Summary
Epidermale melanine wordt geïnduceerd door topische applicatie van forskolin in een muizenmodel van de lichte huid UV-gevoelige mens. Farmacologische manipulatie van cAMP niveaus in de huid en epidermale donkerder sterk tegen UV-gemedieerde inflammatie (zonnebrand) zoals gemeten door de minimale erythemateuze dosis (MED) assay.
Abstract
Eerlijke huid, UV gevoeligheid en het risico van huidkanker alle correleren met de fysiologische functie van de melanocortine receptor 1, een Gs-gekoppelde signalerende proteïne op het oppervlak van melanocyten. MC1R stimuleert adenylylcyclase en cAMP-productie die op zijn beurt op-reguleert melanocyt productie van melanine in de huid. Om de mechanismen die MC1R signalering beschermt de huid tegen UV-schade bestuderen deze studie wordt een muismodel met "gehumaniseerde skin" gebaseerd op epidermale expressie van stamcelfactor (SCF). K14-Scf transgene muizen behouden melanocyten in de epidermis en derhalve de mogelijkheid om melanine deponeren in de epidermis. In dit diermodel, wild type MC1R-status leidt tot robuuste afzetting van zwarte eumelanine pigment en een uv-bescherming fenotype. In tegenstelling, K14-Scf dieren met defecte MC1R signalering vermogen vertonen een rood / blond pigmentatie, heel weinig eumelanine in de huid eneen UV-gevoelige fenotype. Redeneren dat eumelanine afzetting zou kunnen worden versterkt door actuele agenten dat MC1R signalering na te bootsen, vonden we dat directe toepassing van forskolin extract om de huid van MC1R-defecte lichte huid muizen resulteerde in robuuste eumelanine inductie en UV-bescherming 1. Hier beschrijven we de werkwijze voor het bereiden en toepassen van een-forskolin met natuurlijke extract van de wortel naar K14-Scf lichte huid muizen en rapporteren van een methode voor het meten van UV-gevoeligheid door het bepalen van minimale erythemateuze dosis (MED). Met dit diermodel is het mogelijk om te bestuderen hoe epidermale cAMP inductie en melanisatie van de huid beïnvloeden fysiologische reacties op blootstelling aan UV.
Introduction
De incidentie van melanoom, de meest dodelijke vorm van huidkanker, is dramatisch toegenomen in de afgelopen decennia in de Verenigde Staten, met name bij lichte huid individuen. Sterke moleculaire en epidemiologische bewijs impliceert UV-straling als een belangrijke oorzakelijke factor milieu 2-5. Verhoogde UV blootstelling in de vorm van blootstelling aan de zon en zonnebank gebruik waarschijnlijk verantwoordelijk voor veel van de verhogingen van melanoom incidentie 6-7 zijn. Melanoom risico lijkt vooral verbonden met zonnebrand 8, vooral die vroeg in het leven 9-10. Risico van zonnebrand is niet alleen op de dosis en de intensiteit van UV-straling, maar ook door erfelijke factoren die cutane reactie op UV-straling beïnvloeden. Pigmentatie van de huid is een van de belangrijkste determinanten van de UV-gevoeligheid, het risico van zonnebrand en het risico op kanker. Melanoom komt voor ongeveer twintig keer vaker voor bij lichte huid personen in vergelijking met een donkere huidskleur individuatiels 11-13.
Melanine, een pigment geproduceerd door melanocyten in de epidermis, is de belangrijkste determinant van de huid teint. Melanine komt in twee belangrijke soorten: (1) eumelanine, een donkerbruin / zwart pigment effectief in het absorberen van de energie van UV-straling en (2) pheomelanin, een rood / blond pigment minder effectief in het voorkomen penetratie van UV-fotonen in de huid. Huidskleur, UV-gevoeligheid en melanoom risico's worden grotendeels bepaald door de epidermale melanine gehalte 14-15. Hoe meer eumelanine in de epidermis, hoe minder UV fotonen in de huid doordringen. Vanwege de lage aangeboren niveaus van melanine, een lichte huid mensen zijn veel meer vatbaar voor acute en chronische effecten van UV-straling 16-18.
Huidpigmentatie, melanoma's en de mogelijkheid om "tan" na UV-belichting alle correleren met de signalering vermogen van de melanocortine 1 receptor (MC1R), een Gs-gekoppelde zeven transmembraan surface receptor op melanocyten 19-22. Wanneer MC1R bindt zijn verwante hoge affiniteit ligand, α-melanocyt stimulerend hormoon (α-MSH), is de activering van adenylylcyclase en productie van het tweede messenger cAMP 23. De normale fysiologische reactie van de huid na blootstelling aan UV omvat epidermale productie van α-MSH door keratinocyten 24-29. Wij en anderen veronderstellen dat-keratinocyten afgeleide α-MSH bindt aan MC1R op epidermale melanocyten, het initiëren van downstream-productie van de cAMP tweede boodschapper door activatie van adenylylcyclase 30. cAMP niveaus controleren vele aspecten van melanocyten differentiatie, waaronder overleving routes, DNA-reparatie en pigment synthese. MC1R signalering en cAMP duidelijk induceren pigment enzymniveaus en eumelanine productie. Wanneer MC1R signalering is intact en melanocytaire cAMP niveaus zijn robuust, wordt eumelanine geproduceerd en de huid donkerder. Indien MC1R signalering defect encytoplasmatische cAMP niveaus laag blijven, wordt pheomelanin plaats 1 geproduceerd. Eumelanine synthese kan farmacologisch worden gestimuleerd door agenten die cAMP verhogen 1,14,31-35.
Sinds het MC1R-eiwit is een belangrijke regulator van melanoom risico voor de mens 36-46, wij zijn geïnteresseerd in mechanismen waardoor MC1R beschermt melanocyten tegen UV-geïnduceerde carcinogenese. Als basis voor onze studies genereerden wij een transgene MC1R-variant muismodel op een zuivere C57BL / 6 genetische achtergrond 1. In dit model, stamcelfactor (SCF) wordt constitutief tot expressie gebracht in de basale epidermis en interfolliculaire epidermale melanocyten worden vastgehouden in de huid gedurende het leven 47, in tegenstelling tot de niet-transgene muizen waarin melanocyten lokaliseren de dermis in haarfollikels. Met de K14-Scf transgen opgenomen, wordt de epidermis gepigmenteerd met de specifieke melanine pigmenten kenmerk van het pigmentstam van het dier 1. K14-Scf muizen op de C57BL / 6 genetische achtergrond met wild type MC1R signalering hebben gitzwarte huid gekenmerkt door zeer hoge niveaus van melanine pigment. Niet verrassend, deze dieren zijn zeer UV-bestendig. Daarentegen genetisch matched K14-Scf C57BL / 6 dieren met een mutant inactief MC1R ophopen bijna geen melanine in de epidermis. In plaats daarvan, deze "uitbreiding" dieren (MC1R e / e) hebben een lichte huid teint wordt veroorzaakt door afzetting van pheomelanin pigment (Figuur 1A) en zijn veel meer UV-gevoelige 48-49.
Farmacologische verbindingen met chemische eigenschappen die penetratie in de huid mogelijk is aangetoond krachtig eumelanine induceren in de verlenging (MC1R e / e) K14-Scf diermodel door direct manipuleren cAMP niveaus in epidermale melanocyten in de huid. Melanine opregulatie in dit model is r geweesteported van adenylaat cyclase activeren 1 als fosfodiesterase 4 inhibitie 35. In dit artikel tonen we aan de voorbereiding en de actuele toepassing van forskolin in extensie (MC1R e / e) K14-Scf dieren welk model de lichte huid UV-gevoelige mens. We laten zien dat tweemaal daags aanbrengen van het geneesmiddel bevordert de versnelde melanisatie, dat de huid donkerder is te wijten aan epidermale afzetting van melanine pigment en dat veroorzaakte epidermale melanine beschermt tegen UV-geïnduceerde zonnebrand door meting van de "minimale erythemateuze dosis" (MED) 48.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van Forskoline voor topische toediening van een ruwe Root Extract van de Plectranthus barbatus (Cohleus forskohlii) Plant
- Protocollen voor muizen experimenten volgde de richtlijnen voor het ethisch handelen in de zorg en het gebruik van dieren en werden goedgekeurd door het Comite Institutional Animal Care en gebruik aan de Universiteit van Kentucky (Protocol # 00768M2004). De wortel extract bestaat 40% gewicht / volume in een standaard dermatologische basis van 70% ethanol, 30% propyleenglycol.
- Weeg 200 g ruwe forskolin wortel extract en overbrengen naar een beker. Aan 500 ml van een 40% (w / v) oplossing, mengen 200 g ruw forskoline wortel extract door toevoeging meeste maar niet alle van het volume van het voertuig (70% ethanol, 30% propyleenglycol) en brengen de oplossing ongeveer 450 ml.
- Roer gedurende een uur bij kamertemperatuur geroerd. De oplossing zal enigszins viskeus zijn en kan met de hand agitatie vereisen om "lift" het extract in de oplossing voorhet roerstaafje in staat is om over te nemen.
- Na een uur roeren, giet het mengsel in een maatcilinder en breng het volume op 500 ml met een voertuig dat is gebruikt om "spoelen" het bekerglas dat werd gebruikt om de suspensie te roeren (tot herstel van forskoline uit de beker te maximaliseren) .
- Breng de massa tot 50 ml polypropyleen centrifugebuis. Centrifuge (1500 xg, kamertemperatuur, 15 min.) met een tafelblad centrifuge. Op dit punt zal het onoplosbare materiaal vrij verdicht, waardoor de supernatant gemakkelijk worden afgegoten.
- Filtreer de oplossing door een 0,22 micrometer celluloseacetaat membraan achtergebleven onoplosbaar materiaal uit het extract te verwijderen. We gebruiken een fles-systeem is ontworpen voor celkweek, samen met het gebruik van pre-filters die bij het apparaat om voortijdige verstopping van het membraan van onoplosbare bestanddelen van de wortel extract te voorkomen. Bij het maken van grote hoeveelheden van het extract, filteren ongeveer 100 ml per keer, verandert het voorfilter between elke extra volume.
- Wanneer bewaard bij kamertemperatuur, het extract onderhoudt biologische activiteit tot maximaal een jaar.
2. Voorbereiding van C57Bl / 6 K14-Scf muizen voor lokale behandelingen
- Verwijder dorsale bont van de dieren door een elektrische scheren. Kort verdoven de dieren met inhalatie isofluraan afschuiven van dorsale bont met elektrische scharen uitgerust met een 0,25 mm chirurgische voorbereidende hoofd (Fisher Scientific) te vergemakkelijken. Bij voorkeur alleen gebruik maken van een vorm van anesthesie (bijv. ketamine / xylazine) om het risico van een overdosis verdovingsmiddel te minimaliseren. De verzadigde inhalatiekamer draagt arbeidsrisico's bij gebruik buiten een zuurkast en levert onbekende hoeveelheden verdoving dieren. Idealiter een precisie vaporizer worden gebruikt.
- Om de resterende haren stoppels te verwijderen, te laten verzorgen met een chemische ontharingscrème. Dien anesthesie het dier met een ip injectie van ketamine 40 mg / kg en xylazine 4 mg / kg Zodra dieren afdoende worden verdoofd (zoals beoordeeld door teen knijpen), breng dan een vingertop kleine hoeveelheid van ontharingscrème aan geschoren dorsale huid met een gehandschoende vinger. Wrijf de crème in de huid gedurende 30-60 seconden of totdat haren duidelijk zichtbaar in de room als deze wordt verplaatst. Laat de crème op alleen voor de minimale tijd die nodig is voor ontharing als langdurige blootstelling leidt tot chemische verbranding van de huid, afbraak epidermale en de dood van het verlies van epidermale integriteit.
- Veeg de dorsale huid met water doordrenkte gaasjes totdat alle ijs is verwijderd. Droge dieren met behulp van zachte papieren handdoeken, en hen in staat stellen om te herstellen in een warme afgelegen locatie (bijvoorbeeld schone kooien geplaatst op een warming pad). Ontharen de dieren een voor een en op de voet tijdens de gehele procedure.
3. Lokale toediening van Forskoline of Vehicle Control
- Dieren dient dit te worden behandeld tegelijk. Kort verdoven met inhalerend isofluraan door het plaatsen van de muis op een vorm uitgerust nylonfilter luchtdoorlatende grond waarvan is geplaatst een-isofluraan verzadigde papieren handdoek in een-isofluraan verzadigde lidded helder glazen pot in een zuurkast. Expose de muis om isofluraan gedurende een voldoende tijd om vrijwillige spierbewegingen te onderdrukken, maar om spontane ademhaling (meestal 10-20 sec) te behouden. Het verlaten van het dier in isofluraan te lang zal leiden tot respiratoire onderdrukking en dood. Het is beter om het zekere voor de kant van "going light" met kort opnieuw bloot de muis om meer isofluraan dan overbelicht het dier aan de drug en het risico dood.
- Verwijder het dier uit de isofluraan kamer en op een schone absorberende bankje pad.
- Met behulp van een 1000 ui micropipet uitgerust met een wegwerp polypropyleen tip, stellen 400 ul van 40% ruwe forskolin extract (voertuigbeheersing dieren zullen 70% ethanol, 30% propyleenglycol alleen ontvangen).
- Breng het extract op derug van het dier te druppelen zij op de huid en dan via de zijkant van de pipetpunt, smeer het extract via dorsale huid tot alle huid bedekt. Het is niet nodig om de huid na aanbrengen blot.
- De terugkeer van de muis naar zijn kooi, en zorgvuldig te observeren totdat hij herstelt van anesthesie.
- Om te voorkomen dat niet-pigment cAMP effecten niet UV gevoeligheid experimenten moeten beschamen, staken alle actuele behandelingen 2 dagen voor UV blootstelling (pigment effect duurt enkele dagen na de laatste lokale behandeling).
4. Skin Kleurmeet door Reflecterende Colorimetry
- Kort verdoven de muis met geïnhaleerde isofluraan (zie hierboven).
- Kalibreer een Minolta colorimeter door het plaatsen van de draagbare hoofd op de gestandaardiseerde witte oppervlak voorzien van de colorimeter.
- Plaats de draagbare meetkop van de colorimeter gelijk met de dorsale huid van het dier te zorgen dat de 1 cm 2 ronde aperture volledig gedrukt op de huid. Neem ten minste drie afzonderlijke metingen in verschillende gebieden van de dorsale huid.
- Bereken de gemiddelde L * score ± SD per dier en per behandelingsgroep. Reflecterende colorimetrie kan gedaan worden op elk punt in het experiment.
5. Bepaling van de UV gevoeligheid door Berekening van "Minimal Erythemateuze Dose" (MED)
- Gebruik dieren die zijn voorbehandeld met ofwel drager of forskoline zoals hierboven beschreven. Verdoven dieren intraperitoneale injectie van een standaardmengsel van ketamine en xylazine (zie hierboven).
- Bereid een stuk UV-occlusieve tape voor MED testen. Om gaten in de tape te genereren, gebruik dan een heavy-duty perforator met een 1 cm 2 cirkelvormige uitsparing (figuren 2A en B). Met gaten van een bepaalde grootte en symmetrische opstelling van de band vergemakkelijkt erkenning van veranderingen van de huid na bestraling. Over elk gat in de band, met een klein maar gemakkelijk afneembaar stuk van tape die op bepaalde tijden kunnen worden verwijderd tijdens UV-blootstelling aan de toediening van verschillende doses UV toestaan.
- Zodra de dieren voldoende worden verdoofd, plaats de tape op de rugzijde. Oogzalf moeten altijd worden gebruikt onder narcose.
- Schakel de UV-bron bestaat uit twee Westinghouse F15T8UV-B lampen met een piekvermogen van 313 nm en een reeks 280-370 nm. Laat de lamp in evenwicht om een constante UV-uitgang, zoals gemeten door een UV-fotometer met een UVB-sensor (duurt meestal een paar minuten voor de lampen op te warmen).
- Op basis van de UV transmissiesnelheid zoals gemeten door de UV-fotometer Bereken UV belichtingstijd voor elke gewenste dosis. Bijvoorbeeld, UVB outputmaatregelen onze lamp 2,4 mW / cm 2. Daarom, om 5 kJ / m 2 dienen, zou de huid moeten worden blootgesteld aan 208 sec (die 3 min en 28 sec) UVB straling, zoals hieronder berekend:
upload/50670/50670eq1.jpg "/> - Plaats verdoofde dieren (elk met occlusieve tape op zijn plaats) buikoppervlakte beneden om zelfs UV-blootstelling te garanderen. Om de gekozen doses van UV-straling toe te dienen, achtereenvolgens verwijder de kleine occlusieve tapes die de gaten om 1 cm 2 gebieden van de huid bloot te stellen aan de juiste doses straling. Daarom worden bij het bovenstaande voorbeeld, als 40 kJ / m 2 de grootste dosis in het experiment, dan zou het dier onder de lamp voor 27 min en 47 sec totaal en de huid in de 40 kJ / m 2 staat zouden niet moeten bovenliggende tape de hele tijd. Toch zou tape bovenop de 5 kJ / m 2 toestand worden verwijderd wanneer er 208 seconden nog in de belichting. Timing van de tape verwijderen moet worden gedaan, zodat elke voorwaarde eindigt tegelijk.
- Na blootstelling aan UV, haal de tape van de dorsale huid zorgvuldig, zorg ervoor dat u de huid met plotselinge of overdreven krachtige bewegingen rippen. Plaats dieren in een warme rustige plek omherstel van anesthesie.
- Monitor muizen gedurende 24-48 uur te zoeken discrete gebieden van erytheem (roodheid) en oedeem (zwelling) overeenkomend met de anatomische gebieden blootgesteld aan de specifieke dosis UV bestraling. Documenteer huid bevindingen fotografisch.
- MED correspondeert met de minimale dosis UV die de ontsteking veroorzaakt zoals gedefinieerd door erytheem en / of oedeem van de gehele cirkel blootgestelde huid. Merk op dat pigmentatie van de huid kunnen uitdagen bepaling van MED, echter, erytheem en oedeem kan nog steeds over het algemeen nauwkeurig worden geëvalueerd, mede dankzij de gedefinieerde vorm van de openingen in de band tijdens blootstelling aan UV.
6. Statistische analyse
Analyseren van gegevens tussen cohorten van muizen door een weg ANOVA met Bonferroni na de test (Graph Pad PRISM). P-waarden <0,05 worden beschouwd als statistisch significant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C57BL / 6 muizen werden gegenereerd op eumelanotic, pheomelanotic of amelanotisch achtergronden waarin de K14-Scf transgen beschreven (Figuur 1A). Cohorten van lichte huid extensie (MC1R e / e, Tyr + / +) werden muizen die lokaal werden behandeld met tweemaal daags doses van het voertuig (70% ethanol, 30% propyleenglycol) of 40% ruwe Coleus forskohlii wortel extract (80 micrometer per dosis) gedurende 5 dagen (Figuur 2B). Effecten van actuele behandelingen op epidermale pigmentatie werden zowel bepaald door visuele inspectie en door reflecterende colorimetrie (Figuur 1B). Toepassing van de wortel extract werd geassocieerd met robuuste epidermale verduistering in de K14-Scf transgene achtergrond, maar niet in genetisch geëvenaard niet-transgene dieren. Wij interpreteren deze resultaten aan te geven dat interfolliculaire epidermale melanocyten aanwezig in orde moet zijn voor farmacologisch geïnduceerde melanine te worden gedeponeerd in de epidemiologischeRMIS. Hoewel het wortelextract diep gekleurd door de plantenextracten fytochemicaliën naast forskoline, kan de huid donkerder niet alleen te wijten aan een verven ingang van het geneesmiddel, als niet-transgene dieren niet huid donkerder de wortel extract (Figuur 1B) vertonen. Wanneer toegepast tweemaal daags wijze melanizing effecten van lokaal toegediende forskoline kan worden opgemerkt in slechts 2 dagen, maar maximale donkerder wordt gerealiseerd na enkele dagen (figuur 1C). Mate van melanisatie is dosisafhankelijk, zoals blijkt uit Fontana-Masson melanine kleuring van dorsale huid delen behandeld met verschillende concentraties van het geneesmiddel (figuur 1D).
Vervolgens, het effect van lokaal toegediende forskoline op UV-gevoeligheid werd bepaald door MED testen in muizen extensie (MC1R e / e, Tyr + / +) zoals hierboven beschreven (Figuren 2 A en B). MED bepaling werd vergeleken tussen aniMals behandeld met een versnelde behandeling met geneesmiddelen (tweemaal per dag toediening gedurende 5 dagen, in totaal 10 doses) ten opzichte van een standaard aanpak (eenmaal daagse toediening gedurende 15 dagen, 15 in totaal doses). Niet-transgene muizen werden opgenomen om te controleren voor niet-melanine drug effecten. Beide behandelingen resulteerden in vergelijkbare bedragen van de huid donkerder in-forskolin behandeld K14-Scf dieren. Specifiek, L * (reflecterend colorimetrie wit-zwart schaal) waarden voor-forskolin blootgestelde dieren waren 31,9 ± 1,8 en 31,1 ± 1,6 voor versnelde toepassing versus standaard applicatie, respectievelijk. Er waren geen duidelijke toxische effecten van forskoline exposure in beide behandelingsgroepen dus geconcludeerd dat versnelde forskoline toediening (tweemaal per dag gedurende 10 totale dosis, 80 uM per dosis) bevorderd veilig melanisatie van de dorsale huid effectief dat voorheen (eenmaal daags gedurende 15 totale dosis, 80 uM per dosis).
Forskoline geïnduceerde epidermale melanisatie geleiddiepe UV-bescherming zoals beoordeeld door MED (Figuren 2C-D). Terwijl dus betekenen MED voor K14-Scf uitbreiding muizen behandeld voor tweemaal voor 5 dagen met het voertuig was 5.0 ± 0.0 kJ / m 2, gemiddelde MED voor cohorten behandeld met lokale forskolin was> 30.0 ± 0.0 kJ / m 2 (figuren 2 A en C). In feite, een dosis van 30,0 kJ / m 2 onvoldoende om erytheem genereren was in dit experiment. Met behulp van standaard forskoline dosering (eenmaal daags gedurende 15 totale dosis, 80 uM per dosis), vonden we dat de gemiddelde MED K14-Scf verlenging muizen behandeld met forskoline was 50,0 ± 7,1 kJ / m 2 (figuur 2 B, D). Belangrijk heeft forskoline voorbehandeling laat MED dieren niet in staat melanisatie, hetzij vanwege onvoldoende K14-Scf gemedieerde epidermale melanocyten (figuren 2C, D) of door tyrosinase deficiëntie (Figuur 2E). Sinds forskolin toepassingen waren disvervolg 2 dagen voorafgaand aan UV-blootstelling en werden na blootstelling aan UV niet voortgezet, concluderen we dat de niet-pigmentair cAMP effecten een rol speelde in MED resultaten. Integendeel, de gegevens suggereren dat epidermale melanisatie was het mechanisme waardoor forskoline geïnduceerde UV bescherming in dit model.
Figuur 1. Lokale behandeling van forskolin bevordert huid donkerder in lichte huid extensie (MC1R e / e) muizen. (A) Foto's van C57BL / 6 dieren gebruikt in deze studie. Dieren zijn genetisch afgestemd behalve bij de melanocortin 1 receptor (MC1R) en tyrosinase (Tyr) loci. Let pigmentatie eumelanotic (zwart) als MC1R functioneel maar pheomelanotic (blondish) wanneer MC1R defect, zoals het geval is met deextensie (MC1R e / e) mutant. Epidermale pigmentatie afhankelijk behoud van interfolliculaire epidermale melanocyten in de huid door de K14-Scf transgen en kan gemakkelijk worden gezien in de oren. (B) Foto van verlenging (MC1R e / e) K14-Scf of niet-transgene dieren behandeld met 400 gl mediumcontrole (70% ethanol 30% propyl glycol) of 40% w / v (80 uM) forskoline tweemaal daags aangebracht op het geschoren dorsale huid gedurende 5 dagen, in totaal 10 aanvragen. Huidskleur metingen door reflecterende colorimetrie werden uitgevoerd voor elke groep. Reflecterende colorimetrie resultaten worden vermeld als gemiddelde (± SD) reflectometrie grondstoffen om het L * (zwart-wit) zwaartepunte. Merk op dat lokale toediening van forskolin veroorzaakt robuuste huid donkerder in, maar niet in niet-transgene muizen K14-Scf transgene dieren. (C) Tijd natuurlijk experiment toont donker worden van de forskolin behandelde oor van K14-Scfverlenging muizen voor de aangegeven tijdstippen (forskoline behandelde oren aangegeven door de blauwe driehoeken). Voertuig werd aangebracht op het rechteroor voor vergelijking. (D) Fontana-Masson gekleurde achtergrond doorsneden van dieren behandeld met de aangegeven doseringen van forskoline beschreven. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 2. Forskolin geïnduceerde melanisatie beschermt tegen UV-gemedieerde ontsteking zoals bepaald door minimale erythemateuze dosis (MED) testen. (A, B) Positie van UV occlusieve tape en UVB dosis dieren behandeld tweemaal daags gedurende 5 dagen (A, C) of eenmaal daags gedurende 15 dagen (B, D, E) met ofwel drager of forskoline. Th e laatste plaatselijke behandeling werd toegepast 48 uur voorafgaand aan de bestraling. Dorsale huid werd blootgesteld aan verschillende doses UVB door middel van UV-occlusieve tape met uitgeponste 1 cm 2 ronde openingen, en verschillende belichtingstijden om de juiste dosis te leveren. Na bestraling werden kringen van de blootgestelde huid gelabeld met een pen in een aantal experimenten. MED's, gedefinieerd door erytheem en / of oedeem van de hele cirkel van de blootgestelde huid om een bepaalde dosis, werden bepaald 48 uur na blootstelling. De MED ± SD resultaten worden gerapporteerd als kJ / m 2 UVB, * p ≤ 0,001. (E) Huidskleur reflectometrie en MED waarden voor tyrosine-deficiënte K14-Scf albino uitbreiding muizen behandeld gedurende 10 dagen met een voertuig of forskoline. Klik hier om bekijk groter figuur .
70fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50670/50670fig3.jpg "/>
Figuur 3. Algemeen schema van het experiment. Cohorten extensie (MC1R e / e) K14-Scf of niet-transgene dieren werden bereid door verwijdering van de dorsale vacht van elektrische snijden en / of chemische ontharing. Dieren werden vervolgens met topische toepassingen van hetzij vehikel (70% ethanol, 30% propyleenglycol) of met 40% forskoline ruw extract behandeld door de doseringsschema's aangegeven. Effecten op de huid pigmentatie werden fotografisch gedocumenteerd, colorimetrisch en door Fontana-Masson melanine kleuring. UV-gevoeligheid werd bepaald door minimale erythemateuze dosis (MED) testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met behulp van een diermodel van de lichte huid van de mens, vinden we dat de actuele toepassing van een forskolin rijk ruw extract van de wortel stevig donkerder de opperhuid door het stimuleren van de productie van melanine in de huid. Epidermale melanisatie is afhankelijk van de expressie van stamcel factor in de basale epidermis, zoals bij humane huid, maar niet in genetisch gemodificeerde muizen huid. De dorsale huid van genetisch gemodificeerde muizen onvoldoende aantallen interfolliculaire melanocyten pigment geven aan de huid. Slechts in de vaststelling van constitutieve expressie van een melanocyt groeifactor zoals stamcelfactor (kit ligand) of hepatocyt groeifactor (HGF) kan melanocyten worden vastgehouden in de basale laag van de epidermis gedurende de levensduur van het dier 50-51. Onze diermodel van de beurs gevild menselijke is gebaseerd op integratie van de K14-Scf transgen in de uitbreiding pigment variant van de C57BL / 6 muizen lijn. Hoewel de dieren van elke leeftijd kan wordengebruikt, onze experimenten betrekken meestal jonge volwassenen (4-12 weken oud) muizen. Door een afgeknotte melanocortine 1 receptor (MC1R) die leidt tot verlies van cAMP-signalering, uitbreiding muizen brengen pheomelanin voorkeur in de vacht en de huid (in het K14-Scf of HGF-Met transgene land) in plaats van eumelanine 52-54. Als gevolg van veranderde expressie melanine, K14-Scf verlenging muizen veel UV-gevoeliger dan hun MC1R-wildtype tegenhangers, die gitzwarte huid vanwege overvloedige afzetting van epidermale melanine pigment 1. We redeneerden dat sinds eumelanine productie is sterk afgenomen in de setting van een mutant MC1R, dat farmacologische stimulerende middelen die MC1R signalering nabootsen eumelanine productie zou kunnen redden. MC1R is een Gs-gekoppelde transmembraan receptor die, na binding van de hoge affiniteit ligand α-melanocyt stimulerend hormoon (α-MSH), zendt pro-differentiatie signalen naar de melanocyte cytoplasma via adenylylcyclase activering en de productie van de second messenger cAMP. Zo hebben we de hypothese dat topische applicatie van forskolin, een cel-permeabel diterpenoïde dat is een krachtige directe activator van adenylylcyclase, zou kunnen eumelanine productie te bevorderen in het MC1R-defect is, pheomelanotic staat.
Met gebruikmaking van zuivere forskoline voor deze studies, bleek echter te duur is. Vroege experimenten bepalen de minimale hoeveelheid forskoline die voor epidermale verduistering in de K14-Scf extensiemodel voorgesteld maximale verduistering opgetreden bij het gebruik van een 40 gew% per volume oplossing met ruw extract dat 20% bevatte (gewicht per gewicht) van forskoline. We berekenen dat de toepassing van 400 ul van een 8% uiteindelijke forskoline (gewicht per volume, 40% x 20%) oplossing zou leiden tot het leveren van ongeveer 80 uM forskoline op de dorsale huid elke toepassing. Natuurlijk, veel van de afgegeven dosiswordt niet geabsorbeerd door de huid, in plaats daarvan wordt opgezogen door omliggende bont of vallen van het dier op het moment van de aanvraag. Zo is het moeilijk de exacte gerealiseerde dosis die de dieren ontvangen bij elke toepassing van het geneesmiddel geven. Niettemin, wanneer toegepast op deze wijze forskoline resulteert in robuuste inductie van pigment enzymen in de huid en de productie van melanine. In feite, K14-Scf transgene uitbreiding dieren toonden duidelijk donkerder worden van de huid na de tweede aanvraag (figuur 1C).
Hoewel we eerder gepubliceerd huid donkerder met dagelijkse toepassing van het geneesmiddel 1,48-49, hier laten we tweemaal daags aanbrengen geassocieerd met robuuste epidermale donkerder en belangrijke UV-bescherming, wat suggereert dat farmacologische geïnduceerde melanisatie kan worden geoptimaliseerd door toediening van de drug vaker dan een keer per dag. Huid donkerder, die het gevolg eumelanine inductie in de epidermis, duurt alsZolang actuele forskolin behandelingen worden voortgezet. Zelfs chronische toepassing (door middel van drie maanden) leek goed verdragen door de muizen 49. De toename huid donkerder is door melanine synthese in plaats proliferatie van melanocyten in de epidermis. 49. Zodra actuele behandelingen worden gestaakt, de huid vervaagt geleidelijk terug naar zijn uitgangswaarde blanke huid (meer dan 2-3 weken) als epidermale melanine wordt verloren met normale keratinocyten vernieuwing. Donker worden van de huid kan gemakkelijk worden bepaald door eenvoudige visuele inspectie van de muizen echter huidskleur objectief worden gekwantificeerd middels reflecterende colorimetrie 55-56. Deze methode is een niet-invasieve snelle en pijnloze werkwijze voor het meten huidskleur. Kleur kan worden nauwkeurig beschreven met behulp van de L * a * b * (LAB) kleurruimte model 57-58.
Voor deze experimenten vertrouwden we op een ruw extract van de wortel van de Coleus forskolii plant, de natuurlijke bron van forskolin. Deze voorbereidingwerd gebruikt vanwege de hoge kosten van het uitvoeren van deze experimenten met gezuiverde forskoline. Dit experiment, bijvoorbeeld, vereist ongeveer 2 g forskoline totaal voor tweemaal daags aanbrengen zes dieren voor vijf dagen. 2 g van commercieel beschikbare HPLC gezuiverd forskoline zou kosten meer dan $ 20.000, in vergelijking met minder dan $ 5 voor het ruwe extract. Hoewel gezuiverd forskolin geïnduceerde epidermale melanine in onze dierlijke model 1, kunnen we niet uitsluiten dat eventuele effecten van andere plantaardige stoffen in de ruwe wortel extract waaronder alkaloïden, fenolen en tannines. In feite, alvorens het werk met behulp van cavia of menselijke huid explantaten gesuggereerd dat verbindingen in de ruwe wortel extract cutane absorptie van forskolin 59 kunnen bevorderen. Vooralsnog echter de identiteit en het mechanisme van deze verbindingen steeds onbekend. Zo kunnen we niet uitsluiten dat het wijzigen van effecten van andere verbindingen van nature aanwezig in de ruwe wortel extract.
Het samengestelde mengsel wordt forskolineeen donkerbruine vloeistof met een aantrekkelijke specerij-achtige geur die gemakkelijk wordt aangebracht op de huid voor topicale toepassing. Omdat de onoplosbare materialen zijn verwijderd, dagelijkse toepassing laat geen korstvorming of deposito eenmaal geabsorbeerd door de huid. Hoewel het ruwe wortelextract donkerbruin wanneer op deze wijze bereid, huid donkerder veroorzaakt door het geneesmiddel niet slechts een kleurstof effect, zoals blijkt uit dat topische applicatie van de samenstelling op dieren in staat skin melanisatie (bijv. MC1R e / e tyrosinase albino-deficiënte dieren of niet-transgene muizen die epidermale melanocyten ontbreken) had geen effect op de huid donkerder (figuren 1B en 2E). Wij zien deze experimenten als proof-of-concept demonstraties die manipulatie van cAMP in de huid UV-beschermende donkere pigmentatie van de huid kan veroorzaken. Het is echter onwaarschijnlijk dat topische toediening van forskoline is een haalbare of de therapeutische optie vanwege de niet-specifieke aard van het geneesmiddel. Ikndiscriminate en ongerichte activering van adenylyl cyclases en inductie van cAMP te verwachten onaanvaardbare toxiciteit veroorzaken. Belangrijk anderen hebben aangetoond dat topische toediening van een fosfodiesterase 4 inhibitor (Rolipram), krachtig opwaarts gereguleerd melanine in de K14-Scf verlenging diermodel, waaruit blijkt dat cutane cAMP inductie en melanisatie kan worden bereikt met alternatieve farmacologische richten 35. Het is duidelijk dat, vóór actueel manipulatie van cAMP niveaus in de huid kan worden vertaald voor menselijk gebruik, zal de veiligheid moeten zorgvuldig worden beoordeeld. Niettemin, onze gegevens wijzen erop dat de farmacologisch geïnduceerde melanisatie is UV-beschermende zoals bepaald door minimale erythemateuze dosis (MED) testen.
Samengevat, lokale toediening van forskolin, een adenylylcyclase activator, resulteerde in een sterke melanisatie van de opperhuid van een muismodel van de beurs gevild menselijke gebaseerd op gebrekkige cAMP signalering omlaagstroom van een defecte melanocortine 1 receptor (MC1R). Epidermale melanisatie werd UV-beschermend, gemeten minimale erythemateuze dosis (MED) testen. Onze hypothese is dat farmacologische cAMP manipulatie kan niet alleen redding UV-beschermende eumelanization van de opperhuid, maar ook andere MC1R-afhankelijke UV-beschermende reacties ook.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs willen Malinda Spry bedanken voor technische bijstand. Wij huidige en vroegere financieringsbronnen erkennen ook: de National Cancer Institute (R01 CA131075, R01 CA131075-02S1), het Wendy Will zaak Kanker Onderzoek Fonds, de Markey Cancer Foundation, de Children's Miracle Network en de Jennifer en David Dickens Melanoma Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Coleus Forskoli extract 20% | Buckton Scott USA Inc. | n/a | Princeton, NJ |
| Isothesia, Isoflurane , USP | Butler Schein | NCD 11695-6776-1 | Dublin, OH, USA |
| Xylazine | Anased Injection | LA04612 | Shenandoah, Iowa, USA |
| Ketamine HCl, USP | Putney | NDC 26637-411-01 | St. Joseph, MO, USA |
| Ethanol | Decon Labs. | 2705 | |
| Propylene glycol | Adesco | 05751L | Solon, OH, USA |
| Depilatory cream, Nair | Church Dwight | JF-11 4381322 | Priceton, NJ |
| EQUIPMENT | |||
| Germicidal Hg Lamp UV-B | Westinghouse | F15T8UV-B | |
| Radiometer photometer | International light | 1LT400A | Peabody, MA,USA |
| Chromameter | Konica Minolta | CR-400 | Ramsey, NJ, USA |
| Data Processor for Chromameter CR-400 | Konica Monilta | DR-400 | Ramsey, NJ, USA |
References
- D'Orazio, J. A., et al. Topical drug rescue strategy and skin protection based on the role of Mc1r in UV-induced tanning. Nature. 443, 340-344 (2006).
- Gallagher, R. P., et al. Suntan, sunburn, and pigmentation factors and the frequency of acquired melanocytic nevi in children. Similarities to melanoma: the Vancouver Mole Study. Arch Dermatol. , 126-770 (1990).
- Kraemer, K. H., Lee, M. M., Andrews, A. D., Lambert, W. C. The role of sunlight and DNA repair in melanoma and nonmelanoma skin cancer. The xeroderma pigmentosum paradigm. Arch Dermatol. 130, 1018-1021 (1994).
- Wang, Y., et al. Evidence of ultraviolet type mutations in xeroderma pigmentosum melanomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6279-6284 (2009).
- Pleasance, E. D., et al. A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome. Nature. 463, 191-196 (2009).
- Weinstock, M. A., Fisher, D. E. Indoor ultraviolet tanning: what the data do and do not show regarding risk of melanoma and keratinocyte malignancies. J. Natl. Compr. Canc. Netw. 8, 867-873 (2010).
- Fisher, D. E., James, W. D. Indoor tanning--science, behavior, and policy. N. Engl. J. Med. 363, 901-903 (2010).
- Pfahlberg, A., Kolmel, K. F., Gefeller, O. Timing of excessive ultraviolet radiation and melanoma: epidemiology does not support the existence of a critical period of high susceptibility to solar ultraviolet radiation- induced melanoma. Br. J. Dermatol. 144, 471-475 (2001).
- Lew, R. A., Sober, A. J., Cook, N., Marvell, R., Fitzpatrick, T. B. Sun exposure habits in patients with cutaneous melanoma: a case control study. J. Dermatol. Surg. Oncol. 9, 981-986 (1983).
- Autier, P., Dore, J. F. Influence of sun exposures during childhood and during adulthood on melanoma risk. EPIMEL and EORTC Melanoma Cooperative Group. European Organisation for Research and Treatment of Cancer. Int. J. Cancer. 77, 533-537 (1998).
- Udayakumar, D., Mahato, B., Gabree, M., Tsao, H. Genetic determinants of cutaneous melanoma predisposition. Semin. Cutan. Med. Surg. 29, 190-195 (2010).
- Psaty, E. L., Scope, A., Halpern, A. C., Marghoob, A. A. Defining the patient at high risk for melanoma. Int. J. Dermatol. 49, 362-376 (2010).
- Tucker, M. A.
- Abdel-Malek, Z. A., Knittel, J., Kadekaro, A. L., Swope, V. B., Starner, R. The melanocortin 1 receptor and the UV response of human melanocytes--a shift in paradigm. Photochem. Photobiol. 84, 501-508 (2008).
- Suzuki, I., et al. Participation of the melanocortin-1 receptor in the UV control of pigmentation. J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 4, 29-34 (1999).
- Gibson, G. E., Codd, M. B., Murphy, G. M. Skin type distribution and skin disease in Ireland. Ir. J. Med. Sci. 166, 72-74 (1997).
- Evans, R. D., et al. Risk factors for the development of malignant melanoma--I: Review of case-control studies. J. Dermatol. Surg. Oncol. 14, 393-408 (1988).
- Pack, G. T., Davis, J., Oppenheim, A. The relation of race and complexion to the incidence of moles and melanomas. Ann. N.Y. Acad. Sci. 100, 719-742 (1963).
- Valverde, P., Healy, E., Jackson, I., Rees, J. L., Thody, A. J. Variants of the melanocyte-stimulating hormone receptor gene are associated with red hair and fair skin in humans. Nat. Genet. 11, 328-330 (1995).
- Rees, J. L., Healy, E. Melanocortin receptors, red hair, and skin cancer. J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 2, 94-98 (1997).
- Beaumont, K. A., et al. Melanocortin MC(1) receptor in human genetics and model systems. Eur. J. Pharmacol. 660, 103-110 (2011).
- Palmer, J. S., et al. Melanocortin-1 receptor polymorphisms and risk of melanoma: is the association explained solely by pigmentation phenotype? Am. J. Hum. Genet. 66, 176-186 (2000).
- Haskell-Luevano, C., et al. Compounds that activate the mouse melanocortin-1 receptor identified by screening a small molecule library based upon the beta-turn. J. Med. Chem. 42, 4380-4387 (1999).
- Yamaguchi, Y., Hearing, V. J.
- Eves, P. C., MacNeil, S., Haycock, J. W. alpha-Melanocyte stimulating hormone, inflammation and human melanoma. Peptides. 27, 444-452 (2006).
- Slominski, A., Wortsman, J., Luger, T., Paus, R., Solomon, S. Corticotropin releasing hormone and proopiomelanocortin involvement in the cutaneous response to stress. Physiol. Rev. 80, 979-1020 (2000).
- Slominski, A., Wortsman, J.
- Luger, T. A., et al. Role of epidermal cell-derived alpha-melanocyte stimulating hormone in ultraviolet light mediated local immunosuppression. Ann. N.Y. Acad. Sci. 885, 209-216 (1999).
- Chakraborty, A. K., et al. UV light and MSH receptors. Ann. N.Y. Acad. Sci. 885, 100-116 (1999).
- Cui, R., et al. Central Role of p53 in the Suntan Response and Pathologic Hyperpigmentation. Cell. 128, 853-864 (2007).
- Imokawa, G., Yada, Y., Hori, Y. Induction of melanization within hair bulb melanocytes in chinchilla mutant by melanogenic stimulants. J Invest Dermatol. 91, 106-113 (1988).
- Siegrist, W., et al. Interactions of alpha-melanotropin and agouti on B16 melanoma cells: evidence for inverse agonism of agouti. J. Recept. Signal Transduct Res. 17, 75-98 (1997).
- Abdel-Malek, Z., et al. The melanocortin-1 receptor is a key regulator of human cutaneous pigmentation. Pigment Cell Res. 13, Suppl 8. 156-162 (2000).
- Wood, J. M., Gibbons, N. C., Schallreuter, K. U.
- Khaled, M., Levy, C., Fisher, D. E. Control of melanocyte differentiation by a MITF-PDE4D3 homeostatic circuit. Genes Dev. 24, 2276-2281 (2010).
- Ghiorzo, P., et al. MC1R variation and melanoma risk in relation to host/clinical and environmental factors in CDKN2A positive and negative melanoma patients. Exp. Dermatol. , (2012).
- Cust, A. E., et al. MC1R genotypes and risk of melanoma before age 40 years: a population-based case-control-family study. Int. J. Cancer. 131, E269-E281 (2012).
- Ibarrola-Villava, M., et al. Genetic analysis of three important genes in pigmentation and melanoma susceptibility: CDKN2A, MC1R and HERC2/OCA2. Exp Dermatol. 19, 836-844 (2010).
- Scherer, D., et al. Melanocortin receptor 1 variants and melanoma risk: A study of 2 European populations. Int. J. Cancer. , (2009).
- Hoiom, V., et al. MC1R variation and melanoma risk in the Swedish population in relation to clinical and pathological parameters. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 196-204 (2009).
- Galore-Haskel, G., et al. MC1R variant alleles and malignant melanoma risk in Israel. Eur. J. Cancer. 45, 2015-2022 (2009).
- Sturm, R. A. Skin colour and skin cancer - MC1R, the genetic link. Melanoma Res. 12, 405-416 (2002).
- Kennedy, C., et al. Melanocortin 1 receptor (MC1R) gene variants are associated with an increased risk for cutaneous melanoma which is largely independent of skin type and hair color. J. Invest. Dermatol. 117, 294-300 (2001).
- Box, N. F., et al. MC1R genotype modifies risk of melanoma in families segregating CDKN2A mutations. Am. J. Hum. Genet. 69, 765-773 (2001).
- Rees, J. L. The melanocortin 1 receptor (MC1R): more than just red hair. Pigment Cell Res. 13, 135-140 (2000).
- Valverde, P., et al. The Asp84Glu variant of the melanocortin 1 receptor (MC1R) is associated with melanoma. Hum. Mol. Genet. 5, 1663-1666 (1996).
- Kunisada, T., et al. Transgene expression of steel factor in the basal layer of epidermis promotes survival, proliferation, differentiation and migration of melanocyte precursors. Development. 125, 2915-2923 (1998).
- Vanover, J. C., et al. Stem cell factor rescues tyrosinase expression and pigmentation in discreet anatomic locations in albino mice. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 827-838 (2009).
- Spry, M. L., et al. Prolonged treatment of fair-skinned mice with topical forskolin causes persistent tanning and UV protection. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 219-229 (2009).
- Takayama, H., La Rochelle, W. J., Anver, M., Bockman, D. E., Merlino, G. Scatter factor/hepatocyte growth factor as a regulator of skeletal muscle and neural crest development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 5866-5871 (1996).
- Kunisada, T., et al. Murine cutaneous mastocytosis and epidermal melanocytosis induced by keratinocyte expression of transgenic stem cell factor. J. Exp. Med. , 187-1565 (1998).
- Takeuchi, T., Kobunai, T., Yamamoto, H. Genetic control of signal transduction in mouse melanocytes. J. Invest. Dermatol. 92, 239S-242S (1989).
- Ozeki, H., Ito, S., Wakamatsu, K., Hirobe, T. Chemical characterization of hair melanins in various coat-color mutants of mice. J. Invest. Dermatol. 105, 361-366 (1995).
- Lamoreux, M. L., Wakamatsu, K., Ito, S. Interaction of major coat color gene functions in mice as studied by chemical analysis of eumelanin and pheomelanin. Pigment Cell Res. 14, 23-31 (2001).
- Barbini, P., et al. Instrumental measurement of skin colour and skin type as risk factors for melanoma: a statistical classification procedure. Melanoma Res. 8, 439-447 (1998).
- Takiwaki, H. Measurement of skin color: practical application and theoretical considerations. J. Med. Invest. 44, 121-126 (1998).
- Anderson, R. R., Parrish, J. A.
- Rubegni, P., et al. Relationship between skin color and sun exposure history: a statistical classification approach. Photochem. Photobiol. 65, 347-351 (1997).
- Chen, J., Hammell, D. C., Spry, M., D'Orazio, J. A., Stinchcomb, A. L. In vitro skin diffusion study of pure forskolin versus a forskolin-containing Plectranthus barbatus root extract. J. Nat. Prod. 72, 769-771 (2009).
