Summary
Epidermal melanin induceres ved lokal applikation af forskolin i en murin model af fair-flået UV-følsomme menneske. Farmakologisk manipulation af cAMP-niveauer i huden og epidermal mørkfarvning kraftigt beskytte mod UV-medieret inflammation (solskoldning) som målt af den minimale erytematøse dosis (MED) assay.
Abstract
Fairness hud, UV følsomhed og hudkræft risiko alle korrelerer med den fysiologiske funktion af melanocortin 1-receptoren, en G s-koblet signalering protein, der findes på overfladen af melanocytter. MC1R stimulerer adenylylcyclase og cAMP-produktion, som igen opregulerer melanocytisk produktionen af melanin i huden. For at undersøge de mekanismer, som MC1R signalering beskytter huden mod UV-skader, denne undersøgelse er baseret på en musemodel med "humaniseret hud" baseret på epidermal udtryk for stamcelle faktor (SCF). K14-SCF transgene mus bevarer melanocytter i epidermis og derfor har evnen til at deponere melanin i epidermis. I denne dyremodel vildtype MC1R status resulterer i robust aflejring af sort eumelanin pigment og et UV-beskyttet fænotype. I modsætning hertil K14-SCF dyr med defekte MC1R signalering evne udviser en rød / blonde pigmentering, meget lidt eumelanin i huden ogen UV-følsomme fænotype. Ræsonnement, at eumelanin deposition kan forstærkes af topiske midler, der efterligner MC1R signalering, fandt vi, at direkte anvendelse af forskolin ekstrakt på huden af MC1R-defekt lyshudede mus resulterede i robust eumelanin induktion og UV-beskyttelse 1. Her beskriver vi den fremgangsmåde til fremstilling og anvendelse af et forskolin indeholder naturlig rod ekstrakt til K14-SCF lyshudede mus og rapportere en metode til måling af UV-følsomhed ved at bestemme minimal erythematous dosis (MED). Ved hjælp af denne dyremodel, er det muligt at undersøge, hvordan epidermal cAMP induktion og melanin i huden påvirker fysiologiske reaktioner på UV-eksponering.
Introduction
Forekomsten af melanom, den mest dødelige form for hudkræft, er steget dramatisk i løbet af de sidste årtier i USA, især blandt lyshudede individer. Stærk molekylære og epidemiologiske beviser implicerer UV-stråling som en vigtig sygdomsfremkaldende miljøfaktor 2-5. Øget UV-eksponering i form af udsættelse for sol og solarium brug sandsynligvis vil være ansvarlig for meget af stigninger i modermærkekræft forekomst 6-7. Melanom risiko forekommer specielt knyttet til solforbrændinger 8, især dem tidligt i livet 9-10. Risiko for solskoldning er knyttet til ikke blot at dosere og intensiteten af UV-eksponering, men også af arvelige faktorer, der påvirker kutan reaktion på UV-stråling. Hud pigmentering er en af de vigtigste faktorer for UV-følsomhed, risiko for solskoldning og kræftrisiko. Melanom opstår omkring tyve gange hyppigere i lette flået personer i forhold til mørklødede individuals 11-13.
Melanin, et pigment produceret af melanocytter i overhuden, er den vigtigste faktor for hudens teint. Melanin kommer i to store varianter: (1) eumelanin, en mørkebrun / sort pigment effektiv til at absorbere energien af UV-stråling, og (2) pheomelanin en rødlig / blonde pigment mindre effektive til at forhindre gennemtrængning af UV-fotoner ind i huden. Hudfarve, UV følsomhed og modermærkekræft risiko er i vid udstrækning bestemt af epidermal eumelanin indhold 14-15. Jo mere eumelanin i epidermis, kan mindre UV fotoner trænge ind i huden. På grund af lave medfødte niveauer af eumelanin, lyshudede individer er meget mere tilbøjelige til akutte og kroniske effekter af UV-stråling 16-18.
Hudpigmentering, melanom risiko og evnen til at "tan" efter UV-eksponering hele korrelerer med signalevne melanocortin 1-receptoren (MC1R), en Gs-koblet syv transmembrane soverfladetransport receptoren på melanocytter 19-22. Når MC1R binder dets kognate høj affinitetsligand, α-melanocyt-stimulerende hormon (α-MSH), er der aktivering af adenylylcyclase og produktion af det andet messenger-cAMP 23. Den normale fysiologiske reaktion af huden efter UV-eksponering omfatter epidermal fremstilling af α-MSH keratinocyternes 24-29. Vi og andre hypotesen, at keratinocytafledt α-MSH binder til MC1R på epidermale melanocytter, indlede nedstrøms produktion af lejren anden budbringer gennem aktivering af adenylylcyclase 30. cAMP-niveauer styrer mange sider af melanocyte differentiering, herunder overlevelse veje, DNA-reparation og pigment syntese. MC1R signalering og cAMP tydeligt fremkalde pigment enzym niveauer og eumelanin produktion. Når MC1R signalering er intakt og melanocytiske cAMP niveauer er robust, er eumelanin produceres, og huden bliver mørkere. Men hvis MC1R signalering er defekt, ogcytoplasmatiske cAMP-niveauer forbliver lav, pheomelanin produceres i stedet for 1.. Eumelanin syntese kan stimuleres farmakologisk via agenter, der øger cAMP-niveauer 1,14,31-35.
Da MC1R proteinet er en vigtig regulator af modermærkekræft risiko hos mennesker 36-46, er vi interesseret i mekanismer, som MC1R beskytter melanocytter mod UV-induceret carcinogenese. Som grundlag for vores studier, der genereres vi en transgen MC1R-variant murine model på en ren C57BL / 6 genetiske baggrund 1. I denne model, stamcelle faktor (SCF) udtrykkes konstitutivt i de basale epidermis og epidermale interfollicular melanocytter er tilbageholdt i huden hele livet 47, i modsætning til de ikke-transgene mus, hvor melanocytter lokalisere til dermis i hårsækkene. Med K14-Scf transgen indarbejdet bliver epidermis pigmenteret med den særlige melanin pigmenter karakteristisk af pigmentetstamme af dyret 1. K14-SCF mus på C57BL / 6 genetiske baggrund med vildtype MC1R signalering er jet-sort hud er karakteriseret ved meget høje niveauer af eumelanin pigment. Ikke overraskende er disse dyr er meget UV-bestandig. I modsætning hertil genetisk matchede K14-SCF C57BL / 6 dyr, der huser en mutant inaktiv MC1R har næsten ingen eumelanin i epidermis. I stedet disse "udvidelse" dyr (MC1R e / e) har en lys hud teint forårsaget af aflejring af pheomelanin pigment (figur 1A) og er meget mere UV-følsomme 48-49.
Farmakologiske forbindelser med kemiske egenskaber, der tillader indtrængning i huden har vist sig at potente inducere eumelanin i udvidelsen (MC1R e / e) K14-Scf dyremodel ved direkte at manipulere cAMP-niveauer i epidermale melanocytter i huden. Melanin opregulering i denne model har været reported af adenylylcyclase aktivering 1 samt phosphodiesterase 4-inhibering 35. I denne artikel vil vi demonstrere forberedelse og lokal applikation af forskolin i forlængelse (MC1R e / e), som model K14-SCF dyr lyshudede UV-følsomme menneske. Vi viser, at to gange daglig anvendelse af lægemidlet fremmer accelereret melanin, at mørkfarvning af huden skyldes epidermal aflejring af melaninpigment og induceret epidermal melanin beskytter mod UV-induceret solskoldning ved måling af "minimal erytematøse dosis" (MED) 48.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Udarbejdelse af Forskolin til topisk administration fra en rå Root Extract af Plectranthus barbatus (Cohleus forskohlii) Plant
- Protokoller for murine eksperimenter fulgte retningslinjerne for etisk adfærd i pleje og anvendelse af dyr, og blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på University of Kentucky (Protokol # 00768M2004). Roden ekstrakt består ved 40% vægt / volumen i en standard dermatologiske base af 70% ethanol, 30% propylenglycol.
- 200 g rå forskolin rod ekstrakt afvejes og overføre det til et bæger. For at gøre 500 ml af en 40% (w / v) opløsning, resuspender 200 g råt forskolin rod ekstrakt ved tilsætning af de fleste, men ikke alle af køretøjets volumen (70% ethanol, 30% propylenglycol), og opløsningen til ca 450 ml.
- Der omrøres i en time ved stuetemperatur. Løsningen vil være noget viskos og kan kræve manuel omrøring til "løfte" ekstraktet i opløsning førrørestangen er i stand til at tage over.
- Efter en times omrøring, hæld blandingen i en gradueret cylinder og rumfanget bringes op på 500 ml ved hjælp af køretøjer, der er blevet brugt til at "skylle ud" bægerglasset, der blev brugt til at røre gyllen (at maksimere genvinding af forskolin fra bægerglasset) .
- Overfør opslæmningen til 50 ml polypropylen centrifugerør. Centrifugeres (1500 xg, stuetemperatur, 15 min) med en tabel-top centrifuge. På dette tidspunkt vil det uopløselige materiale være temmelig komprimeret, således at supernatanten let hældes fra.
- Opløsningen filtreres gennem et 0,22 um celluloseacetatmembran at fjerne eventuelle uopløselige materiale fra ekstrakten. Vi anvender en flaske-top system designet til cellekultur, sammen med anvendelsen af forfiltre der kommer med enheden for at forhindre for tidlig tilstopning af membranen fra uopløselige bestanddele af rod ekstrakt. Ved store mængder af ekstraktet filtreres omkring 100 ml ad gangen, skiftende forfilteret betlem hver ekstra volumen.
- Når det opbevares ved stuetemperatur, ekstraktet opretholder biologisk aktivitet op i op til et år.
2. Udarbejdelse af C57BI / 6 K14-Scf Mus til aktuelle behandlinger
- Fjern dorsal skind fra dyrene ved elektrisk klipning. Kortvarigt bedøver dyrene med inhalationsanæstesimiddel isofluran at lette forskydning af dorsal pels med elektriske saks udstyret med en 0,25 mm kirurgisk forberedende hoved (Fisher Scientific). Fortrinsvis kun bruge én type af anæstesi (fx ketamin / xylazin) for at minimere risikoen for bedøvelsesmiddel overdosis. Det mættede indånding kammer bærer erhvervsmæssig risiko, når de anvendes uden et stinkskab og leverer ukendte mængder bedøvelsesmiddel til dyr. Ideelt en præcision vaporizer bør anvendes.
- At fjerne resterende hår skægstubbe, behandle dyrene med en kemisk hårfjerningsmidler. Indgives anæstesi til dyret med en IP-injektion af ketamin 40 mg / kg og xylazin 4 mg / kg Når dyr er tilstrækkeligt bedøvet (bedømmes ved tå knivspids), gælder en fingerspids mellemstore størrelsen af hårfjerningsmiddel til klippet dorsalhud hjælp af en behandsket finger. Gnid cremen ind i huden i 30-60 sekunder, eller indtil hårene kan tydeligt ses i cremen, da det bliver flyttet rundt. Lad cremen på kun det minimum af tid, der kræves til hårfjerning som langvarig udsættelse fører til kemisk forbrænding af huden, epidermal nedbrydning og død fra tab af epidermal integritet.
- Tør den dorsale hud med vand gennemvædet gazetamponer indtil alle fløde er blevet fjernet. Tørre dyr med bløde papirservietter, og give dem mulighed for at komme sig i et varmt afsides beliggenhed (f.eks rene bure placeret på en opvarmning pad). Fjerne hår dyrene én efter én, og nøje overvåge hele proceduren.
3. Topikal administration af Forskolin eller Bærerkontrol
- Dyr skal behandles én ad gangen. Kortvarigt bedøver med indånderd isofluran ved at placere musen på toppen af en figursyet nylon air-gennemtrængelige filter, hvorunder der er placeret en isofluran-mættet papir håndklæde i en isofluran-mættet låg klar glaskrukke i et stinkskab. Bring musen til isofluran i et tilstrækkeligt tidsrum for at undertrykke frivillige muskelbevægelser, men at bevare spontan respiration (typisk 10-20 sek). Forlader dyret i isofluran for længe vil resultere i respiratorisk undertrykkelse og død. Det er bedre at fejle på siden af "going light" og at skulle udsætte musen kortvarigt til mere isofluran snarere end at overeksponere dyret til lægemidlet og risiko død.
- Fjern dyret fra isofluran kammer og placere på et rent absorberende bænk pad.
- Ved hjælp af en 1.000 pi mikropipette udstyret med en engangs spids polypropylen, udarbejder 400 pi 40% rå forskolin ekstrakt (køretøj kontroldyr vil modtage 70% ethanol, 30% propylenglycol alene).
- Overfør ekstrakten påbagsiden af dyret ved at dryppe den på huden og derefter, ved hjælp af den side af pipettespidsen, smøre ekstrakten over ryghuden, indtil al huden er dækket. Der er ikke behov for at rense huden efter påføring.
- Retur musen til sit bur, og omhyggeligt observere, indtil det genvinder fra anæstesi.
- For at ikke-pigment cAMP effekter ikke bør forveksle UV følsomhed eksperimenter, afbryde alle aktuelle behandlinger 2 dage inden UV-eksponering (pigment effekten varer flere dage over sidste lokalbehandling).
4.. Hudfarve Måling af Reflective Kolorimetri
- Kortvarigt bedøver musen med inhaleret isofluran (se ovenfor).
- Kalibrere et Minolta colorimeter ved at placere den bærbare hoved på standardiserede hvide overflade forsynet med kolorimeteret.
- Anbring den bærbare målehoved af kolorimeteret flugter med den dorsale hud af dyret sikre, at 1 cm2 runde aperture er trykket helt på huden. Tag mindst tre separate målinger i forskellige områder af dorsale hud.
- Beregn middelværdi L * score ± SD pr dyr og pr behandlingsgruppe. Reflekterende kolorimetri kan ske på ethvert tidspunkt i eksperimentet.
5.. Bestemmelse af UV følsomhed ved Beregning af "Minimal Erytematøst Dose" (MED)
- Brug dyr, der er behandlet med enten bil eller forskolin som beskrevet ovenfor. Bedøve dyrene med intraperitoneal injektion af en standard blanding af ketamin og xylazin (se ovenfor).
- Forbered et stykke af UV-okklusiv bånd til MED test. For at generere huller i båndet, skal du bruge en heavy-duty hulning med en 1 cm 2 cirkulær udskæring (figur 2A og B). At have huller af en defineret størrelse og symmetrisk arrangement i båndet letter anerkendelsen af hudforandringer efter bestråling. Over hver hul i båndet, anvende en lille, men let aftageligt stykke bånd, som kan fjernes på bestemte tidspunkter i løbet af UV-eksponering til at tillade administration af forskellige UV-doser.
- Når dyr er tilstrækkeligt bedøvet, skal du placere tape på ryg overfladen. Eye smøremiddel bør altid anvendes under anæstesi.
- Tænd UV-kilden, der består af to Westinghouse F15T8UV-B lamper med en peak output på 313 nm og en rækkevidde på 280-370 nm. Lad lampen afbalancere til en konstant UV output målt ved en UV-fotometer med et UVB-sensor (normalt tager et par minutter, lamperne til at varme op).
- Baseret på transmissionshastighed UV målt ved UV-fotometer beregne UV eksponeringstid for hvert ønsket dosis. For eksempel er vores lampens UVB output foranstaltninger 2,4 mW / cm 2. Derfor at administrere 5 kJ / m 2, vil huden har brug for, at blive udsat for 208 sek (som er 3 min og 28 sek) af UVB-stråling, som beregnet nedenfor:
upload/50670/50670eq1.jpg "/> - Placer sederede dyr (hver med okklusiv tape på plads) Bugsiden ned for at sikre endnu UV-eksponering. Til at administrere de valgte doser af UV-stråling, sekventielt fjerne de små okklusive bånd, der dækker hullerne til at eksponere 1 cm 2 områder af huden til de korrekte doser af stråling. Derfor, ved hjælp af ovenstående eksempel, hvis 40 kJ / m 2 er den største dosis i forsøget, så dyret ville være under lampen i 27 min og 47 sek alt og huden i 40 kJ / m 2 betingelse ville have nogen overliggende båndet hele tiden. Dog ville tape overliggende 5 kJ / m 2 betingelse fjernes, når der er 208 sek tilbage i eksponeringen. Timing af tape fjernelse bør ske således, at hver betingelse slutter samtidigt.
- Efter UV-eksponering, skrælle tape fra ryghuden omhyggeligt, pas på ikke at rippe huden med pludselige eller overdrevent kraftige bevægelser. Placer dyr i en varm roligt sted at tilladenyttiggørelse fra anæstesi.
- Monitor mus i 24-48 timer for at kigge efter diskrete områder af erytem (rødme) eller ødem (hævelse) svarende til de anatomiske steder udsat for specifikke dosis af UV-bestråling. Dokument hud fund fotografisk.
- MED værdi svarer til den minimale dosis af UV, der forårsager betændelse, som defineret af erytem og / eller ødem på hele udsatte kreds af huden. Bemærk, at pigmentering af huden kan udfordre bestemmelse af MED imidlertid erytem og ødem kan stadig generelt vurderes nøje, til dels takket være den defineret form af åbninger i båndet under UV-eksponering.
6.. Statistisk analyse
Analysere data mellem kohorter af mus ved envejs-ANOVA med Bonferroni indlæg test (Graph Pad PRISM). P-værdier <0,05 betragtes statistisk signifikant.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
C57BL / 6 mus blev genereret på eumelanotic, pheomelanotic eller amelanotiske baggrunde inkorporerer K14-Scf transgen som beskrevet (figur 1A). Kohorter af lyshudede forlængelse (MC1R e / e, Tyr + / +) blev mus behandlet topisk med to gange daglige doser af enten vehikel (70% ethanol, 30% propylenglycol), eller 40% rå Coleus forskohlii rod ekstrakt (80 uM per dosis) i 5 dage (Figur 2B). Virkninger af topiske behandlinger på epidermal pigmentering blev bestemt både ved visuel inspektion og ved reflekterende kolorimetri (figur 1B). Anvendelse af rod ekstrakt var forbundet med robust epidermal mørkfarvning i K14-Scf transgene baggrund, men ikke i genetisk matchede ikke-transgene dyr. Vi fortolker disse resultater at indikere, at interfollicular epidermale melanocytter skal være til stede, for farmakologisk induceret melanin der skal deponeres i den epidemiologiskermis. Selvom rod ekstrakt dybt farvet på grund af tilstedeværelsen af plante fytokemikalier udover forskolin kan mørkfarvning af huden ikke alene på grund af en farvning fra stoffet, som ikke-transgene dyr udviser ikke mørkfarvning med rod ekstrakt (figur 1B). Når de anvendes i et to gange daglig måde kan melanizing virkninger af topisk påførte forskolin bemærkes i så lidt som 2 dage, selv om maksimal mørkfarvning realiseres efter flere dage mere (figur 1C). Graden af melanin er dosisafhængig, som vist ved Fontana-Masson melanin farvning af dorsale hudsektioner behandlet med forskellige koncentrationer af lægemidlet (figur 1D).
Derefter blev virkningen af topisk anvendt forskolin på UV-følsomhed bestemmes af MED test i forlængelse mus (MC1R e / e, Tyr + / +) som beskrevet ovenfor (figur 2 A og B). MED beslutsomhed blev sammenlignet mellem animals behandlet med en fremskyndet lægemiddelbehandling (to gange dagligt administration i 5 dage, i alt 10 doser) i forhold til en standard fremgangsmåde (administration én gang dagligt i 15 dage, 15 samlede doser). Ikke-transgene mus blev inkluderet for at kontrollere for ikke-melanin lægemiddelvirkninger. Begge behandlinger resulterede i lignende mængder af mørkfarvning af huden i forskolin-behandlede K14-SCF dyr. Konkret (hvid-sort skala reflekterende kolorimetri) værdier L * for forskolin-eksponerede dyr var 31,9 ± 1,8 og 31,1 ± 1,6 for fremskyndet anvendelse vs standard ansøgning, hhv. Der var ingen åbenlyse toksiske virkninger fra forskolin eksponering i hver behandlingsgruppe, således, konkluderede vi, at accelereret forskolin administration (to gange om dagen for i alt 10 doser, 80 uM per dosis) fremmes sikker melanin dorsale hud lige så effektivt som det tidligere anvendte (en gang om dagen i 15 totaldoser, 80 uM per dosis).
Forskolin-induceret epidermal melanin resulterede idyb UV-beskyttelse, som bedømmes af MED (figur 2C-D). Medens betyde MED for K14-SCF forlængelse mus behandlet for to gange i 5 dage med bil var 5,0 ± 0,0 kJ / m 2, gennemsnitlig MED for kohorter behandlet med aktuel forskolin var> 30,0 ± 0,0 kJ / m 2 (figur 2 A og C). Faktisk er en dosis på 30,0 kJ / m 2 var utilstrækkelige til at skabe erytem i dette eksperiment. Brug standard forskolin dosering (en gang om dagen i 15 totale doser, 80 pM per dosis), fandt vi, at den gennemsnitlige MED for K14-SCF forlængelse mus behandlet med forskolin var 50,0 ± 7,1 kJ / m 2 (Figur 2 B, D). Vigtigere er, at forskolin forbehandling ikke påvirke MED dyr ude af stand melanin, enten på grund af mangel på K14-Scf-medierede epidermale melanocytter (figur 2C, D) eller på grund af tyrosinase mangel (Figur 2E). Da forskolin applikationer var disfortsatte 2 dage inden UV-eksponering og blev ikke videreført efter UV-eksponering, konkluderer vi, at ikke-pigmentglaukom cAMP effekter ikke spille en rolle i MED-resultater. Snarere data tyder på, at epidermal melanin var den mekanisme, hvormed forskolin induceret UV-beskyttelse i denne model.
Figur 1. Lokalbehandling af forskolin fremmer hudens mørkfarvning i fair-flået forlængelse (MC1R e / e) mus. (A) Fotografier af C57BL / 6 dyr, der anvendes i denne undersøgelse. Dyr er genetisk matchede undtagen ved melanocortin 1-receptoren (MC1R) og tyrosinase (Tyr) loci. Bemærk, at pigmentering eumelanotic (sort), når MC1R er funktionel, men pheomelanotic (blondish), når MC1R er defekt, som det er tilfældet medudvidelse (MC1R e / e) mutant. Epidermal pigmentering afhænger fastholdelse af interfollicular epidermale melanocytter i huden ved K14-Scf transgen, og kan nemt ses i ørerne. (B) Fotografier af udvidelse (MC1R e / e) K14-Scf eller ikke-transgene dyr behandlet med 400 pi vehikelkontrollen (70% ethanol 30% propyl-glycol) eller 40% w / v (80 uM) forskolin påføres to gange dagligt til den barberede dorsale hud i 5 dage, i alt 10 ansøgninger. Hudfarve målinger med reflekterende kolorimetri blev udført for hver gruppe. Reflekterende kolorimetri resultater rapporteres som middelværdi (± SD) reflektometri enheder på L * (sort-hvid) farve akse. Bemærk, at topikal administration af forskolin forårsagede robust mørkfarvning i K14-SCF transgene dyr, men ikke i ikke-transgene mus. (C) Tidsforløb eksperiment viser mørkfarvning af forskolin-behandlede øre af K14-ScfForlængelse af mus for de angivne tidspunkter (forskolin-behandlede ører er angivet af de blå trekanter). Køretøj blev anvendt på det højre øre til sammenligning. (D) Fontana-Masson farvede hudsektioner taget fra dyr behandlet med de angivne doser af forskolin som beskrevet. Klik her for at se større figur .
Figur 2. Forskolin-induceret melanin beskytter mod UV-medieret inflammation som bestemt ved minimal erytematøse dosis (MED) test. (A, B) Placering af UV okklusiv tape og UVB doser af dyr behandlet to gange dagligt i 5 dage (A, C) eller én gang dagligt i 15 dage (B, D, E) med enten bil eller forskolin. Th e sidste topisk behandling blev anvendt 48 timer før bestråling. Dorsalhud blev udsat for forskellige doser af UV-B ved hjælp af UV-okklusiv bånd med udstansede 1 cm2 cirkulære åbninger, og varierende eksponeringstider til opnåelse af den passende dosis. Efter bestråling blev cirkler af eksponeret hud mærket med en pen i nogle eksperimenter. MED er defineret af erytem og / eller ødem på hele cirklen af eksponeret hud til en bestemt dosis, blev bestemt 48 timer efter eksponering. MED ± SD resultater rapporteres som kJ / m 2 UVB, * p ≤ 0,001. (E) Hudfarve Reflectometry og MED værdier for tyrosin-mangel K14-SCF albino forlængelse mus behandlet i 10 dage med køretøj eller forskolin. Klik her for at se større figur .
70fig3highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50670/50670fig3.jpg "/>
Figur 3. Samlet skema af forsøget. Kohorter af udvidelse (MC1R e / e) K14-Scf eller ikke-transgene dyr blev forberedt ved at fjerne dorsale pels af elektrisk klipning og / eller kemisk hårfjerning. Dyrene blev derefter behandlet med topiske anvendelser af enten vehikel (70% ethanol, 30% propylenglycol) eller 40% rå forskolin ekstrakt af doseringsskemaer angivet. Effekter på hud pigmentering blev dokumenteret fotografisk, kolorimetrisk og ved Fontana-Masson melanin farvning. UV-følsomhed blev bestemt ved minimal erythematous dosis (MED) test.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjælp af en dyremodel for fair-flået menneske, finder vi, at lokal applikation af en forskolin-rige rå rod ekstrakt håndfast mørkere epidermis ved at stimulere melanin produktionen i huden. Epidermal melanin er afhængig af ekspressionen af stamcelle faktor i de basale epidermis, som forekommer i human hud, men ikke i genetisk modificerede mus hud. Den dorsale hud af genetisk modificerede mus mangler et tilstrækkeligt antal interfollicular melanocytter at bibringe pigment til huden. Kun i fastsættelsen af konstitutiv ekspression af en melanocyt vækstfaktor såsom stamcelle faktor (kit ligand) eller hepatocytvækstfaktor (HGF), kan melanocytter bevares i det basale lag af epidermis gennem hele livet af dyret 50-51. Vores dyremodel for den fair-flået menneske er baseret på inkorporering af K14-Scf transgen i forlængelse pigment variant af C57BL / 6 muse linje. Selvom dyr i alle aldre kan værebrugt vores eksperimenter typisk involverer unge voksne (4-12 ugers alderen) mus. På grund af en afkortet melanocortin 1 receptor (MC1R), som fører til tab af cAMP signalering, forlængerledninger mus udtrykker pheomelanin fortrinsvis i pelsen og huden (i K14-SCF eller HGF-Met transgene stater) snarere end eumelanin 52-54. Som følge af ændret melanin ekspression K14-SCF udvidelse mus er meget mere UV-følsomme end deres MC1R-vildtype modparter, der har jet-sort hud på grund af rigelige aflejring af epidermal eumelanin pigment 1. Vi ræsonnerede, at da eumelanin produktionen stærkt formindsket i fastsættelsen af en mutant MC1R, at farmakologiske stimulanser, der efterligner MC1R signalering måske redde eumelanin produktion. MC1R er en Gs-koblet transmembranreceptor, at ved binding af dens høje affinitet ligand α-melanocyt-stimulerende hormon (α-MSH) transmitterer pro-differentiering signaler til melanoCYTE cytoplasmaet via adenylylcyclase aktivering og produktion af second messenger-cAMP. Således har vi en hypotese, at lokal applikation af forskolin, en celle-gennemtrængelig diterpenoid der er en potent direkte aktivator af adenylylcyclase, kan være i stand til at fremme eumelanin produktion i MC1R-defekt, pheomelanotic tilstand.
Med renset forskolin for disse undersøgelser dog vist sig omkostningseffektive uoverkommelige. Tidlige eksperimenter, der bestemmer den minimale mængde forskolin kræves for epidermal mørkfarvning i K14-Scf udvidelse model foreslået, at maksimal mørkfarvning skete med brug af en 40% vægt per volumen løsning ved hjælp af rå ekstrakt, der indeholdt 20% (vægt pr vægt) forskolin. Vi beregner, at anvendelsen af 400 pi af en 8% endelige forskolin (vægt pr volumen, 40% x 20%) opløsning vil resultere i leveringen af cirka 80 uM forskolin til ryghuden hver enkelt ansøgning. Naturligvis meget af den leverede dosisikke absorberes af huden, i stedet blive gennemblødt op ved omgivende pels eller falder dyret på tidspunktet for ansøgningen. Det er således vanskeligt at rapportere den nøjagtige indså dosis, som dyrene får med hver ansøgning af lægemidlet. Ikke desto mindre, når den anvendes på denne måde, forskolin resulterer i robust induktion af pigment enzymer i huden og produktion af eumelanin. Faktisk K14-SCF transgene forlængelse dyr vist klar mørkfarvning af huden, efter at det andet program (figur 1C).
Selvom vi tidligere har offentliggjort mørkfarvning med daglige anvendelse af lægemidlet 1,48-49, viser vi her, at to gange daglig anvendelse er forbundet med robust epidermal brunfarvning og væsentlig UV-beskyttelse, hvilket tyder på, at farmakologisk induceret melanin kan optimeres ved administration af medicin oftere end én gang om dagen. Mørkfarvning af huden, hvilket skyldes eumelanin induktion i epidermis, varer sålænge topiske forskolin behandlinger er fortsat. Selv kronisk anvendelse (gennem tre måneder) syntes veltolereret af musene 49. Stigningen i mørkfarvning af huden skyldes melanin syntese snarere end proliferation af melanocytter i epidermis. 49. Når aktuelle behandlinger er ophørt, huden forsvinder gradvist tilbage til sin hidtidige fair teint (over 2-3 uger), som epidermal melanin er tabt med normal keratinocyt fornyelse. Mørkfarvning af huden kan let bestemmes ved simpel visuel inspektion af musene, men hudfarve kan kvantificeres objektivt ved hjælp af reflekterende kolorimetrisk 55-56. Denne metode er en non-invasiv hurtig og smertefri fremgangsmåde til måling af hudfarve. Farve kan være præcist beskrevet ved hjælp af L * a * b * (LAB) farverum model 57-58.
For disse eksperimenter vi påberåbt en rå rod ekstrakt af Coleus forskolii plante, den naturlige kilde forskolin. Dette præparatblev anvendt på grund af de høje omkostninger ved at udføre disse forsøg med oprenset forskolin. Dette eksperiment for eksempel kræves omkring 2 g forskolin i alt to gange daglig påføring på seks dyr i fem dage. 2 g kommercielt tilgængeligt HPLC-renset forskolin ville koste mere end $ 20.000, sammenlignet med mindre end $ 5 for den rå ekstrakt. Selv renset forskolin induceret epidermal melanin i vores dyremodel 1, kan vi ikke udelukke mulige virkninger af andre plante-afledte forbindelser i den rå rod ekstrakt, herunder alkaloider, phenoler og garvesyre. Faktisk forudgående arbejde ved hjælp af marsvin eller menneskers hud eksplantater foreslog, at forbindelser i den rå rod ekstrakt kan fremme kutan absorption af forskolin 59. Som imidlertid endnu identitet og mekanismen af disse forbindelser er fortsat ukendt. Således kan vi ikke udelukke at ændre virkningerne af andre forbindelser, der findes naturligt i rå rod ekstrakt.
Det sammensatte forskolin blandingen mørkebrun væske med en attraktiv krydderi-lignende aroma, der er nemt at anvende på huden til topisk anvendelse. Fordi de uopløselige materialer er blevet fjernet, daglige anvendelse efterlader ingen skorpedannelse eller aflejringer når absorberes af huden. Selvom rå rod ekstrakt er mørkebrun når de fremstilles på denne måde, mørkfarvning af huden fremkaldt af narkotika er ikke blot et farvestof virkning, hvilket fremgår af, at topisk anvendelse af forbindelsen på dyr ude af stand til huden melanin (f.eks MC1R e / e tyrosinase -mangel albino dyr eller ikke-transgene mus, der mangler epidermale melanocytter) havde ingen effekt på huden mørkere (figur 1B og 2E). Vi ser disse eksperimenter som proof-of-concept demonstrationer, manipulation af cAMP i huden kan fremkalde UV-beskyttende mørk hud pigmentering. Det er dog usandsynligt, at topikal administration af forskolin er en realistisk eller praktisk terapeutisk mulighed på grund af den ikke-specifikke karakter af lægemidlet. Jegndiscriminate og ikke-målrettet aktivering af adenylyl cyclaser og induktion af cAMP kan forventes at medføre uacceptable toksiciteter. Vigtigt, har andre vist, at topisk administrering af en phosphodiesterase 4-inhibitor (Rolipram) potent opreguleret melanin i K14-Scf forlængelse dyremodel, som beviser, kutan cAMP induktion og melanin kan opnås ved alternative farmakologiske målretning 35. Det er klart, før aktuel manipulation af cAMP-niveauer i huden kan oversættes til human brug, vil dens sikkerhed skal vurderes omhyggeligt. Ikke desto mindre vores data tyder på, at farmakologisk induceret melanin er UV-beskyttende, som bestemt ved minimal erythematous dosis (MED) test.
Sammenfattende topikal administration af forskolin, en adenylylcyclase aktivator, resulterede i en stærk melanin i overhuden af en murin model af fair-flået mennesker baseret på defekte cAMP signalering nedstrøm af et defekt melanocortin 1-receptoren (MC1R). Epidermal melanin var UV-beskyttende, målt ved minimal erythematous dosis (MED) test. Vi hypotesen, at farmakologiske cAMP manipulation kan ikke kun rednings UV-beskyttende eumelanization af overhuden, men andre MC1R-afhængige UV-beskyttende reaktioner så godt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at takke Malinda Spry for teknisk assistance. Vi anerkender også nuværende og tidligere finansieringskilder: National Cancer Institute (R01 CA131075, R01 CA131075-02S1), Wendy Will Case Cancer Research Fund, den Markey Cancer Foundation, Børnenes Miracle Network og Jennifer og David Dickens melanom Research Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Coleus Forskoli extract 20% | Buckton Scott USA Inc. | n/a | Princeton, NJ |
| Isothesia, Isoflurane , USP | Butler Schein | NCD 11695-6776-1 | Dublin, OH, USA |
| Xylazine | Anased Injection | LA04612 | Shenandoah, Iowa, USA |
| Ketamine HCl, USP | Putney | NDC 26637-411-01 | St. Joseph, MO, USA |
| Ethanol | Decon Labs. | 2705 | |
| Propylene glycol | Adesco | 05751L | Solon, OH, USA |
| Depilatory cream, Nair | Church Dwight | JF-11 4381322 | Priceton, NJ |
| EQUIPMENT | |||
| Germicidal Hg Lamp UV-B | Westinghouse | F15T8UV-B | |
| Radiometer photometer | International light | 1LT400A | Peabody, MA,USA |
| Chromameter | Konica Minolta | CR-400 | Ramsey, NJ, USA |
| Data Processor for Chromameter CR-400 | Konica Monilta | DR-400 | Ramsey, NJ, USA |
References
- D'Orazio, J. A., et al. Topical drug rescue strategy and skin protection based on the role of Mc1r in UV-induced tanning. Nature. 443, 340-344 (2006).
- Gallagher, R. P., et al. Suntan, sunburn, and pigmentation factors and the frequency of acquired melanocytic nevi in children. Similarities to melanoma: the Vancouver Mole Study. Arch Dermatol. , 126-770 (1990).
- Kraemer, K. H., Lee, M. M., Andrews, A. D., Lambert, W. C. The role of sunlight and DNA repair in melanoma and nonmelanoma skin cancer. The xeroderma pigmentosum paradigm. Arch Dermatol. 130, 1018-1021 (1994).
- Wang, Y., et al. Evidence of ultraviolet type mutations in xeroderma pigmentosum melanomas. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 6279-6284 (2009).
- Pleasance, E. D., et al. A comprehensive catalogue of somatic mutations from a human cancer genome. Nature. 463, 191-196 (2009).
- Weinstock, M. A., Fisher, D. E. Indoor ultraviolet tanning: what the data do and do not show regarding risk of melanoma and keratinocyte malignancies. J. Natl. Compr. Canc. Netw. 8, 867-873 (2010).
- Fisher, D. E., James, W. D. Indoor tanning--science, behavior, and policy. N. Engl. J. Med. 363, 901-903 (2010).
- Pfahlberg, A., Kolmel, K. F., Gefeller, O. Timing of excessive ultraviolet radiation and melanoma: epidemiology does not support the existence of a critical period of high susceptibility to solar ultraviolet radiation- induced melanoma. Br. J. Dermatol. 144, 471-475 (2001).
- Lew, R. A., Sober, A. J., Cook, N., Marvell, R., Fitzpatrick, T. B. Sun exposure habits in patients with cutaneous melanoma: a case control study. J. Dermatol. Surg. Oncol. 9, 981-986 (1983).
- Autier, P., Dore, J. F. Influence of sun exposures during childhood and during adulthood on melanoma risk. EPIMEL and EORTC Melanoma Cooperative Group. European Organisation for Research and Treatment of Cancer. Int. J. Cancer. 77, 533-537 (1998).
- Udayakumar, D., Mahato, B., Gabree, M., Tsao, H. Genetic determinants of cutaneous melanoma predisposition. Semin. Cutan. Med. Surg. 29, 190-195 (2010).
- Psaty, E. L., Scope, A., Halpern, A. C., Marghoob, A. A. Defining the patient at high risk for melanoma. Int. J. Dermatol. 49, 362-376 (2010).
- Tucker, M. A. Melanoma epidemiology. Hematol. Oncol. Clin. North Am. 23, 383-395 (2009).
- Abdel-Malek, Z. A., Knittel, J., Kadekaro, A. L., Swope, V. B., Starner, R. The melanocortin 1 receptor and the UV response of human melanocytes--a shift in paradigm. Photochem. Photobiol. 84, 501-508 (2008).
- Suzuki, I., et al. Participation of the melanocortin-1 receptor in the UV control of pigmentation. J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 4, 29-34 (1999).
- Gibson, G. E., Codd, M. B., Murphy, G. M. Skin type distribution and skin disease in Ireland. Ir. J. Med. Sci. 166, 72-74 (1997).
- Evans, R. D., et al. Risk factors for the development of malignant melanoma--I: Review of case-control studies. J. Dermatol. Surg. Oncol. 14, 393-408 (1988).
- Pack, G. T., Davis, J., Oppenheim, A. The relation of race and complexion to the incidence of moles and melanomas. Ann. N.Y. Acad. Sci. 100, 719-742 (1963).
- Valverde, P., Healy, E., Jackson, I., Rees, J. L., Thody, A. J. Variants of the melanocyte-stimulating hormone receptor gene are associated with red hair and fair skin in humans. Nat. Genet. 11, 328-330 (1995).
- Rees, J. L., Healy, E. Melanocortin receptors, red hair, and skin cancer. J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 2, 94-98 (1997).
- Beaumont, K. A., et al. Melanocortin MC(1) receptor in human genetics and model systems. Eur. J. Pharmacol. 660, 103-110 (2011).
- Palmer, J. S., et al. Melanocortin-1 receptor polymorphisms and risk of melanoma: is the association explained solely by pigmentation phenotype? Am. J. Hum. Genet. 66, 176-186 (2000).
- Haskell-Luevano, C., et al. Compounds that activate the mouse melanocortin-1 receptor identified by screening a small molecule library based upon the beta-turn. J. Med. Chem. 42, 4380-4387 (1999).
- Yamaguchi, Y., Hearing, V. J. Physiological factors that regulate skin pigmentation. Biofactors. 35, 193-199 (2009).
- Eves, P. C., MacNeil, S., Haycock, J. W. alpha-Melanocyte stimulating hormone, inflammation and human melanoma. Peptides. 27, 444-452 (2006).
- Slominski, A., Wortsman, J., Luger, T., Paus, R., Solomon, S. Corticotropin releasing hormone and proopiomelanocortin involvement in the cutaneous response to stress. Physiol. Rev. 80, 979-1020 (2000).
- Slominski, A., Wortsman, J. Neuroendocrinology of the skin. Endocr. Rev. 21, 457-487 (2000).
- Luger, T. A., et al. Role of epidermal cell-derived alpha-melanocyte stimulating hormone in ultraviolet light mediated local immunosuppression. Ann. N.Y. Acad. Sci. 885, 209-216 (1999).
- Chakraborty, A. K., et al. UV light and MSH receptors. Ann. N.Y. Acad. Sci. 885, 100-116 (1999).
- Cui, R., et al. Central Role of p53 in the Suntan Response and Pathologic Hyperpigmentation. Cell. 128, 853-864 (2007).
- Imokawa, G., Yada, Y., Hori, Y. Induction of melanization within hair bulb melanocytes in chinchilla mutant by melanogenic stimulants. J Invest Dermatol. 91, 106-113 (1988).
- Siegrist, W., et al. Interactions of alpha-melanotropin and agouti on B16 melanoma cells: evidence for inverse agonism of agouti. J. Recept. Signal Transduct Res. 17, 75-98 (1997).
- Abdel-Malek, Z., et al. The melanocortin-1 receptor is a key regulator of human cutaneous pigmentation. Pigment Cell Res. 13, Suppl 8. 156-162 (2000).
- Wood, J. M., Gibbons, N. C., Schallreuter, K. U. Melanocortins in human melanocytes. Cell Mol Biol (Noisy-le-grand). 52, 75-78 (2006).
- Khaled, M., Levy, C., Fisher, D. E. Control of melanocyte differentiation by a MITF-PDE4D3 homeostatic circuit. Genes Dev. 24, 2276-2281 (2010).
- Ghiorzo, P., et al. MC1R variation and melanoma risk in relation to host/clinical and environmental factors in CDKN2A positive and negative melanoma patients. Exp. Dermatol. , (2012).
- Cust, A. E., et al. MC1R genotypes and risk of melanoma before age 40 years: a population-based case-control-family study. Int. J. Cancer. 131, E269-E281 (2012).
- Ibarrola-Villava, M., et al. Genetic analysis of three important genes in pigmentation and melanoma susceptibility: CDKN2A, MC1R and HERC2/OCA2. Exp Dermatol. 19, 836-844 (2010).
- Scherer, D., et al. Melanocortin receptor 1 variants and melanoma risk: A study of 2 European populations. Int. J. Cancer. , (2009).
- Hoiom, V., et al. MC1R variation and melanoma risk in the Swedish population in relation to clinical and pathological parameters. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 196-204 (2009).
- Galore-Haskel, G., et al. MC1R variant alleles and malignant melanoma risk in Israel. Eur. J. Cancer. 45, 2015-2022 (2009).
- Sturm, R. A. Skin colour and skin cancer - MC1R, the genetic link. Melanoma Res. 12, 405-416 (2002).
- Kennedy, C., et al. Melanocortin 1 receptor (MC1R) gene variants are associated with an increased risk for cutaneous melanoma which is largely independent of skin type and hair color. J. Invest. Dermatol. 117, 294-300 (2001).
- Box, N. F., et al. MC1R genotype modifies risk of melanoma in families segregating CDKN2A mutations. Am. J. Hum. Genet. 69, 765-773 (2001).
- Rees, J. L. The melanocortin 1 receptor (MC1R): more than just red hair. Pigment Cell Res. 13, 135-140 (2000).
- Valverde, P., et al. The Asp84Glu variant of the melanocortin 1 receptor (MC1R) is associated with melanoma. Hum. Mol. Genet. 5, 1663-1666 (1996).
- Kunisada, T., et al. Transgene expression of steel factor in the basal layer of epidermis promotes survival, proliferation, differentiation and migration of melanocyte precursors. Development. 125, 2915-2923 (1998).
- Vanover, J. C., et al. Stem cell factor rescues tyrosinase expression and pigmentation in discreet anatomic locations in albino mice. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 827-838 (2009).
- Spry, M. L., et al. Prolonged treatment of fair-skinned mice with topical forskolin causes persistent tanning and UV protection. Pigment Cell Melanoma Res. 22, 219-229 (2009).
- Takayama, H., La Rochelle, W. J., Anver, M., Bockman, D. E., Merlino, G. Scatter factor/hepatocyte growth factor as a regulator of skeletal muscle and neural crest development. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 5866-5871 (1996).
- Kunisada, T., et al. Murine cutaneous mastocytosis and epidermal melanocytosis induced by keratinocyte expression of transgenic stem cell factor. J. Exp. Med. , 187-1565 (1998).
- Takeuchi, T., Kobunai, T., Yamamoto, H. Genetic control of signal transduction in mouse melanocytes. J. Invest. Dermatol. 92, 239S-242S (1989).
- Ozeki, H., Ito, S., Wakamatsu, K., Hirobe, T. Chemical characterization of hair melanins in various coat-color mutants of mice. J. Invest. Dermatol. 105, 361-366 (1995).
- Lamoreux, M. L., Wakamatsu, K., Ito, S. Interaction of major coat color gene functions in mice as studied by chemical analysis of eumelanin and pheomelanin. Pigment Cell Res. 14, 23-31 (2001).
- Barbini, P., et al. Instrumental measurement of skin colour and skin type as risk factors for melanoma: a statistical classification procedure. Melanoma Res. 8, 439-447 (1998).
- Takiwaki, H. Measurement of skin color: practical application and theoretical considerations. J. Med. Invest. 44, 121-126 (1998).
- Anderson, R. R., Parrish, J. A. The optics of human skin. J. Invest. Dermatol. 77, 13-19 (1981).
- Rubegni, P., et al. Relationship between skin color and sun exposure history: a statistical classification approach. Photochem. Photobiol. 65, 347-351 (1997).
- Chen, J., Hammell, D. C., Spry, M., D'Orazio, J. A., Stinchcomb, A. L. In vitro skin diffusion study of pure forskolin versus a forskolin-containing Plectranthus barbatus root extract. J. Nat. Prod. 72, 769-771 (2009).
