Summary
Melanina epidérmica é induzida pela aplicação tópica de forscolina em um modelo murino da humano sensível aos raios UV de pele clara. Manipulação farmacológica de níveis de cAMP na pele e escurecimento da epiderme proteger fortemente contra a inflamação mediada por UV (queimadura solar), como medido pela dose eritematosa mínima (DEM) de ensaio.
Abstract
Equidade de pele, a sensibilidade de UV e o risco de cancro da pele em correlação com a função fisiológica do receptor de melanocortina 1, uma proteína de sinalização G s acoplados a encontrada na superfície de melanócitos. Mc1r estimula a adenilil-ciclase e a produção de cAMP, que, por sua vez, se regula a produção melanocítico da melanina na pele. Para estudar os mecanismos pelos quais a sinalização Mc1r protege a pele contra os danos UV, este estudo se baseia em um modelo de rato com "pele humanizado", baseado na expressão epidérmico do fator de células-tronco (SCF). Camundongos transgênicos K14-SCF reter melanócitos na epiderme e, por conseguinte, ter a capacidade de depósito de melanina na epiderme. Neste modelo animal, de tipo selvagem resulta num estado Mc1r de deposição robusta de pigmento eumelanina preta e um fenótipo UV-protegido. Em contraste, os animais K14-SCF com defeito sinalização Mc1r capacidade apresentam uma pigmentação vermelha / louro, muito pouco eumelanin na pele eum fenótipo sensível aos raios UV. Raciocínio que a deposição de eumelanina pode ser reforçada por agentes tópicos que imitam sinalização Mc1r, descobrimos que a aplicação direta do extrato forskolin na pele de camundongos de pele clara Mc1r-defeituoso resultou na indução eumelanin robusto e proteção UV 1. Aqui nós descrevemos a metodologia de elaboração e aplicação de um extrato de raiz natural, contendo forskolin para K14-SCF camundongos de pele clara e relatar um método para medir a sensibilidade UV determinando a dose eritematosa mínima (DEM). Usando este modelo animal, é possível estudar como indução epidérmica cAMP e melanização da pele afetam respostas fisiológicas à exposição UV.
Introduction
A incidência de melanoma, a forma mais letal de câncer de pele, aumentou dramaticamente ao longo das últimas décadas nos Estados Unidos, principalmente entre os indivíduos de pele clara. Evidência molecular e epidemiológica forte implica radiação UV como um grande causador fator ambiental 2-5. O aumento da exposição aos raios UV na forma de exposição ao sol e uso de bronzeamento artificial é provável que seja responsável por grande parte do aumento na incidência de melanoma 6-7. O risco de melanoma parece particularmente ligada com queimaduras 8, especialmente aqueles no início da vida 9-10. Risco de queimadura solar está ligado não só com a dose e a intensidade de exposição à radiação UV, mas também por factores que influenciam a resposta herdadas cutânea à radiação UV. A pigmentação da pele é um dos mais importantes determinantes da sensibilidade UV, risco de queimaduras e risco de câncer. Melanoma ocorre cerca de vinte vezes mais freqüentemente em pessoas de pele clara em relação a individua pele escurals 11-13.
A melanina, um pigmento produzido por melanócitos na epiderme, é o principal determinante da tez da pele. Melanina vem em duas variedades principais: (1) eumelanina, um marrom / preta pigmento escuro eficaz em absorver a energia da radiação UV, e (2) feomelanina, um avermelhado / louro pigmento menos eficaz na prevenção da penetração de fótons ultravioleta na pele. A cor da pele, sensibilidade à UV e risco de melanoma são em grande parte determinado pelo conteúdo epidérmico eumelanin 14-15. O mais eumelanina na epiderme, os menos fotões UV pode penetrar na pele. Por causa de baixos níveis inatas de eumelanina, indivíduos de pele clara são muito mais propensos a efeitos agudos e crônicos da radiação UV 16-18.
A pigmentação da pele, risco de melanoma e a capacidade de "bronzear" após exposição UV todos correlaciona com a capacidade de sinalização do receptor de melanocortina 1 (Mc1r), um G s acoplados a sete transmembranar sreceptor urface em melanócitos 19-22. Quando se liga Mc1r seu cognato ligando de alta afinidade, a hormona estimulante de melanócitos α-(α-MSH), que é a activação da adenilil-ciclase e a produção do segundo mensageiro AMPc 23. A resposta fisiológica normal da pele após a exposição aos raios UV inclui a produção epidérmica de α-MSH por queratinócitos 24-29. Nós e outros supor que derivado de queratinócito α-MSH liga-se a Mc1r em melanócitos epidérmicos, iniciando a produção a jusante do segundo mensageiro AMPc através de activação de adenililciclase 30. os níveis de cAMP controlar vários aspectos da diferenciação dos melanócitos, incluindo as vias de sobrevivência, reparo do DNA e síntese de pigmentos. Sinalização Mc1r e Camp induzir claramente os níveis de enzimas de pigmentos e produção eumelanin. Quando sinalização Mc1r está intacto e os níveis de cAMP melanocíticos são robustos, eumelanin é produzida ea pele escurece. No entanto, se a sinalização Mc1r está com defeito eos níveis de cAMP citoplasmáticos permanecem baixas, pheomelanin é produzido em vez de 1. Síntese Eumelanin pode ser estimulada farmacologicamente por agentes que aumentam os níveis de AMPc 1,14,31-35.
Uma vez que a proteína Mc1r é um grande regulador do risco de melanoma em humanos 36-46, estamos interessados em mecanismos pelos quais Mc1r protege melanócitos contra carcinogênese induzida por UV. Como base para os nossos estudos, geramos um modelo murino Mc1r variante transgênica em um C57BL / 6 genética fundo puro 1. Neste modelo, o factor de células estaminais (SCF) é constitutivamente expressa na epiderme basal e melanócitos epidérmicos interfoliculares são retidos na pele ao longo da vida 47, em contraste com os ratinhos não transgénicos, em que os melanócitos localizar a derme nos folículos do cabelo. Com o transgene K14-SCF incorporada, a epiderme fica pigmentado com a característica particular de pigmentos de melanina do pigmentoestirpe do animal 1. camundongos K14-SCF no fundo C57BL / 6 genética com tipo selvagem sinalização Mc1r ter pele de azeviche caracterizada por níveis muito altos de eumelanina pigmento. Não surpreendentemente, esses animais são altamente resistentes UV-. Em contraste, geneticamente compatíveis K14-SCF animais C57BL / 6 que abrigam um mutante inactivo Mc1r não têm quase nenhuma eumelanina na epiderme. Em vez disso, esses animais "extensão" (Mc1r E / E) têm uma tez da pele justo causada pela deposição de pigmento feomelanina (Figura 1A) e são muito mais sensíveis ao UV 48-49.
Compostos farmacológicos com propriedades químicas que permitem a penetração na pele têm sido mostrados para induzir potencialmente eumelanina na extensão (Mc1r E / E) modelo animal K14-SCF por manipulação directa dos níveis de cAMP nos melanócitos epidérmicos da pele. Upregulation melanina neste modelo foi reported através da activação da adenililciclase 1, bem como a inibição da fosfodiesterase 4 35. Neste artigo, vamos demonstrar a preparação e aplicação tópica de forskolin em extensão (Mc1r e / e) animais K14-SCF qual o modelo que o ser humano sensível ao UV de pele clara. Mostra-se que a aplicação duas vezes por dia do medicamento promove melanização acelerado, que o escurecimento da pele é devido à deposição de melanina epidérmica e pigmento melanina epidérmica induzida que protege contra as queimaduras solares induzidas por UV por meio de medição de "dose eritematosa mínima" (MED) de 48.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparação de Forskolin para administração tópica de um extrato de raiz bruto da Usina Plectranthus barbatus (Cohleus forskohlii)
- Protocolos para experimentos murino seguiu as diretrizes para a conduta ética no cuidado e uso de animais e foram aprovados pelo Comitê Institucional Animal Care e Use na Universidade de Kentucky (Protocolo n 00768M2004). O extracto de raiz é composta de 40% peso / volume, em uma base dermatológica padrão de 70% de etanol, 30% de propileno glicol.
- Pesar 200 g de extrato de raiz de forskolin bruto e transferi-lo para um copo. Para fazer 500 ml de uma solução a 40% (w / v), ressuspender 200 g de extracto de raiz de forscolina em bruto por adição de mais, mas não todo o volume do veículo (etanol a 70%, 30% de propileno glicol) e levar a solução a cerca de 450 ml.
- Agita-se durante uma hora à temperatura ambiente. A solução será um pouco viscosa e pode necessitar de agitação manual para "levantar" o extracto em solução antesa barra de agitação é capaz de assumir.
- Após uma hora de agitação, verter a mistura em um cilindro graduado e levar o volume a 500 ml usando veículo que tem sido usada para "enxaguar" a proveta que foi usada para agitar a suspensão (para maximizar a recuperação de forscolina a partir da proveta) .
- Transferência da suspensão de 50 ml de tubos de centrífuga de polipropileno. Centrífuga (1.500 x g, a temperatura ambiente, 15 min), usando uma centrífuga de mesa. Neste ponto, o material insolúvel vai ser bastante compacta, permitindo-se o sobrenadante para ser facilmente vertido.
- Filtrar a solução através de uma membrana de acetato de celulose de 0,22 um para remover qualquer material insolúvel residual a partir do extracto. Usamos um sistema para frascos concebido para a cultura de células, juntamente com a utilização de pré-filtros, que vêm com o aparelho, para evitar coagulação prematura da membrana a partir de componentes insolúveis do extracto de raiz. Ao fazer grandes volumes de extracto, filtrar a cerca de 100 ml de cada vez, a alteração da aposta pré-filtroween cada volume adicionado.
- Quando armazenada à temperatura ambiente, o extracto mantém actividade biológica durante até um ano.
2. Preparação de C57Bl / 6 K14-Scf Ratos para tratamentos tópicos
- Retire a pele dorsal dos animais por corte elétrico. Resumidamente anestesiar os animais com isoflurano inalatório para facilitar corte de pele dorsal com tesouras elétricas equipadas com uma 0,25 milímetros cabeça de preparação cirúrgica (Fisher Scientific). De preferência, usar apenas um tipo de anestesia (por exemplo, cetamina / xilazina) para minimizar o risco de overdose de anestésico. A câmara de inalação saturado traz risco ocupacional quando usado fora de uma coifa e fornece quantidades desconhecidas de anestésico para animais. Idealmente, um vaporizador de precisão deve ser usado.
- Para remover a palha residual cabelo, tratar os animais com um depilatório químico. Administrar anestesia para o animal com uma injecção ip de cetamina 40 mg / kg de xilazina e 4 mg / kg Uma vez que os animais são devidamente anestesiados (a julgar pelo toe pitada), aplique uma quantidade dedo-sized de creme depilatório para a pele dorsal cortado usando um dedo de luva. Esfregue o creme na pele por 30-60 seg ou até que os cabelos podem ser claramente visto no creme como está sendo movimentados. Deixar o creme apenas para a quantidade de tempo mínima necessária para a remoção do cabelo como a exposição prolongada conduz a queima química da pele, desagregação epidérmica e morte causados pela perda de integridade da epiderme.
- Limpe a pele dorsal com compressas de gaze embebida em água repetidamente até que todos creme foi removido. Animais seque com toalhas de papel macio, e permitir-lhes recuperar em um local quente isolada (por exemplo, limpar gaiolas colocadas em uma almofada de aquecimento). Depilar os animais um a um e acompanhar de perto todo o procedimento.
3. A administração tópica de Forskolin ou controle do veículo
- Os animais devem ser tratados um de cada vez. Resumidamente anestesiar com inspiraçãod isoflurano, colocando o mouse em cima de um filtro permeável ao ar nylon equipados de forma sob a qual foi colocada uma toalha de papel saturado de isoflurano em uma jarra de vidro com tampa clara saturado de isoflurano em uma coifa. Exponha o mouse para isoflurano durante o tempo suficiente como para suprimir movimentos musculares voluntários, mas para preservar a respiração espontânea (tipicamente 10-20 seg.) Deixar o animal em isoflurano muito tempo irá resultar em supressão respiratória e morte. É melhor errar do lado da "luz vai" e ter de voltar a expor o mouse rapidamente para mais isoflurano, em vez de sobre-expor o animal à morte de drogas e risco.
- Retire o animal da câmara de isoflurano e coloque em uma almofada banco absorvente limpo.
- Usando uma micropipeta de 1000 ul equipado com uma ponta descartável de polipropileno, chamar-se 400 ul de 40% de extracto de forscolina em bruto (animais de controlo de veículo irá receber 70% de etanol, 30% de propileno glicol por si só).
- Transferir o extracto sobre odorso do animal por gotejamento que sobre a pele e, em seguida, utilizando-se o lado da ponta da pipeta, manchar o extracto sobre a pele dorsal até que toda a pele tenha sido coberta. Não há necessidade de apagar a pele após a aplicação.
- Retorne o mouse para sua jaula, e observar cuidadosamente até que ele se recupera da anestesia.
- A fim de que os efeitos não-cAMP pigmento não deve confundir experimentos de sensibilidade de UV, interromper todos os tratamentos tópicos 2 dias anteriores à exposição à radiação UV (pigmento de efeito dura vários dias além último tratamento tópico).
4. Pele de medição de cor por Reflective Colorimetria
- Resumidamente anestesiar o mouse com isoflurano inalado (veja acima).
- Calibrar um colorímetro Minolta, colocando a cabeça móvel sobre a superfície branca normalizadas fornecidas com o colorímetro.
- Coloque a cabeça de medição portátil do colorímetro nivelada com a pele dorsal do animal garantindo que a rodada Apertur um centímetro 2e está completamente pressionado sobre a pele. Tome pelo menos três medidas distintas em diferentes áreas da pele dorsal.
- Calcular média L pontuação * ± SD por animal e por grupo de tratamento. Colorimetria reflexiva pode ser feito em qualquer ponto do experimento.
5. Determinação da Sensibilidade UV por Cálculo de "Minimal eritematosa Dose" (MED)
- Use animais que tenham sido pré-tratados com veículo ou forscolina como descrito acima. Anestesiar os animais com injecção intraperitoneal de uma mistura padrão de cetamina e xilazina (ver acima).
- Prepare um pedaço de fita UV-oclusiva para o teste MED. Para gerar furos na fita, use um furador pesados com um 1 cm 2 recorte circular (Figuras 2A e B). Ter furos de um tamanho definido e disposição simétrica na fita facilita o reconhecimento de alterações na pele após a irradiação. Sobre cada buraco na fita, aplique um pedaço pequeno, mas facilmente destacável da fita que podem ser removidos em períodos definidos durante a exposição aos raios ultravioleta para permitir a administração de doses de UV diferentes.
- Uma vez que os animais são adequadamente sedado, coloque a fita na superfície dorsal. Lubrificante ocular devem ser sempre utilizados sob anestesia.
- Ligue a fonte de UV consistindo de dois Westinghouse F15T8UV-B lâmpadas com uma potência máxima de 313 nm e uma gama de 280-370 nm. Permita que a lâmpada atingir a uma saída de UV constante medida por um fotômetro UV com um sensor de UVB (geralmente leva alguns minutos para que as lâmpadas para aquecer).
- Com base na taxa de transmissão de UV tal como medido pelo fotómetro UV, calcular o tempo de exposição à radiação UV, para cada dose desejada. Por exemplo, medidas de UVB saída do nosso lâmpada de 2,4 mW / cm 2. Portanto, para administrar 5 kJ / m 2, a pele que necessita de ser exposta a 208 segundos (o que é de 3 min e 28 seg) da radiação UVB, como calculado abaixo:
upload/50670/50670eq1.jpg "/> - Coloque os animais sedados (cada um com fita oclusivo no local) ventral superfície para baixo para garantir a exposição ainda UV. Para administrar as doses escolhidas de radiação UV, remover sequencialmente as pequenas fitas oclusivas que cobrem os orifícios para expor áreas de 1 cm2 de pele para as doses correctas de radiação. Assim, utilizando o exemplo acima, se 40 kJ / m 2 é a maior dose na experiência, então o animal estaria sob a lâmpada de 27 min e 47 seg total e a pele no estado de 40 kJ / m 2 não teria sobrepondo-se a fita o tempo todo. Entretanto, a fita se sobrepõe à condição 5 kJ / m 2 seria removido quando não é de 208 seg restante da exposição. O tempo de remoção de fita deve ser feito para que cada condição termina simultaneamente.
- Após a exposição UV, descolar a fita da pele dorsal com cuidado, tomando cuidado para não rasgar a pele com movimentos bruscos ou excessivamente fortes. Coloque os animais em um lugar calmo quente para permitirrecuperação da anestesia.
- Monitorar ratinhos durante 24-48 horas a olhar para zonas discretas de eritema (vermelhidão) ou edema (inchaço) correspondente para os locais anatómicos expostos a uma dose específica de irradiação UV. Documente achados cutâneos fotograficamente.
- MED valor corresponde à dose mínima de UV, que provoca a inflamação, tal como definido por eritema e / ou edema de todo o círculo de pele exposta. Note-se que a pigmentação da pele pode desafiar a determinação do MED, no entanto, eritema e edema ainda pode geralmente ser avaliada com precisão, graças em parte à forma definida das aberturas na fita durante a exposição UV.
6. Análise Estatística
Analisar dados entre grupos de ratos por um way ANOVA com pós-teste de Bonferroni (Graph Pad PRISM). Valores de p <0,05 são considerados estatisticamente significativos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C57BL / 6 machos foram gerados em fundos eumelanotic, pheomelanotic ou amelanóticos incorporando o transgene K14-SCF como descrito (Figura 1A). Coortes de extensão de pele clara (Mc1r E / E, Tyr + / +) os ratos foram tratados topicamente com duas doses diárias de veículo (etanol a 70%, 30% de propileno glicol) ou 40% de extracto de raiz de Coleus forskohlii bruto (80 uM por a dose), durante 5 dias (Figura 2B). Efeitos dos tratamentos tópicos sobre a pigmentação da epiderme foram determinados por inspecção visual e por colorimetria reflexivo (Figura 1B). A aplicação do extracto de raiz foi associada com robusta escurecimento da epiderme no fundo transgénico K14-SCF, mas não em animais não-transgénicos combinados geneticamente. Interpretamos estes resultados indicam que os melanócitos epidérmicos interfoliculares deve estar presente para que a melanina induzida farmacologicamente para ser depositado na epidemiologiaRMIS. Embora o extracto de raiz é profundamente colorida devido à presença de fitoquímicos planta além de forscolina, o escurecimento da pele não pode ser apenas devido a um efeito de tingimento da droga, os animais não-transgénicos não exibem escurecimento da pele, com o extracto de raiz (Figura 1B). Quando aplicados de forma duas vezes por dia, os efeitos da forscolina topicamente melanizing pode ser observado em menos de dois dias, apesar de escurecimento máxima é realizado após mais alguns dias (Figura 1C). Grau de melanização é dependente da dose, tal como mostrado por Fontana-Masson melanina coloração de secções de pele dorsal tratados com diversas concentrações da droga (Figura 1D).
Em seguida, o efeito da forscolina aplicado topicamente sobre a sensibilidade de UV foi determinada por meio de testes em ratinhos MED extensão (Mc1r E / E, Tyr + / +), conforme descrito acima (Figuras 2 A e B). Determinação MED foi comparada entre animals tratadas com um tratamento de drogas aceleradas (duas vezes ao dia, administração durante 5 dias, a 10 doses no total) em comparação com um método standard (administração uma vez por dia durante 15 dias, a 15 doses no total). Ratinhos não transgénicos foram incluídos para controlar os efeitos de drogas não-melanina. Ambos os tratamentos resultaram em quantidades similares de pele escurecendo em animais K14-SCF tratados com forscolina. Especificamente, os valores (escala de branco-preto colorimetria reflexivo) L * para os animais expostos ao forscolina foram 31,9 ± 1,8 e 31,1 ± 1,6 para aplicação acelerada versus aplicação padrão, respectivamente. Não houve efeitos tóxicos evidentes da exposição forskolin em ambos os grupos de tratamento, assim, conclui-se que a administração forskolin acelerado (duas vezes ao dia por 10 doses totais, 80 mM por dose) promoveu melanização segura da pele dorsal de forma tão eficaz que a utilizada anteriormente (uma vez por dia para doses totais de 15, 80 uM por dose).
Induzida por forscolina epidérmico melanização resultouproteção UV profundo, a julgar pelo MED (Figuras 2C-D). Assim, enquanto significar MED para os ratos de extensão K14-SCF tratados por duas vezes durante 5 dias com veículo foi de 5,0 ± 0,0 kJ / m 2, MED média para grupos tratados com forskolin tópico foi> 30,0 ± 0,0 kJ / m 2 (Figuras 2 A e C). De facto, numa dose de 30,0 kJ / m 2 foi suficiente para gerar eritema nesta experiência. Usando dosagem forskolin padrão (uma vez por dia para 15 doses totais, 80 mM por dose), descobrimos que MED média para ratos extensão K14-SCF tratados com forskolin foi de 50,0 ± 7,1 kJ / m 2 (Figura 2 B, D). Importante, pré-tratamento de forscolina não afectou MED de animais incapazes de melanização, quer por causa da falta de melanócitos epidérmicos K14-SCF-mediadas (Figuras 2C e D), ou por causa de deficiência de tirosinase (Figura 2E). Como os aplicativos de forscolina foram discontinuaram dois dias antes da exposição à radiação UV e não foram continuados após a exposição à radiação UV, podemos concluir que os efeitos do AMPc não-pigmentárias não desempenhar um papel nos resultados MED. Em vez disso, os dados sugerem que a melanização epidérmica foi o mecanismo pelo qual a forscolina induzida protecção UV neste modelo.
Figura 1. O tratamento tópico de forskolin promove o escurecimento da pele em extensão de pele clara (Mc1r e / e) ratos. (A) fotografias de C57BL / 6 animais utilizados neste estudo. Os animais são geneticamente compatíveis, exceto no melanocortina 1 receptor (Mc1r) e tirosinase (Tyr) loci. Note-se que a pigmentação é eumelanotic (preto) quando Mc1r é funcional, mas pheomelanotic (loiro) quando Mc1r é defeituosa, como é o caso com oextensão (Mc1r e / e) mutante. Epidermal pigmentação depende retenção de melanócitos epidérmicos interfoliculares na pele pelo transgene K14-SCF, e pode ser facilmente visto nas orelhas. (B) fotografia de extensão (Mc1r E / E) K14-SCF ou animais não transgénicos tratados com 400 ul de controlo de veículo (70% de etanol 30% de propilo-glicol) ou 40% w / v (80 ^ M) de forscolina aplicado duas vezes ao dia sobre a pele dorsal rapada, durante 5 dias, num total de 10 aplicações. Medições de cor da pele por colorimetria reflexivo foram realizadas para cada grupo. Resultados colorimetria reflectoras são relatados como unidades média (± DP) de reflectometria no eixo L * cor (preto-branco). Note-se que a administração tópica de forscolina causada pele escurecer robusta em animais transgénicos K14-SCF, mas não em ratinhos não transgénicos. Experimento curso (C) que mostra o tempo de escurecimento da orelha tratada por forscolina de K14-SCFratinhos de extensão para os tempos indicados (as orelhas tratadas com forscolina está indicada pelos triângulos azul). Veículo foi aplicado na orelha direita, para comparação. (D) Fontana-Masson cortes de pele corados tomados a partir de animais tratados com as doses indicadas de forscolina, conforme descrito. clique aqui para ampliar figura .
Figura 2. Melanização induzida por forscolina protege contra a inflamação mediada por UV, tal como determinado por A dose eritematosa mínima (DEM) de teste. (A, B) Posição de fita oclusiva UV e UVB doses de animais tratados duas vezes por dia durante 5 dias (a, c) ou uma vez por dia, durante 15 dias (B, D, E) ou com veículo ou forscolina. Th e último tratamento tópico foi aplicado 48 h antes da irradiação. Pele dorsal foi exposta a várias doses de UVB, usando fita adesiva de UV-oclusivo com um soco de saída 1 cm2 aberturas circulares, e variando os tempos de exposição para se obter a dose apropriada. Após a irradiação, os círculos de pele exposta foram marcados com uma caneta em algumas experiências. MED de, definida por eritema e / ou edema de todo o círculo de pele exposta a uma dose particular, foram determinadas 48 horas após a exposição. O MED ± SD resultados são relatados como kJ / m 2 UVB, * p ≤ 0,001. (E) reflectometria A cor da pele e dos valores MED para K14-SCF camundongos extensão albino tirosina deficiente tratados durante 10 dias com veículo ou forskolin. Clique aqui para ampliar figura .
70fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50670/50670fig3.jpg "/>
Figura 3. Esquema geral do ensaio. Coortes de extensão (Mc1r E / E) K14-SCF ou animais não-transgénicos foram preparadas através da remoção do pêlo dorsal por corte eléctrico e / ou depilação química. Os animais foram então tratados com aplicações tópicas de ou veículo (etanol a 70%, 30% de propileno glicol) ou com 40% de extracto de forscolina em bruto por os programas de dosagem indicadas. Efeitos sobre a pigmentação da pele foram documentados fotograficamente, colorimetria e através de coloração de Fontana-Masson melanina. Sensibilidade de UV foi determinada por A dose eritematosa mínima (DEM) de teste.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Usando um modelo animal do ser humano de pele clara, nós achamos que a aplicação tópica de um extrato bruto da raiz rica em forskolin robustamente escurece a epiderme, estimulando a produção de melanina na pele. Epidermal melanização é dependente da expressão do factor de células estaminais na epiderme basal, como ocorre na pele humana, mas não na pele de rato não modificado geneticamente. A pele dorsal de ratinhos geneticamente não modificada não tem um número suficiente de melanócitos interfoliculares para conferir pigmento para a pele. Somente na configuração de expressão constitutiva de um factor de crescimento de melanócitos tais como o factor de células estaminais (Kit ligando) ou factor de crescimento de hepatócitos (HGF) pode melanócitos ser retida na camada basal da epiderme, em toda a vida do animal 50-51. O nosso modelo animal do humano de pele clara é baseado na incorporação do transgene K14-SCF para a variante de extensão de pigmento da linha murino C57BL / 6. Embora os animais de qualquer idade pode serutilizado, nossas experiências envolvem tipicamente adulto jovem (4-12 semanas de idade) ratinhos. Por causa de um truncado melanocortina 1 receptor (Mc1r), que leva à perda de sinalização cAMP, ratos de extensão expressar pheomelanin preferencialmente no pêlo e da pele (nos estados transgênicos K14-SCF ou HGF-Met), em vez de eumelanina 52-54. Como resultado da expressão de melanina alterada, camundongos extensão K14-SCF são muito mais do que suas contrapartes do tipo MC1R-selvagem, que têm a pele cor de azeviche, devido à abundante deposição de pigmento epidérmico eumelanin 1 sensível ao UV. Nós raciocinamos que, desde a produção de eumelanina é muito reduzido no cenário de um Mc1r mutante, que os estimulantes farmacológicos que imitam sinalização Mc1r pode resgatar a produção de eumelanina. Mc1r é um receptor transmembranar acoplado a G s que, após a ligação do seu ligando de alta afinidade α-hormona estimulante do melanócito (α-MSH), transmite os sinais pró-diferenciação para o melanocitoplasma cyte através da ativação da adenililciclase e produção do segundo mensageiro cAMP. Assim, a hipótese de que a aplicação tópica de forskolin, um diterpenoide célula-permeável que é um ativador direto potente da adenilil ciclase, pode ser capaz de promover a produção de eumelanina no estado pheomelanotic Mc1r-defeituoso.
Usando forscolina purificada para estes estudos, no entanto, provou ser de custo proibitivo. As primeiras experiências que determinam a quantidade mínima de forscolina necessária para o escurecimento da epiderme no modelo de extensão K14-SCF sugerido que escurecimento máxima ocorreu com o uso de um peso de 40% por volume de solução utilizando o extracto bruto que continha 20% (peso por peso) de forscolina. Calculamos que a aplicação de 400 ul de uma forscolina final de 8% (peso por volume, 40% x 20%) solução resultaria na entrega de cerca de 80 uM de forscolina para a pele da região dorsal de cada aplicação. Naturalmente, a maior parte da dose libertadanão é absorvido pela pele, em vez de ser absorvido pela pele circundante ou cair do animal no momento da aplicação. Assim, é difícil para relatar a dose exacta percebeu que os animais recebem, com cada aplicação da droga. No entanto, quando aplicado no presente modo, os resultados de forscolina na indução de enzimas robusta pigmento na pele e produção de eumelanina. Na verdade, K14-SCF animais transgênicos extensão demonstrou clara escurecimento da pele após a segunda aplicação (Figura 1C).
Embora tenhamos pele escurecendo com aplicação diária da droga 1,48-49 publicado anteriormente, aqui vamos mostrar que a aplicação duas vezes ao dia está associada com forte escurecimento epidérmico e proteção UV significativa, sugerindo que melanização farmacológico-induzida pode ser otimizado pela administração do droga mais freqüentemente do que uma vez por dia. O escurecimento da pele, o que é devido à indução eumelanina na epiderme, dura comoEnquanto os tratamentos forscolina tópicas são continuados. Mesmo aplicação crónica (por meio de três meses) pareceu bem tolerado pelos ratos 49. O aumento no escurecimento da pele é devido à síntese de melanina em vez da proliferação de melanócitos na epiderme. 49. Uma vez que os tratamentos tópicos são interrompidas, a pele desaparece gradualmente de volta à sua base pele clara (mais de 2-3 semanas) como epidérmico melanina é perdido com a renovação dos queratinócitos normal. O escurecimento da pele pode ser facilmente determinada por simples inspecção visual dos murganhos, no entanto a cor da pele pode ser quantificada objectivamente utilizando colorimetria reflexivo 55-56. Este método é um método rápido e indolor não-invasiva para a medição da cor da pele. A cor pode ser descrito com precisão usando o L * a * b * (LAB) modelo de espaço de cor 57-58.
Para esses experimentos, contamos com um extrato de raiz bruto da planta forskolii Coleus, a fonte natural de forskolin. Esta preparaçãofoi usada devido ao elevado custo de realizar estas experiências com forscolina purificado. Nesta experiência, por exemplo, é necessária cerca de 2 g do total de forscolina para aplicação duas vezes por dia a seis animais por cinco dias. 2 g de disponível comercialmente forskolin purificados por HPLC custaria mais de US $ 20.000, em comparação com menos de US $ 5 para o extrato bruto. Embora forskolin purificada induzida epidérmica de melanina em nosso modelo animal 1, não podemos descartar possíveis efeitos de outros compostos derivados de plantas do extrato de raiz de crude, incluindo alcalóides, fenóis e taninos. Na verdade, o trabalho anterior usando cobaia ou explantes de pele humana sugerem que compostos do extrato de raiz de crude pode promover a absorção cutânea de forskolin 59. Até agora, no entanto, a identidade e o mecanismo de estes compostos permanecem desconhecidos. Assim, não se pode descartar efeitos de outros compostos presentes naturalmente no extrato de raiz de crude modificando.
A mistura é composta de forscolinaum líquido castanho-escuro, com um aroma tempero semelhante atraente que pode ser facilmente aplicada na pele para aplicação tópica. Porque os materiais insolúveis foram removidos, a aplicação diária deixa crostas ou depósitos uma vez absorvido pela pele. Embora o extracto de raiz em bruto é castanho escuro quando preparado deste modo, o escurecimento da pele induzida pela droga não é simplesmente um efeito corante, tal como demonstrado pelo facto de que a aplicação tópica do composto em animais incapazes de melanização pele (por exemplo, Mc1r e / e tirosinase albino animais deficientes ou ratinhos não transgénicos que carecem de melanócitos epidérmicos) não teve nenhum efeito sobre a pele escurecer (Figuras 1B e 2E). Vemos estas experiências como prova de conceito demonstrações de que a manipulação de cAMP na pele pode induzir a pigmentação da pele UV-protetor escuro. No entanto, é improvável que a administração tópica de forscolina é uma opção terapêutica viável ou prático, devido à natureza não específica da droga. Eundiscriminate e ativação não-alvo de ciclases ciclase e indução de cAMP pode ser esperado para causar toxicidade inaceitável. Importante, outros demonstraram que a administração tópica de um inibidor de fosfodiesterase 4 (Rolipram), potentemente sobre-regulada de melanina no modelo animal extensão K14-SCF, provando que a indução de AMPc cutânea e melanização pode ser conseguida por farmacológico alternativo segmentação 35. Claramente, antes da manipulação tópica de níveis de cAMP na pele poderia ser traduzido para uso humano, a sua segurança terá de ser cuidadosamente avaliada. No entanto, os nossos dados sugerem fortemente que a melanização induzida farmacologicamente é UV-protector, tal como determinado por A dose eritematosa mínima (DEM) de teste.
Em resumo, a administração tópica de forscolina, um activador de ciclase de adenililo, resultou numa forte melanização da epiderme de um modelo murino da humano de pele clara, com base na sinalização de cAMP defeituoso para baixofluxo de um defeito de melanocortina 1 receptor (Mc1r). Epidermal melanização era protector anti-UV, tal como medido pela A dose eritematosa mínima (DEM) de teste. Nossa hipótese é que a manipulação farmacológica cAMP pode não só de resgate eumelanization UV-protetora da epiderme, mas outras respostas UV de proteção Mc1r dependentes também.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Os autores agradecem a Malinda Spry para assistência técnica. Agradecemos, ainda, fontes de financiamento atuais e do passado: o Instituto Nacional do Câncer (R01 CA131075, R01 CA131075-02S1), o Will Caso Cancer Research Fund Wendy, a Fundação Markey Câncer, da Criança Miracle Network ea Jennifer e David Dickens Foundation Melanoma Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Coleus Forskoli extract 20% | Buckton Scott USA Inc. | n/a | Princeton, NJ |
| Isothesia, Isoflurane , USP | Butler Schein | NCD 11695-6776-1 | Dublin, OH, USA |
| Xylazine | Anased Injection | LA04612 | Shenandoah, Iowa, USA |
| Ketamine HCl, USP | Putney | NDC 26637-411-01 | St. Joseph, MO, USA |
| Ethanol | Decon Labs. | 2705 | |
| Propylene glycol | Adesco | 05751L | Solon, OH, USA |
| Depilatory cream, Nair | Church Dwight | JF-11 4381322 | Priceton, NJ |
| EQUIPMENT | |||
| Germicidal Hg Lamp UV-B | Westinghouse | F15T8UV-B | |
| Radiometer photometer | International light | 1LT400A | Peabody, MA,USA |
| Chromameter | Konica Minolta | CR-400 | Ramsey, NJ, USA |
| Data Processor for Chromameter CR-400 | Konica Monilta | DR-400 | Ramsey, NJ, USA |
References
- D'Orazio, J. A., et al. Topical drug rescue strategy and skin protection based on the role of Mc1r in UV-induced tanning. Nature. 443, 340-344 (2006).
- Gallagher, R. P., et al. Suntan, sunburn, and pigmentation factors and the frequency of acquired melanocytic nevi in children. Similarities to melanoma: the Vancouver Mole Study. Arch Dermatol. , 126-770 (1990).
- Kraemer, K. H., Lee, M. M., Andrews, A. D., Lambert, W. C. The role of sunlight and DNA repair in melanoma and nonmelanoma skin cancer. The xeroderma pigmentosum paradigm. Arch Dermatol. 130, 1018-1021 (1994).
- Wang, Y., et al. Evidence of ultraviolet type mutations in xeroderma pigmentosum melanomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6279-6284 (2009).
- Pleasance, E. D., et al. A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome. Nature. 463, 191-196 (2009).
- Weinstock, M. A., Fisher, D. E. Indoor ultraviolet tanning: what the data do and do not show regarding risk of melanoma and keratinocyte malignancies. J. Natl. Compr. Canc. Netw. 8, 867-873 (2010).
- Fisher, D. E., James, W. D. Indoor tanning--science, behavior, and policy. N. Engl. J. Med. 363, 901-903 (2010).
- Pfahlberg, A., Kolmel, K. F., Gefeller, O. Timing of excessive ultraviolet radiation and melanoma: epidemiology does not support the existence of a critical period of high susceptibility to solar ultraviolet radiation- induced melanoma. Br. J. Dermatol. 144, 471-475 (2001).
- Lew, R. A., Sober, A. J., Cook, N., Marvell, R., Fitzpatrick, T. B. Sun exposure habits in patients with cutaneous melanoma: a case control study. J. Dermatol. Surg. Oncol. 9, 981-986 (1983).
- Autier, P., Dore, J. F. Influence of sun exposures during childhood and during adulthood on melanoma risk. EPIMEL and EORTC Melanoma Cooperative Group. European Organisation for Research and Treatment of Cancer. Int. J. Cancer. 77, 533-537 (1998).
- Udayakumar, D., Mahato, B., Gabree, M., Tsao, H. Genetic determinants of cutaneous melanoma predisposition. Semin. Cutan. Med. Surg. 29, 190-195 (2010).
- Psaty, E. L., Scope, A., Halpern, A. C., Marghoob, A. A. Defining the patient at high risk for melanoma. Int. J. Dermatol. 49, 362-376 (2010).
- Tucker, M. A.
- Abdel-Malek, Z. A., Knittel, J., Kadekaro, A. L., Swope, V. B., Starner, R. The melanocortin 1 receptor and the UV response of human melanocytes--a shift in paradigm. Photochem. Photobiol. 84, 501-508 (2008).
- Suzuki, I., et al. Participation of the melanocortin-1 receptor in the UV control of pigmentation. J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 4, 29-34 (1999).
- Gibson, G. E., Codd, M. B., Murphy, G. M. Skin type distribution and skin disease in Ireland. Ir. J. Med. Sci. 166, 72-74 (1997).
- Evans, R. D., et al. Risk factors for the development of malignant melanoma--I: Review of case-control studies. J. Dermatol. Surg. Oncol. 14, 393-408 (1988).
- Pack, G. T., Davis, J., Oppenheim, A. The relation of race and complexion to the incidence of moles and melanomas. Ann. N.Y. Acad. Sci. 100, 719-742 (1963).
- Valverde, P., Healy, E., Jackson, I., Rees, J. L., Thody, A. J. Variants of the melanocyte-stimulating hormone receptor gene are associated with red hair and fair skin in humans. Nat. Genet. 11, 328-330 (1995).
- Rees, J. L., Healy, E. Melanocortin receptors, red hair, and skin cancer. J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 2, 94-98 (1997).
- Beaumont, K. A., et al. Melanocortin MC(1) receptor in human genetics and model systems. Eur. J. Pharmacol. 660, 103-110 (2011).
- Palmer, J. S., et al. Melanocortin-1 receptor polymorphisms and risk of melanoma: is the association explained solely by pigmentation phenotype? Am. J. Hum. Genet. 66, 176-186 (2000).
- Haskell-Luevano, C., et al. Compounds that activate the mouse melanocortin-1 receptor identified by screening a small molecule library based upon the beta-turn. J. Med. Chem. 42, 4380-4387 (1999).
- Yamaguchi, Y., Hearing, V. J.
- Eves, P. C., MacNeil, S., Haycock, J. W. alpha-Melanocyte stimulating hormone, inflammation and human melanoma. Peptides. 27, 444-452 (2006).
- Slominski, A., Wortsman, J., Luger, T., Paus, R., Solomon, S. Corticotropin releasing hormone and proopiomelanocortin involvement in the cutaneous response to stress. Physiol. Rev. 80, 979-1020 (2000).
- Slominski, A., Wortsman, J.
- Luger, T. A., et al. Role of epidermal cell-derived alpha-melanocyte stimulating hormone in ultraviolet light mediated local immunosuppression. Ann. N.Y. Acad. Sci. 885, 209-216 (1999).
- Chakraborty, A. K., et al. UV light and MSH receptors. Ann. N.Y. Acad. Sci. 885, 100-116 (1999).
- Cui, R., et al. Central Role of p53 in the Suntan Response and Pathologic Hyperpigmentation. Cell. 128, 853-864 (2007).
- Imokawa, G., Yada, Y., Hori, Y. Induction of melanization within hair bulb melanocytes in chinchilla mutant by melanogenic stimulants. J Invest Dermatol. 91, 106-113 (1988).
- Siegrist, W., et al. Interactions of alpha-melanotropin and agouti on B16 melanoma cells: evidence for inverse agonism of agouti. J. Recept. Signal Transduct Res. 17, 75-98 (1997).
- Abdel-Malek, Z., et al. The melanocortin-1 receptor is a key regulator of human cutaneous pigmentation. Pigment Cell Res. 13, Suppl 8. 156-162 (2000).
- Wood, J. M., Gibbons, N. C., Schallreuter, K. U.
- Khaled, M., Levy, C., Fisher, D. E. Control of melanocyte differentiation by a MITF-PDE4D3 homeostatic circuit. Genes Dev. 24, 2276-2281 (2010).
- Ghiorzo, P., et al. MC1R variation and melanoma risk in relation to host/clinical and environmental factors in CDKN2A positive and negative melanoma patients. Exp. Dermatol. , (2012).
- Cust, A. E., et al. MC1R genotypes and risk of melanoma before age 40 years: a population-based case-control-family study. Int. J. Cancer. 131, E269-E281 (2012).
- Ibarrola-Villava, M., et al. Genetic analysis of three important genes in pigmentation and melanoma susceptibility: CDKN2A, MC1R and HERC2/OCA2. Exp Dermatol. 19, 836-844 (2010).
- Scherer, D., et al. Melanocortin receptor 1 variants and melanoma risk: A study of 2 European populations. Int. J. Cancer. , (2009).
- Hoiom, V., et al. MC1R variation and melanoma risk in the Swedish population in relation to clinical and pathological parameters. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 196-204 (2009).
- Galore-Haskel, G., et al. MC1R variant alleles and malignant melanoma risk in Israel. Eur. J. Cancer. 45, 2015-2022 (2009).
- Sturm, R. A. Skin colour and skin cancer - MC1R, the genetic link. Melanoma Res. 12, 405-416 (2002).
- Kennedy, C., et al. Melanocortin 1 receptor (MC1R) gene variants are associated with an increased risk for cutaneous melanoma which is largely independent of skin type and hair color. J. Invest. Dermatol. 117, 294-300 (2001).
- Box, N. F., et al. MC1R genotype modifies risk of melanoma in families segregating CDKN2A mutations. Am. J. Hum. Genet. 69, 765-773 (2001).
- Rees, J. L. The melanocortin 1 receptor (MC1R): more than just red hair. Pigment Cell Res. 13, 135-140 (2000).
- Valverde, P., et al. The Asp84Glu variant of the melanocortin 1 receptor (MC1R) is associated with melanoma. Hum. Mol. Genet. 5, 1663-1666 (1996).
- Kunisada, T., et al. Transgene expression of steel factor in the basal layer of epidermis promotes survival, proliferation, differentiation and migration of melanocyte precursors. Development. 125, 2915-2923 (1998).
- Vanover, J. C., et al. Stem cell factor rescues tyrosinase expression and pigmentation in discreet anatomic locations in albino mice. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 827-838 (2009).
- Spry, M. L., et al. Prolonged treatment of fair-skinned mice with topical forskolin causes persistent tanning and UV protection. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 219-229 (2009).
- Takayama, H., La Rochelle, W. J., Anver, M., Bockman, D. E., Merlino, G. Scatter factor/hepatocyte growth factor as a regulator of skeletal muscle and neural crest development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 5866-5871 (1996).
- Kunisada, T., et al. Murine cutaneous mastocytosis and epidermal melanocytosis induced by keratinocyte expression of transgenic stem cell factor. J. Exp. Med. , 187-1565 (1998).
- Takeuchi, T., Kobunai, T., Yamamoto, H. Genetic control of signal transduction in mouse melanocytes. J. Invest. Dermatol. 92, 239S-242S (1989).
- Ozeki, H., Ito, S., Wakamatsu, K., Hirobe, T. Chemical characterization of hair melanins in various coat-color mutants of mice. J. Invest. Dermatol. 105, 361-366 (1995).
- Lamoreux, M. L., Wakamatsu, K., Ito, S. Interaction of major coat color gene functions in mice as studied by chemical analysis of eumelanin and pheomelanin. Pigment Cell Res. 14, 23-31 (2001).
- Barbini, P., et al. Instrumental measurement of skin colour and skin type as risk factors for melanoma: a statistical classification procedure. Melanoma Res. 8, 439-447 (1998).
- Takiwaki, H. Measurement of skin color: practical application and theoretical considerations. J. Med. Invest. 44, 121-126 (1998).
- Anderson, R. R., Parrish, J. A.
- Rubegni, P., et al. Relationship between skin color and sun exposure history: a statistical classification approach. Photochem. Photobiol. 65, 347-351 (1997).
- Chen, J., Hammell, D. C., Spry, M., D'Orazio, J. A., Stinchcomb, A. L. In vitro skin diffusion study of pure forskolin versus a forskolin-containing Plectranthus barbatus root extract. J. Nat. Prod. 72, 769-771 (2009).
