עכברי צוואר הרחם לב השתלת דגם שימוש בטכניקת חפתים השתנה

Summary

מודל השתלת לב בצוואר הרחם העכברי הוא גם מתאים חיסוני, כמו גם מחקרי פציעת reperfusion איסכמיה. שינינו את התהליך תוך שימוש בטכניקת שרוול שאינו תפר וביצעו יותר מ 1,000 השתלות מוצלחות עם גישה זו.

במסמך זה, אנו מספקים פרטים נוספים בטכניקה זו כדי להשלים את הווידאו.

Abstract

מודלים של עכברים הם בעלי עניין מיוחד במחקר מאז מגוון רחב של נוגדנים חד שבטיים ומוגדרים באופן מסחרי טהור וזני נוקאאוט זמינים לביצוע מכניסטית במחקרי vivo. בעוד מודלים השתלת לב תוך שימוש בטכניקת תפר היו ראשון שפותחו בהצלחה בחולדות, התרגום למקבילה עכברית משומשת באותה מידה נרחבת מעולם לא הושגה בשל המורכבות הטכנית של הליך מייקרו. בניגוד לכך, טכניקות שרוול שאינו תפר, גם פיתחו בתחילה בחולדות, הותאמו בהצלחה לשימוש בעכברי ^1-3. טכניקה זו לrevascularization כוללת שני גדולים צעדי I) everting כלי המקבל על שרוול פוליאתילן; II) מושך את כלי התורם להשתלט על כלי שיט נמען everted לשעבר ומחזיק אותו במקום עם עניבה היקפית. זה מבטיח המשכיות של שכבת האנדותל, זמן פעולה קצר ושיעורי patency גבוהים מאוד ^4.

t "> שימוש בטכניקה זו להשקת כלי דם שבצעו יותר מ 1,000 השתלות לב בצוואר הרחם עם שיעור הצלחה כולל של 95%. לעורקי זרימה בעורק התרדמה המשותף וקשת אב העורקים הפרוקסימלי היו anastomosed וכתוצאה מכך זלוף מדרדר של הלב המושתל. לניקוז ורידי עורק הריאה של השתל היה anastomosed עם וריד הצוואר החיצוני של הנמען ^5.

במסמך זה, אנו מספקים פרטים נוספים בטכניקה זו כדי להשלים את הווידאו.

Introduction

השתלת לב מייצגת את טיפול בחירה בחולים הסובלים ממחלות לב בשלב סופי שונות. התקדמות בטכניקות כירורגיות, טיפול מונע יעיל יותר של זיהומים, ומשטרי דיכוי המערכת החיסונית רומן הביאה תוצאה בשיפור ניכרת של השתלת איברי ^6. עם זאת, הישרדות שתל לטווח ארוך לא השתפרה בקפדנות בשנים האחרונות ^7. הדחייה כרונית, מאופיינת בטרשת עורקת השתלה ממשיכה להיות מכשול עיקרי להישרדות שתל לטווח ארוך ^8-11.

המודל של השתלת לב heterotopic בעכברים מספק כלי חשוב ותקף לניתוח של מנגנון חיסוני במהלך אקוטי כמו גם דחייה כרונית ^12-15.

נכון להיום מודל ההשתלה השכיח ביותר היא עדיין השתלת לב עכבר הבטן תוך שימוש בטכניקת התפר. אב העורקים העולה של לב תורם anastomosed לאב העורקים bdominal ועורק הריאה הוא anastomosed לווריד הנבוב הנחות של הנמען. חלק ניכר מהקושי מייקרו של מודל התפר מבוסס על גודלו הקטן של כלי השיט, אשר נתפרו ^16,17.

בניגוד למודל תפר הלב ממוקם באזור הצוואר של הנמען בי וריד הצוואר החיצוני anastomosed לעורק הריאה ועורק תרדמה המשותף אב העורקים של התורם.

הרציונל של פיתוח מודל השתלת לב בצוואר הרחם תוך שימוש בטכניקת השרוול היה לי מודל חיה, אשר מאפשר השגת אחוזי הצלחה גבוהה עם מיומנויות מייקרו בסיסיות שתאפשר יישום רחב של מודל זה. היתרונות העיקריים של שיטה זו הם ההשקה מתרחשת באופן משמעותי פחות קשורות לסיבוכים כמו דימומים ופקקת בהשוואה למודל התפר ^18.

Protocol

בעלי חיים הם שוכנו במתקן הפתוגן ללא מחסום. כל בעלי החיים לקבל טיפול אנושי בקנה אחד עם "המנהלים של מעבדה טיפול בבעלי חיים", שגובשו על ידי האגודה הלאומית למחקר רפואי "ואת" המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה "שהוכנו על ידי האקדמיה הלאומית למדעים ופורסמו על ידי הלאומי מכוני בריאות (NIH הפרסום לא. 86-23, מתוקנים 1985). כל הניסויים אושרו על ידי המשרד האוסטרי של חינוך, מדע ותרבות.

.1 נמען הכנה

1. להרדים את החיה הנמען עם הזרקת im של xylazine (5 מ"ג / קילוגרם משקל גוף) וקטמין (100 מ"ג / קילוגרם משקל גוף).
2. הסר את כל השיער באזור צוואר הרחם לרוחבו של בעל החיים ולשפשף את שדה ניתוח שלוש פעמים באמצעות chlorhexdine.
3. מניחים את העכבר בעמדת פרקדן על שדה הניתוח.
4. הבא לעשות חתך בעור מצוואר incision ללסת התחתונה הימנית התחתונה.
5. בהמשך לכך, בבוטות לגייס את הווריד הנכון החיצוני הצוואר (EJV) ולחלק את הסניפים בין חיבורי אותיות.
6. ואז לחלק את EJV בין חיבורי אותיות והקפד להשאיר מספיק אורך לאוורט הגדם הפרוקסימלי מעל גוף השרוול.
7. הבא להסיר את האונה הימנית של בלוטת submandibular.
8. להשקת הוורידים להעביר את הקצה הפרוקסימלי של EJV דרך שרוול פוליאתילן ולתקן אותה בידית של השרוול עם מהדק מיקרו.
9. הסר את הקשירה בסוף של כלי השיט, אוורט לומן על השרוול ולתקן את זה עם 8-0 משי לולאה (איור 1 א).
10. בהמשך לכך יחצה את שריר sternocleidomastoid תקין עם כויה דו קוטבית כדי לקבל גישה לעורק התרדמה המשותפת.
11. הבא לגייס את עורק תרדמה המשותף ולחתוך את הספינה בין חיבורי האותיות.
12. הבא לגייס את עורק תרדמה המשותף ולחתוך את הספינה בין חיבורי האותיות.
13. Pass דיססוף הטל של כלי דרך השרוול ולתקן אותה עם מהדק העורק.
14. הסר את הקשירה בסוף של כלי השיט ולהתנפח לומן באמצעות dilatators כלי דם. בשלב הבא, באנלוגיה לEJV, אוורט העורק מעל השרוול ולתקן את זה עם לולאת 8-0 משי.

רכש לב .2

1. להרדים את העכבר התורם עם הזרקת im של xylazine (5 מ"ג / קילוגרם משקל גוף) וקטמין (100 מ"ג / קילוגרם משקל גוף). ואז להסיר את כל השיער באזור הבטן של בעלי החיים. לשפשף שדה שלוש זמן הניתוח באמצעות chlorhexdine. המקום הבא בעכבר במצב שכיבה על המגרש האופרטיבי כפי שתואר לעיל.
2. בעקבות חתך בבטן קו האמצע, לחזור בו מהקרביים עם Q-טיפים לשמאל במטרה לחשוף את נחות הווריד הנבוב (IVC).
3. הזרק 400 μl של 1: פתרון sodium- 4 heparin- לIVC לheparinization.
4. לבצע פתיחת בית החזה ולקפל את דופן בית החזה הקדמית מעל cranially להשיג ACCESS ללב.
5. בשלב הבא, להסיר את בלוטת התימוס ולעשות אוורור חתכים בווריד הנבוב העליון ימין ועל השמאל.
6. בהמשך לכך, ינקב לבו באופן מדרדר עם 4 מעלות צלזיוס HTK פתרון על ידי cannulation של קשת אב העורקים עם מזרק G 27 ברמה של סניף brachiocephalic.
7. ולקשור את הווריד הנבוב הנחות ומעולה עם 8-0 משי ולחלק אותם distally ליגטורה.
8. הבא לחלק את קשת אב העורקים ברמה של cannulation הקודם ולנתח חופשי תא המטען ריאתי ולחלק אותו כמה שיותר רחוק distally ככל האפשר.
9. בעקבות כך, לקשור את ורידי ריאה עם קשירה בתפזורת ולחלק אותם distally ליגטורה.
10. לבסוף, להסיר את הלב מאתר התורם ולאחסן אותו ב4 מעלות צלזיוס פתרון HTK (איור 1b).

.3 השרשה

1. מניחים את שתל לב באזור צוואר נמען במורד עמדה הפוכה (איור 1 ג
2. הבא למשוך את תא המטען ריאתי של הלב על פני מבנה שרוול וריד של הנמען ולתקן את זה עם משי לולאה (1D איור).
3. לבצע ההשקה בין אב העורקים של השתל והעורק מופנה החוצה של החיה הנמען באותו אופן (איור 1e).
4. בהמשך לכך, להסיר את מהדק הוורידים ראשון, ואחריו את המהדק העורק. לב reperfused ומתחיל לפעום בתוך 1-2 דק '. במהלך reperfusion ללחלח את הלב עם מי מלח חמים (35 מעלות צלזיוס).
5. לבסוף לסגור את פצע הניתוח עם 6-0 תפרים רציפים (איור 1e).

.4 לאחר ניתוח טיפול, Endpoint

1. תן עד 0.3 מ"ל ip מלח הרגיל לאחר הניתוח להחלפת נוזל.
2. מניחים את החיה תחת מנורת חום עד שהתעורר מהרדמה.
3. ברגע ער, להחזיר את בעל החיים למתקן הדיור שבו הם מקבלים כרצונך מזון ומים.
4. לmiכאב המזער במהלך 7 הימים לאחר הניתוח הראשונים לנהל carprofen (4mg / קילוגרם כל תת עורי 12 שעות (sc). בנוסף, לתת Buprenorphin (0.1 מ"ג / קילוגרם) מייד אחרי הפעולה בכל שעה 12 במשך 5 ימים.
5. להשיג המשקל (גרם) של כל שבוע חיה נמען להעריך לצריכת תזונה נכונה. אם יש ראיות של יותר מ 10-15% ירידה במשקל בהשוואה למשקל בניתוח עדכני, אדישות, משתק או גב מאוד כפוף, להקריב החיה באמצעות שאיפת isoflurane מסוף לפני שהגיע לנקודת הסיום הקלינית. גם להקריב את החיה אחרי הלב נדחה.

Representative Results

איור 2 מראה נתוני הישרדות נציג allografts לב מתורמי BALB / ג לאחר ההשתלה לתוך C57BL / 6 המקבלים תואמים MHC באופן מלא. לבבות נדחים ביום 7 ± 1 לאחר השתלה. מישוש אצבע של השתל המושתל הוא שיטה רגישה לגילוי כמובן תלויות בזמן של דחיית שתל. כל השתלות לב syngeneic מבוצעות בסדרה שלנו שרדו ללא הגבלת זמן (> 150 ימים).

אתר התורם לפני השתלת הלב ממוקמת באזור צוואר הנמען במהופך עמדת תמונות Intraoperative (א) שדה אופרטיבי במהלך הכנת נמען (ב) שתל לב לאחר רכש (ג) (ד + ה): איור 1.... להשתלה. תרשים סכמטי חולה (ו)ustrating כלי המקבל, הכלי התורם והשרוול

איור 2: הישרדות של שתל לב. עלילת Kaplan-Meier בו מוצגות ההישרדות של שתל לב מעכברי BALB / ג לאחר השתלה למקבלי BL6 תואמים MHC- באופן מלא (n = 7; זמן ממוצע הישרדות = 7 ימים), כמו גם קבוצת ביקורת syngeneic (n = 7; הישרדות שתל > 150 ימים). היום של דחייה הוגדר כיום של הפסקת פעימות לב.

Discussion

דחייה של allografts כלי הדם כרוך שפע של צעדים שונים שניתן להעריך רק באמצעות מספיק במודלים חוץ גופית. תופעות כמו הרגישות של המקבלים, עיבוד אנטיגן באיברי הלימפה משניים אלא גם הבידול וההתפשטות של תאים חיסוניים המוסמכים הן טובים יותר מאופיינות in vivo. מודלים של בעלי החיים הם בכך הכלי האידיאלי למחקר translational ^16. מודלים של עכברים עדיין מייצגים את הסטנדרט בהשתלה בסיסית ומחקר חיסוני זהב מאז מגוון רחב של עכברים הטרנסגניים ונוקאאוט הגן זמין, ומספר גדול של כלים חיסוניים ואבחון פותחו באופן בלעדי עבור עכברים ^18. מודל השתלת לב בצוואר הרחם העכברי מציע כלי ייחודי כדי לענות על שאלות ולבצע מחקרים מכניסטית הקשורים לפציעת איסכמיה reperfusion, דיכוי חיסוני, דחייה אקוטית וכרונית ואינדוקצית סובלנות ^{1-3, 17, 22.}

מודל השתלת לב עכבר בטן תוך שימוש בטכניקת תפר תואר לראשונה על ידי אל קורי et. ב -1973 ^19. אתגרים טכניים הקשורים להשקת suture- של כלי דם קטנים, לעומת זאת, מוגבל לשימוש הנרחב שלה.

בשנת 1991, Matsuura et al. הציג מודל השתלת לב בצוואר הרחם תוך שימוש בטכניקת שרוול שאינו תפר בעכברים ^16. מאז השקתו על ידי צימרמן et al., וקמהדע וCalne "טכניקת השרוול" היה בשימוש כבר anastomoses כלי דם במספר דגמים עכבריים שונים של השתלת איברי ^20-22.

פיתחנו טכניקת שרוול שאינו תפר הותאם לrevascularization וסיימנו מעל 1,000 השתלות מוצלחות בשנים האחרונות, עם שיעורי הצלחה> 95%. כמה שילובי זן שונים ומשטרי טיפול היו בשימוש. יישום הטכניקה מתואר הואמחדש, הכולל זמן הפעולה יכול להיות מופחת ל45 כ דקות. חשוב לציין בסך הכל בפעם איסכמיה יכולה להיות כל הזמן ב20 דקות עם זמן השתלה של פחות מ -7 דקות, אשר בניגוד היא בדרך כלל יותר מ -15 דקות בעת שימוש בטכניקת התפר ^23. בהשוואה למודל השתלת לב בטן העכבר, יש השתלת לב בצוואר הרחם יש מספר יתרונות, כגון מתח לאחר ניתוח קטין ושיעור הצלחה ניתוחי גבוה. המכות של שתל הלב בקלות יכולות להיות במעקב בשל העמדה השטחית. סיבוכים הקשורים להשקת תפר, דימום כולל ופקקת באופן משמעותי פחות נפוצות בעת שימוש בטכניקת השרוול ^18.

השינויים הבאים בטכניקה זו שהוצעה על ידי הקבוצה שלנו הובילה לשיעור הצלחה משופר והפחתה דרמטית של זמן פעולה:

• השתמש זלוף מדרדר דרך קשת אב העורקים עם 3 מ"ל פתרון HTK.
• שמור את הלב לח באמצעות סול HTKution במהלך ההליך כולו הקציר.
• אל לנתח ולקשור סלקטיבית הווריד הנבוב העליון עזב.
• השתמש במהדק מיקרו כדי לחסום את כלי אבל, חשוב מכך, גם כדי לתקן את האזיקים.
• השתמש dilatators כלי דם עם טיפים איכותיים מאוד ללהתנפח עורק התרדמה המשותף שהופך את זה הרבה יותר קל לאוורט הכלי על השרוול.
• אל תניח מחזיקים תפרים כמקוריים שתוארו על ידי et Matsuura אל.
• להשקת העורקים להשתמש שרוול עם קוטר פנימי של 0.5 מ"מ וקוטר חיצוני של 0.63 מ"מ, להשקת ורידי שרוול עם קוטר פנימי של 0.75 מ"מ וקוטר חיצוני של 0.94 מ"מ.
• השתמש באזיקים עם אורך של 2 מ"מ כולל ידית 1 מ"מ המשמש לקיבועו הראוי לו לכלי השיט, תוך שימוש במהדק של כלי דם.

מגבלה אחת ששיטה זו יכולה להיות היא שזה עלול להיות קשה להשגת אזיקים מתאימים. לפיכך, אנו משמשים p זמין מסחרי אזיקי olyethylene מRivertech הרפואי (Chattanooga, TN).

ירי צרות עיקרי במהלך ההליך היה כדלקמן.

זרימת הפרעת דם: לב תורם Flush עד שהצבע הופך להיות בצבע לבן. סומק בלי יותר מדי לחץ כניזקי לחץ מופרזים השתל.

• קושי לאוורט הכלי לאורך השרוול: לוודא שהכלי הוא (א) לאורך מספיק, (ב) ללא שומן מצורף ורקמות חיבור ו( ג) לוודא כי הספינה הייתה גם נפוחה, באמצעות dilatators כלי דם.
• דימום באתר בהשקה: להשתמש Q-טיפים להפעלת לחץ באתר מושפע למשך כ 5 דקות.
• זרימת דם חסימת ורידים: נגרם בעיקר על ידי פיתול של וריד הצוואר במהלך התהליכים של מיקום שרוול. הסר את ידית השרוול באתר הוורידים.
• פיתול שתל וחנק: ודא שהשתל ממוקם כראוי בצד התורם לפני סגירת עור.

= "Jove_content"> למרות שהשתלת לב heterotopic בעכברים היא מאתגרת מבחינה טכנית, זה נשאר בתקן הזהב לכל במכניסטית מחקרים vivo הקשורים לאימונולוגיה השתלה. שינוי הגישה שלנו מאפשרת השגת אחוזי הצלחה גבוהה עם מיומנויות מייקרו בסיסיות שתאפשר יישום רחב של מודל זה. וידאו זה נועד לעזור ולהדריך את מחקרים אחרים כדי להקים את המודל במעבדות שלהם.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yasargil Clip Mini Permanent 7 mm	Aesculap	FE720K
Micro vessel clip	S & T	B1 00396 V
Microscissor	FST	14075-11
Vesseldilatator	S & T	D-5a.2 00125
Microforceps	FST	Dumont 11271- 30
Clipapplicator	S & T	CAF-4 00072
Microvessel clip	S & T	B1 00396 V