
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