用改进的袖套法小鼠颈部心脏移植模型

Summary

鼠异位心脏移植模型非常适合于免疫学以及缺血再灌注损伤的研究。我们使用非缝合袖口技术改性的方法，用这种方法进行的1000多个成功的移植。

在此，我们提供这种技术，以补充视频的额外细节。

Abstract

小鼠模型是因为各种各样的单克隆抗体的研究特别感兴趣，并规定商业自交系和基因敲除菌株可以在体内研究进行机械。虽然首次研制成功的心脏移植模型使用缝合技术，翻译成同样广泛使用的小鼠等同由于显微操作的技术复杂性是从来没有实现。与此相反，非缝合袖口技术，还大鼠开发起初，成功地适合于在小鼠^1-3使用。这种技术血运重建包括两个主要步骤一）外翻收件人器中的聚乙烯袖口;二）拉在原外翻受区血管的供体船，并与圆周领带拿着到位。这确保了内皮细胞层，手术时间短和非常高的通畅率⁴的连续性。

T“>使用这种技术的血管吻合我们进行了1000余异位心脏移植手术有95％的成功率。动脉流入颈总动脉和近端主动脉弓进行吻合导致移植心脏的逆行灌注。用于静脉引流的接枝的肺动脉吻合与接受者⁵的外颈静脉。

在此，我们提供这种技术，以补充视频的额外细节。

Introduction

心脏移植代表的首选治疗患者不同的终末期心脏疾病的人。在外科手术技术，感染的更有效的预防，以及新颖的免疫抑制方案的进步导致器官移植⁶的显着改善的结果。然而，移植物长期存活并没有严格的改进，在过去几年^7。慢性排斥反应，其特征在于，移植动脉硬化仍然是一个主要障碍移植物长期存活^8-11。

异位心脏移植小鼠模型提供了免疫机制急性分析过程中一个重要而有效的工具，以及慢性排斥^12-15。

到目前为止，最常见的移植模型仍然使用缝合技术腹部小鼠心脏移植。供体心脏的升主动脉的吻合了Abdominal主动脉与肺动脉吻合收件人的下腔静脉。多的缝合模式的显微难度是基于血管，这是缝合^16,17的小尺寸。

与此相反的缝合模型的心脏被放置在外部颈静脉吻合肺动脉和普通颈动脉供体的主动脉接受者的颈部区域。

颈部心脏移植模型采用套管法的发展的理论基础是有一个动物模型，这使得实现高成功率基本显微外科技能，使这种模式的广泛应用。该方法的主要优点是显著较少发生吻合时相比，缝合模型¹⁸相关的像出血和血栓形成并发症。

Protocol

动物被容纳在阻挡病原体的分类设施。所有的动物都得到人性的关怀符合“校长实验动物照护”，被国家由全国社会医学研究“和”指南编制的国家科学院实验动物“的护理和使用制定并公布卫生研究院（NIH公开号86-23，修订1985）。所有的实验都是由奥地利教育部，科学和文化的批准。

1，收件人准备

1. 麻醉受体动物与肌肉注射甲苯噻嗪（5毫克/千克体重）和氯胺酮（100毫克/公斤体重）的。
2. 取下动物的颈外侧区的所有头发，擦洗术野用chlorhexdine三次。
3. 把鼠标在术野仰卧位。
4. 接下来做一个皮肤切口从颈INC8525.10.40.00-0到右下颌骨。
5. 随后，直截了当地调动了右颈外静脉（合资企业）与结扎线划分的分支。
6. 再除以结扎并确保留出足够的长度，以外翻近端残端在袖口身体之间的合资企业。
7. 接着取出颌下腺右叶。
8. 对于静脉吻合穿过聚乙烯袖口的合资企业的近端，并修复它在用微钳压脉袋的把手。
9. 除去结扎线在容器的端部，外翻的管腔通过压脉袋，并用8-0丝环（ 图1a）固定。
10. 随后横切右胸锁乳突肌与双极烧灼来访问颈总动脉。
11. 下一动员颈总动脉和切断连字之间的容器。
12. 下一动员颈总动脉和切断连字之间的容器。
13. 通过DIS通过袖口的容器TAL结束，并修复它与动脉夹。
14. 除去结扎线在容器的端部，并使用血管扩张器扩张的管腔。接下来，在类似于实施的合资企业，外翻的动脉上的压脉袋，并用8-0丝环固定。

2，心脏采购

1. 麻醉供体小鼠的肌肉注射甲苯噻嗪（5毫克/千克体重）和氯胺酮（100毫克/公斤体重）的。然后取出动物的腹部区域的所有头发。使用chlorhexdine擦洗手术视野三次。如先前所描述的小鼠在手术视野仰卧位下位。
2. 下面正中腹部切口，收回了棉条的左侧内脏，以暴露下腔静脉（IVC）。
3. 注入400微升的1:4肝素钠溶液注入下腔静脉的肝素。
4. 在颅获得ACC进行开胸手术和折叠前胸壁ESS心脏。
5. 接着，取出胸腺和使排气中的左侧和右侧上腔静脉切口。
6. 随后，灌注心脏在逆行的方式与4摄氏度HTK在头臂分支的级解决方案的主动脉弓有27G的注射器插管。
7. 结扎劣质和上腔静脉与8-0丝绸和远端它们划分到连字。
8. 下一个分割的主动脉弓，在先前的插管的水平和解剖游离肺动脉干并把它作为远远侧越好。
9. 随后，配合肺静脉与散装结扎远端它们划分到连字。
10. 最后，从供体部位取出心脏，将其存储在4摄氏度HTK液（ 图1b）。

3，植入

1. 将心脏移植的受体颈部处于倒挂位置（ 图1c
2. 接着拉心脏的肺动脉干上收件人的静脉袖套结构和丝绸循环（ 图1d）修复它。
3. 进行接枝的主动脉和受体动物中的相同的方式（ 图1e）的外翻动脉之间的吻合。
4. 接着，除去静脉夹紧第一，其次是动脉夹。心脏的再灌注，并开始在1-2分钟跳动。再灌注期间，用温水（35摄氏度），生理盐水滋润的心脏。
5. 最后关闭手术伤口用6-0连续缝线（ 图1E）。

4，术后护理，端点

1. 放弃0.3 ml生理盐水IP术后补液。
2. 将加热灯下的动物，直到从麻醉中醒来。
3. 一旦醒来，回到动物的地方，他们获得食物和水随意的住房设施。
4. 为了弥在第7天术后nimize疼痛管理卡洛芬（4毫克/公斤，每12小时皮下（SC），此外，在手术后右给Buprenorphin（0.1毫克/千克），每12小时5天。
5. 获得每个收件人的动物每周的重量（克），以评估适当的营养摄入。如果有超过10-15％的重量损失的证据相比，体重在手术至今，冷漠，致残或非常弯曲背部，使用终端异氟醚吸入达到临床终点前牺牲的动物。也牺牲动物后，心脏已被拒绝。

Representative Results

图2示出了从BALB / c小鼠供体移植心脏移植后的存活代表数据转换成完全MHC错配的C57BL / 6的收件人。心中都拒绝在移植后7±1天。移植的同种异体移植物的手指触诊是一个敏感的方法来检测移植排斥反应的时间依赖性过程。在我们的系列中执行的所有同种心脏移植存活下去（> 150天）。

图1：术中照片收件人制备过程中（a）执行现场（二）采购后，心脏移植术（三）心脏移植物放置在收件人颈部处于倒挂位置（D + E）之前的供区。。植入。（六）示意图病ustrating收件人容器中，供体容器中，压脉袋

图2：心脏移植存活 。采用Kaplan-Meier曲线嫁接到完全不匹配MHC-BL6收件人后，显示来自BALB / c小鼠心脏移植存活（N = 7;平均生存时间为7天），以及一个同基因对照组（n = 7，移植物存活率> 150天）。排斥的天被定义为停止心脏跳动的日子。

Discussion

血管移植物排斥反应蕴涵A过多的只能用体外模型无法充分评估不同的步骤。像收件人的敏化作用，抗原加工在次级淋巴器官，而且免疫感受态细胞的分化和增殖的现象是较好表征的体内 。动物模型，从而为翻译研究¹⁶的理想工具。小鼠模型仍然代表了基本的移植和免疫学研究的黄金标准，因为各种转基因和基因敲除小鼠是可用的，并且有大量的免疫和诊断工具已经开发专门用于小鼠^18。小鼠异位心脏移植模型提供了一个独特的工具来解决问题，并进行相关的缺血再灌注损伤，免疫抑制，急性和慢性排斥反应和耐受诱导^{1-3，17，22}机理研究。

由Corry 等人于1973年¹⁹首次被描述的鼠标腹部心脏移植模型使用缝合技术。与小血管吻合suture-相关技术的挑战，但是，限制了它的广泛使用。

1991年，松浦晃一郎等人利用小鼠¹⁶非缝合袖口技术引进颈部心脏移植模型。自其引入由Zimmerman 等人 ，和镰和卡恩“的袖口技术”已被用于微血管吻合在器官移植^20-22几种不同小鼠模型。

我们已经开发了血运重建修改的非缝合袖口技术，并已完成了过去几年超过1000个成功的移植手术，成功率> 95％。几种不同菌株的组合和治疗方法中使用。应用该技术描述了他重，总操作时间可缩短到约45分钟。重要的是，总缺血时间可以保持在20分钟以小于7分钟，而相比之下，通常超过15分钟，使用缝合技术²³时注入的时间。用鼠标腹部心脏移植模型相比，颈部心脏移植具有若干优点，如轻微术后应激和高手术的成功率。该心脏移植的跳动可以很容易地由于位置表浅监控。缝合吻合，包括出血和血栓形成的并发症是显著不太常见的用套管法¹⁸时。

提出了组导致改进的成功率，并显着减少的操作时间这一技术的以下修改：

• 通过主动脉弓用3ml HTK液使用逆行灌注。
• 使用HTK溶胶保持心脏湿润整个收获过程中ution。
• 不要解剖和选择性结扎左上腔静脉。
• 使用微夹钳以阻塞血管，但是，重要的是，还以固定的袖口。
• 使用血管扩张器与超微提示，扩张颈动脉，这使得它更容易外翻船只在袖口。
• 不要将持有松浦等人的缝线作为原。
• 对于动脉吻合用压脉袋具有0.5mm内径和0.63毫米的外径，用于静脉吻合术的袖带0.75毫米内径和0.94毫米的外径。
• 用袖口为2毫米，包括1毫米手柄供应到其应有固定的容器中，用血管钳的长度。

这种方法可能具有一个限制是，它可能难以得到适当的袖口。因此，我们使用的市售p-olyethylene袖口从Rivertech医疗（查塔努加，田纳西州）。

在手术过程中的主要故障排除如下。

血流障碍：同花顺的捐赠心脏，直到颜色变成白色。同花顺没有太多的压力，因为压力过大损害了移植。

• 难度外翻船只在袖口：确定该船只有足够的长度，（二）无附着的脂肪和结缔组织及（c）确保船舶的一致好评扩张，使用血管扩张器（A）。
• 出血的吻合部位：用棉签将压力施加在受影响的部位约5分钟。
• 静脉血液回流受阻：在袖口位置的过程主要是由颈静脉扭转。在静脉部位取下袖口把手。
• 嫁接扭曲和绞窄：确保移植物被正确放置在供体侧前皮肤缝合。

的体内研究。我们的修改方法允许实现高成功率基本显微外科技能，使这种模式的广泛应用。这部影片的目的是帮助和指导其他研究建立模型在他们的实验室。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yasargil Clip Mini Permanent 7 mm	Aesculap	FE720K
Micro vessel clip	S & T	B1 00396 V
Microscissor	FST	14075-11
Vesseldilatator	S & T	D-5a.2 00125
Microforceps	FST	Dumont 11271- 30
Clipapplicator	S & T	CAF-4 00072
Microvessel clip	S & T	B1 00396 V